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Artigo de método

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

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DOI:

10.3791/60919

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14 de maio de 2020

 ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Neste artigo

Resumo

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Resumo

Neste artigo, damos instruções práticos para obter dados translatome de diferentes tipos de células radiculares Arabidopsis thaliana através do método de purificação de afinidade costelado (TRAP) traduzindo e preparação consecutiva de biblioteca otimizada otimizada.

Como material inicial, empregamos linhas de plantas que expressam a proteína ribossômica RPL18 com gfp de forma específica do tipo celular, utilizando promotores adequados. Antes da imunopurificação e extração de RNA, o tecido é congelado, o que preserva a integridade do tecido e permite simultaneamente a execução de estudos de séries temporais com alta resolução temporal. Notavelmente, as estruturas de parede celular permanecem intactas, o que é uma grande desvantagem em procedimentos alternativos, como abordagens baseadas em triagem celular ativadas por fluorescência que dependem de protoplasting tecidual para isolar populações celulares distintas. Além disso, nenhuma fixação tecidual é necessária como em técnicas baseadas em microdissecção de captura a laser, o que permite obter RNA de alta qualidade.

No entanto, a amostragem de subpopulações de células e apenas o RNA associado ao polisome severamente limita severamente os rendimentos de RNA. É, portanto, necessário aplicar métodos suficientemente sensíveis de preparação de bibliotecas para a aquisição bem-sucedida de dados pelo RNA-seq.

O TRAP oferece uma ferramenta ideal para a pesquisa de plantas, pois muitos processos de desenvolvimento envolvem vias de sinalização mecânica e relacionadas à parede celular. O uso de promotores para atingir populações celulares específicas está fazendo a ponte entre o nível de órgãos e células únicas que, por sua vez, sofrem de pouca resolução ou custos muito altos. Aqui, aplicamos TRAP para estudar a comunicação celular-célula na formação de raízes laterais.

Introdução

Impulsionada pela crescente aplicação de técnicas de sequenciamento de última geração, a resolução espacial na biologia do desenvolvimento poderia ser aumentada. Estudos contemporâneos visam dissecar tecidos para tipos de células especializadas, se não o nível de célulaúnica11,2,,3,4. Para isso, uma infinidade de métodos diferentes foi concebida ao longo dos últimos cinquenta anos (ver Figura 1A)5,6,,7,,688,99,10,,11,,12,,13,,14,15.

Muitas ferramentas em ciência vegetal têm sido adaptações de técnicas que foram pioneiras na pesquisa animal. Este não é o caso para o método que estamos introduzindo em detalhes aqui. Em 2005, equipado com uma forte formação em tradução de proteínas, o Laboratório Bailey-Serres começou a projetar proteínas ribossômicas para posterior purificação de afinidade16. Assim, poderiam evitar o demorado e intensivo em perfil de polisério, que se baseia na ultracentrifugação com um gradiente de sacarose e foi utilizado para avaliar ribossomos traduzidos desde a década de 196017,18. Desde então, o método foi referido como purificação de afinidade de ribossomos traláricos (TRAP)16. Após estudos bem-sucedidos de translatome em plantas, Heiman et al. adaptaram TRAP para animais19 e outros estenderam sua aplicação para leveduras20, Drosophila21, Xenopus22 e zebrafish23,24.

Embora a modificação genética do sistema modelo seja um pré-requisito para trap, que limita sua aplicação a espécies passíveis de transformação genética, pode-se simultaneamente aproveitar essa objeção para atingir subconjuntos de células que são de interesse especial e de outra forma extremamente difíceis de isolar do tecido/órgão intacto25 (por exemplo, células dendríticas altamente ramificadas em um cérebro de camundongos ou hifas fúngicas em tecido vegetal infectado). Nas plantas, todas as células são mantidas no lugar através de paredes celulares que formam a base do esqueleto hidrostático26. Para libertar uma célula vegetal dessa matriz, os cientistas cortaram fisicamente a célula de seu tecido circundante através da microdissecção de captura a laser (LCM)27 ou realizaram digestão enzimática das paredes celulares28. Entre as últimas células, os chamados protoplastos, a população de interesse é fluorescentemente rotulada e pode ser separada por meio da triagem celular ativada por fluorescência (FACS)7. O LCM geralmente requer uma amostra para ser fixada e embutida em cera, o que acaba por deteriorar a qualidade do seu RNA29. Os métodos baseados em FACS produzem RNA de alta qualidade, mas o processo de protoplasting em si introduz diferenças na expressão genética30 e tecidos com paredes de células secundárias modificadas e grossas são notoriamente difíceis de tratar. Além disso, muitos processos de desenvolvimento nas plantas são assumidos para contar com sinais mecanicamente transmitidos e, portanto, a integridade da parede celular é de suma importância31. Dois métodos, que utilizam um atalho para contornar o isolamento celular operando no nível de núcleos, são a triagem nuclear ativada por fluorescência (FANS) e o isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas (INTACT). Como no TRAP, eles usam promotores específicos do tipo celular para marcar núcleos, que posteriormente são enriquecidos através da classificação ou puxar para baixo, respectivamente8,15. Um grande desafio para todas essas abordagens é obter material de RNA suficiente de subconjuntos de células em um tecido. Como o TRAP captura apenas uma fração dos RNAs celulares, a coleta de amostras é um gargalo considerável. Portanto, protocolos especialmente sensíveis de preparação de bibliotecas são necessários para produzir dados de alta qualidade a partir de baixas quantidades de entrada.

Desde a sua criação, o TRAP tem sido usado em combinação com micromatrizes de DNA ou, como os custos de sequenciamento caíram significativamente nos últimos anos, RNA-seq10,32,33. Uma infinidade de questões de pesquisa já foi elucidada como revisada em Sablok et al.34. Estamos convencidos de que mais relatórios serão seguidos nos próximos anos, pois a técnica é muito versátil ao combinar diferentes promotores para atingir tipos específicos de células. Eventualmente, isso será feito mesmo de forma indutível, e pode ser combinado com a sondagem da reação da planta a muitos fatores de estresse bióticos e abióticos. Além disso, quando linhas transgênicas estáveis não estão disponíveis, sistemas de expressão raiz peluda também têm sido usados com sucesso para realizar TRAP em tomate e medicago35,36.

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Figura 1: Traduzir purificação de afinidade de ribossomos (TRAP) complementa o portfólio de análise "ômica". A. O aumento dos níveis de precisão analítica, até a resolução unicelular ou mesmo subcelular, pode ser alcançado por uma infinidade de métodos ou combinações. O esquema dá uma visão geral das ferramentas disponíveis atualmente no campo vegetal e animal. A coleta de tecidos na resolução celular pode ser alcançada por protocolos como LCM ou FACS, que são então acoplados à transcrição padrão ou análise de perfil/tradução polisome. TRAP e INTACT integram tanto a captura de tecido quanto o isolamento do RNA, pois são baseados na marcação de epítopos. No entanto, intacto amostra apenas núcleos celulares e constitui, portanto, um caso especial de análise de transcriptome. Um pequeno ícone de coelho marca métodos recém-desenvolvidos no campo animal: Enquanto SLAM-ITseq e Flura-seq dependem da segmentação metabólica de RNAs nascentes com bases uracil modificadas em células que expressam a enzima permissiva, Slide-seq faz uso de um slide de vidro revestido com códigos de barras de DNA que fornecem informações posicionais na faixa celular. Uma abordagem de rotulagem de proximidade é seguida em APEX-seq para amostrar RNAs em compartimentos subcelulares específicos. Notavelmente, o aumento da resolução muitas vezes requer a geração de material transgênico (asteriscos) e esses métodos são, portanto, predominantemente utilizados para espécies modelo. Trap é especialmente adequado para estudos de ciência vegetal envolvendo parede celular (CW) ou sinalização mecânica, bem como espécies celulares que são difíceis de liberar de sua matriz CW. B. Etapas detalhadas do laboratório molhado do procedimento TRAP: As mudas que expressam proteína ribossômica marcada por GFP em tipos de células distintas (por exemplo, endoderme raiz) são cultivadas em placas de Petri por sete dias e o material raiz colhido pelo congelamento instantâneo. Uma amostra total de controle de RNA é coletada do extrato bruto homogeneizado antes de pelleting os detritos via centrifugação. Contas anti-GFP magnéticas são adicionadas ao extrato limpo para realizar a imunoprecipitação. Após a incubação e três etapas de lavagem, o RNA associado ao pórnio (Trap/Polysome RNA) é obtido diretamente através da extração de fenol-clorofórmio. LCM: microdissecção de captura a laser, FACS/FANS: célula ativada por fluorescência/classificação nuclear, APEX-seq: método baseado na engenharia de ascorbate peroxidase, INTACT: isolamento de núcleos marcados em tipos de células específicas, SLAM-ITseq: alquilação vinculada ao thiol(SH) para o sequenciamento metabólico de RNA no tecido, Flura-seq: sequenciamento de RNA com rótulo fluorouracil (Criado com Biorender.com) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do método TRAP, destacar passos críticos e fornecer orientação para um possível método de preparação da biblioteca.

Um experimento trap genérico consistirá essencialmente nas seguintes etapas (ver também Figura 1B): (1) Preparação de material vegetal incluindo clonagem de construção de marcação de ribossomos, produção e seleção de linhas transgênicas, crescimento e acúmulo de sementes, esterilização e revestimento, e aplicação/tratamento de estresse (opcional) e colheita de tecidos; (2) imunopurificação, incluindo homogeneização tecidual e limpeza do extrato bruto, lavagem de abelhas e imunopurificação, e etapas de lavagem; (3) Extração de RNA e avaliação da qualidade; e (4) preparação da biblioteca.

A raiz arabidopsis tem sido um sistema modelo para estudar o desenvolvimento de plantas desde sua introdução como uma planta modelo37,38. Aqui, a aplicação do TRAP é apresentada no contexto do desenvolvimento da raiz lateral vegetal. Nas plantas, o acúmulo de todo o sistema radicular depende da execução deste programa e, portanto, é muito importante para a sobrevivência do organismo39. Em Arabidopsis,as raízes laterais originam-se do tecido periciclo que reside ao lado dos vasos xilem e, portanto, é denominado periciclo do pólo xilem (XPP; ver Figura 2C)40. Algumas células XPP, que estão localizadas no interior da raiz, adquirem uma identidade celular fundadora e, sobre um gatilho hormonal local, começam a se proliferar por inchaço e divisão anticlinalmente41. No entanto, devido à presença de uma matriz de parede celular rígida, este processo exerce estresse mecânico nos tecidos circundantes. Em particular, a endoderme sobreposta é afetada, pois está no caminho do eixo de crescimento da raiz lateral42,43,44. De fato, o primordium recém-formado terá que crescer através da célula endoderme sobreposta (Figura 2C2), enquanto as células córtex e epiderme são apenas deixadas de lado para que o primordium finalmente emerja45,46. Trabalhos recentes em nosso laboratório mostraram que a endoderme está contribuindo ativamente para acomodar a proliferação no periciclo. O bloqueio direcionado da sinalização hormonal endodérmica é suficiente para inibir até mesmo a primeira divisão nas células XPP47. Assim, a comunicação periciclo-endoderme constitui um ponto de verificação muito cedo para o desenvolvimento da raiz lateral na Arabidopsis. No entanto, não se sabe como esse crosstalk é realizado. Para desvendar esse mistério, escolhemos a abordagem TRAP-seq para atingir células XPP e endodérmicas. Para enriquecer para as células no programa raiz lateral, imitamos o gatilho hormonal aplicando exogenously um análogo auxina (1-ácido naftalinacático, NAA)48, que ao mesmo tempo permitiu resolver temporalmente a fase inicial da formação da raiz lateral.

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Protocolo

1. Clonagem de transgene, produção e seleção de linhas transgênicas

  1. Clone o promotor de escolha no vetor de entrada apropriado. Use um método de clonagem baseado em recombinação(Tabela de Materiais)e recombine os promotores em pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (com etiqueta de afinidade ou proteína fluorescente de escolha) usando clonagem baseada em recombinação em pDONRP1-P249.
  2. Combine o vetor de entrada contendo RPL18 com o vetor de entrada contendo promotor em uma reação de recombinação de dois fragmentos no vetor de destino apropriado com o de seleção fast-red50 para facilitar a seleção direta de sementes transgênicas.
  3. Verifique o vetor recombinado sequenciando e transforme-o em agrobactérias adequadas e competentes. Molho de flores Plantas arabidopsis e após 3-4 semanas de colheita e selecione sementes T151.
  4. Use microscopia para identificar linhas bem expressas e verificar padrões de expressão de acordo com a atividade do promotor relatado em várias linhas independentes. Selecione linhas mostrando um padrão de expressão representativo com uma única inserção de T-DNA. Isso pode ajudar a minimizar o silenciamento e será vantajoso para as cruzes genéticas.
  5. Selecione a prole T3 que é homozigosa para o gene marcador.

2. Propagação e esterilização

  1. O TRAP específico do tipo de célula isola o RNA de um número limitado de células-alvo por raiz. Para gerar o material inicial necessário, propague linhas homozigosas. Para isso, utilize condições padrão de crescimento com foco especial no controle do crescimento fúngico.
    NOTA: Se as linhas de inserção únicas não puderem ser obtidas, cresça lotes em grandes populações ao longo de poucas gerações para evitar o silenciamento transgeracional induzido pelo T-DNA.
  2. Esterilizar grandes quantidades de sementes de Arabidopsis com uma rodada de gás cloro e uma rodada de 70% de EtOH.
    1. Espalhe as sementes uniformemente em placas de Petri quadradas de 12 cm x 12 cm (menos de 0,3 mL de sementes/placa) e empilhe-as em um dessecador ou outro recipiente adequado. Evite a formação de aglomerados ou pilhas, pois as sementes precisam ser acessíveis ao gás. Realizar esterilização a gás durante a noite com alvejante e volumes de HCl como relatado52: 100 mL de alvejante (13%) com 6 mL de conc. HCl em um dessecador de 60 L. Defumigate por pelo menos 1 h antes de coletar as sementes em um recipiente estéril.
      ATENÇÃO: 37% o HCl é altamente corrosivo e requer um manuseio cuidadoso. Gás cloro é tóxico, use uma capa de fumaça.
    2. Tome 0,1 mL de sementes secas e esterilizadas a gás por placa e misture-as com solução de esterilização (70% EtOH, 0,01% Tween) à temperatura ambiente. Incubar por 20 min, decante EtOH e lave as sementes 3-4 vezes com H2O estéril.
    3. Transfira as sementes encharcadas em tubos de 50 mL e diluir com ágar estéril de 0,1% para obter 1 mL de pasta de sementes absorvidas por placa (0,1 mL de semente/1 mL).
      NOTA: Devido a eventos de integração transgênica, as linhas das plantas podem ser suscetíveis a diferentes técnicas de esterilização; especialmente o tempo de incubação do EtOH foi considerado crítico. Em nossas mãos, as etapas duplas de esterilização foram necessárias para evitar a contaminação fúngica durante os experimentos. Isso é especialmente importante ao realizar séries temporsemifinaiss, pois a contaminação de um único ponto de tempo dificulta todo o experimento. Pode muito bem ser que a esterilização dupla nem sempre é necessária, dependendo das condições locais de crescimento.

3. Chapeamento

  1. Prepare essas etapas com antecedência. Despeje 1/2 placas de MS (pH 5.8) com 1% de ágar nas quantidades necessárias para o experimento (20-30 por amostra/ponto de tempo). Corte 1 pontas de pipeta de 1 mL para aumentar o diâmetro da ponta para cerca de 3-4 mm com uma lâmina de barbear. Autoclave as pontas. Crie um suporte de modelo para emplacar três linhas de sementes por placa com tampas quadradas da placa de Petri. Prepare uma capa de fluxo laminar para fornecer um ambiente de trabalho estéril e rotular as placas a serem processadas.
    NOTA: Se muitas placas forem processadas ao mesmo tempo, as etiquetas coloridas podem acelerar a rotulagem.
  2. Coloque as placas de ágar vazias no suporte do modelo e distribua 1 mL de sementes embebedantes uniformemente em três linhas. Coloque as placas processadas em pilhas no fluxo laminar até que as sementes estejam secas (ou seja, grude na superfície do ágar). Não deixe as placas por mais tempo, pois o ágar secará também.
  3. Uma vez que as sementes estejam suficientemente secas, feche as tampas e sele cada placa com fita microporosa. Estrate as sementes por dois dias a 4 °C no escuro e depois coloque-as em uma câmara de crescimento.

4. Tratamento tecidual (opcional)

NOTA: Neste protocolo, delineamos o tratamento exógeno das raízes arabidopsis com a variante auxin sintética NAA. Dependendo da questão experimental em questão, esta parte precisa ser ajustada ou pode ser totalmente omitida.

  1. Preparar tiras de papel de tecido de 1,5 - 2 cm de altura e 10 cm de comprimento. Tempos de incubação prolongados exigem que o tecido seja autoclavdo antes do uso.
  2. Remova a fita de microporos de todas as placas que têm que passar pelo tratamento hormonal. Diluir 1 mL de 10 mM NAA (dissolvido em DMSO) em 1 L de solução líquida, autoclaved 1/2 MS (pH 5.8) e absorver o papel de tecido na solução (10 μM NAA).
  3. Use uma pinça para aplicar uma tira de papel de tecido em cada linha de raízes. Use suavemente os dedos para remover bolhas de ar. Esvazie o excesso de líquido da placa, feche a tampa e rotule a placa com o tempo. Para tempos de incubação prolongados, coloque as placas de volta na câmara de crescimento.

5. Colheita

  1. Recupere as placas para cada réplica biológica/ponto de tempo/tratamento. Coletar nitrogênio líquido em um vaso Dewar limpo e tubos de etiqueta (15 ou 50 mL) para as diferentes amostras de tecido. Prepare um suporte de isopor.
    ATENÇÃO: Familiarize-se com os procedimentos de manuseio de nitrogênio líquido (aeração, queimaduras de gelo, tubos potencialmente explosivos).
  2. Abra a placa e remova o papel de tecido com fórceps, tomando cuidado para não separar as raízes da superfície do ágar. Com uma lâmina cirúrgica, corte uma vez por fileira ao longo da junção de raiz de tiro em um único e determinado golpe. Limpe as lâminas entre as amostras e troque com freqüência para garantir a nitidez.
  3. Com pinças, deslize ao longo das raízes de cada linha para recolhê-las em três pacotes. Pegue as raízes e esvazie-as em um tubo de 50 mL cheio de nitrogênio líquido para quebrar o congelamento.
    NOTA: Não tente montar raízes em estruturas densas (como bolas), pois são difíceis de moer na próxima etapa.
  4. Proceda com todas as placas que constituem uma amostra (na ordem dos tempos de incubação) e despeje o excesso de nitrogênio líquido. Use a tampa do tubo para evitar que as raízes derramem. Em seguida, feche a tampa e colete todos os tubos no navio Dewar. Armazene o tecido radicular a -80 °C.

6. Imunopurificação

NOTA: Esta etapa visa obter RNA TRAP/polisome de alta qualidade. Portanto, siga rigorosamente os conselhos de boas práticas para o manuseio de RNA. Realize todas as etapas desta seção em um banco estéril e limpe todos os equipamentos e labware com uma solução de remoção de RNase (Tabela de Materiais). Use luvas e troque-as imediatamente quando contaminadas com amostra, gelo ou outras fontes que não tenham sido limpas. Por se trata de um aspecto muito crucial, está incluída uma seção sobre o reaproveitamento de equipamentos, juntamente com a orientação sobre o descarte de resíduos.

  1. Preparação de buffer
    1. Preparar soluções de estoque de acordo com a Tabela 1 e autoclave (A) ou esterilização do filtro ().) Salvo especificação em contrário, o solvente é água livre de RNase.
    2. Dissolver e alíquotadititol (DTT), fluoreto de fenilmetilesulfonnil (PMSF), cicloheximida (CHX) e cloro-esfenicol (CAM) em seus respectivos solventes conforme indicado na Tabela 1 e armazená-los a -20 °C. Todos os outros estoques podem permanecer à temperatura ambiente.
    3. Pré-misture os estoques - com os ingredientes 1-4 para tampão de lavagem (WB) e 1-6 para tampão de extração de pórtico (PEB) - para evitar a mistura de tampão demorada antes de cada extração. Assim, adicione apenas água e os ingredientes congelados (7-10) no dia da extração. Mantenha os estoques pré-misturados e a água sem RNase a 4 °C.
      NOTA: A concentração de DTT é de 1/5 da concentração relatada de Zanetti et al. 2005, pois a interação de nanobody com o GFP é sensível a altas concentrações de DTT.
IngredientesConcentração de estoqueAdicionar volume em mL para 50 mL de WB*Adicionar volume em mL para 50 mL de PEB*
1Tris, pH 9Um2 M55
2KclUm2 M55
3EGTAUm0,5 M2.52.5
4MGCl2 Um1 M1.751.75
5PteUm20% (v/v)02.5
6mistura de detergenteUm02.5
Tween 2020% (v/v)
Triton-X 10020% (v/v)
Brij-3520% (c/v)
Igepal20% (v/v)
7Tdt₳0,5 M0.10.1
8PMSF₳0,1 M (isopropanol)0.50.5
9Cicloheximida₳25 mg/mL (EtOH)0.10.1
10Cloranfenicol₳50 mg/mL (EtOH)0.050.05

Tabela 1: Composição de buffer e conselhos de mistura. Ingredientes com as concentrações de estoque dadas misturadas nos valores dado rendem 50 mL de WB ou PEB. Tris: tris-(hydroxymethyl)-aminometano, EGTA: etileno glicol-bis(β-aminoethyl éter)-N,N,N',N'-tetra-acético ácido, PTE: Polioxietileno-(10)-tridecil éter, A: autoclave, *encha até 50 mL com água sem RNase.

  1. Homogeneização/moagem de tecidos
    1. Esfrie a centrífuga e coloque homogeneizadores e tubos de centrífuga no gelo. Descongele as alíquotas de DTT, PMSF, CHX e CAM. Misture PEB e WB das soluções de estoque em tubos de 50 mL de acordo com as exigências do dia (# de amostras) e esfrie no gelo.
      NOTA: Adicione PMSF pouco antes do uso, pois a meia-vida do PMSF na água é de apenas 30 min.
    2. Prepare bastante nitrogênio líquido em um vaso Dewar e recupere amostras de tecido de -80 °C de armazenamento. Use luvas de algodão sob as luvas de laboratório padrão para evitar queimaduras de morteiros frios. Despeje nitrogênio líquido em argamassas e pilões até que estejam frios o suficiente para permitir a moagem. Recomenda-se criar um sistema para distinguir argamassas (etiqueta ou manter em uma determinada ordem).
    3. Amostra de tecido vazio em uma argamassa e moer cuidadosamente até que todo o material seja um pó branco. Se necessário, adicione nitrogênio líquido para manter o tecido congelado ou para facilitar a melhor moagem.
    4. Adicione 5 mL de PEB à amostra e misture rapidamente com o pó antes que o tampão congele. Enquanto esta amostra descongela (misture-se de tempos em tempos) processa outra amostra.
    5. Assim que a mistura puder ser transferida, esvazie o chorume em um homogeneizador de vidro e mantenha no gelo. Com um adicional de 2 mL de PEB, enxágue a argamassa e o pilão e adicione-o à amostra no homogeneizador.
      NOTA: Evite uma amostra completamente líquida, pois isso permite a degradação do RNA.
    6. Triture o chorume manualmente até que o extrato seja homogêneo. Recomendamos um mínimo de 4 a 5 mergulhos.
      NOTA: Pode exigir algum tempo adicional de espera para permitir que o chorume descongele ainda mais. O manuseio de homogeneizadores requer alguma diligência. Não aplique força bruta e cuidado com as forças de sucção. Se não for levado em conta, isso levará ao derramamento, contaminação ou destruição do homogeneizador.
    7. Despeje o extrato de raiz bruta em um tubo de centrífuga de 50 mL (mantenha no gelo).
      NOTA: Normalmente, várias amostras podem ser moídas antes da transferência. É necessária a manipulação paralela da moagem, transferência e homogeneização. Tente trabalhar rapidamente, mas não se apresse; Fique calmo. Mantenha sempre amostras homogeneizadas no gelo.
  2. Coleta total de amostras de RNA
    1. Transfira as alíquotas de 200 μL de cada amostra bruta para um tubo de microcentrífuga limpo (rotulado e resfriado no gelo de antemão).
    2. Proceda com a extração de RNA conforme detalhado para amostras TRAP nos pontos 7.1 e 7.2. Faça essas etapas enquanto as amostras estão limpando na centrífuga.
    3. Realizar um tratamento de DNase com o RNA total resuspenso para eliminar a contaminação do DNA e limpar a reação usando um kit comercial (Table of Materials).
      NOTA: Extrações totais de RNA geralmente produzem altas concentrações e as amostras precisam ser diluídas consideravelmente. Recomendamos medir a concentração após a diluição pelo protocolo sensível do Qubit.
  3. Limpando o extrato bruto
    1. Pegue o balde de gelo com amostras de 6.2.7 e centrifuga-as por 15 min a 16.000 x g e 4 °C.
      NOTA: Para equilibrar a centrífuga, pareie as amostras em conformidade. Caso isso não seja inteiramente possível, ajuste uma amostra adicionando PEB.
    2. Despeje o sobrenadante em um tubo de centrífuga fresco (resfriado no gelo antes) e repita a centrifugação (15 min a 16.000 x g e 4 °C). Esta transferência pode ser realizada rapidamente ao lado da centrífuga.
    3. Enquanto o extrato bruto estiver limpando, inicie a lavagem das contas gfp para a etapa 6.6.
      NOTA: Mantenha este balde de gelo para balançar no agitador, mas não coloque de volta no banco estéril, pois pode estar contaminado.
  4. Lavagem de abelhas
    1. Alíquota magnética GFP-beads (#samples x 60 μL, Tabela de Materiais)em um tubo de 1,5 mL. Coloque no suporte magnético. Uma vez que as contas tenham coletado, remova o sobrenadante.
    2. Adicione 1 mL de WB frio, resuspenda as contas e colete-as novamente. Descarte o tampão de lavagem e repita mais uma vez com 1 mL de WB.
    3. Em última análise, resuspenda as contas em WB para o volume inicial usado na etapa 6.5.1.
  5. Imunopurificação (IP)
    1. Imediatamente após a centrifugação, despeje o sobrenadante limpo em tubos rotulados de 15 mL e adicione 60 μL de contas lavadas por amostra.
    2. Coloque todas as amostras horizontalmente no balde de gelo e coloque-as em um shaker. Deixe a mistura incubar por 2 h para ligar os pórissomos rotulados gfp às contas.
    3. Coletar as contas no suporte magnético para tubos de 15 mL (no gelo) e adicionar PMSF ao PEB restante. Descarte o sobrenadante. Despeje aproximadamente 5 mL de PEB nas contas e resuspenda-as inclinando-as. Agite as amostras por 15 min na mesma configuração da seção 6.6.2.
    4. Repita as lavadas com WB para um total de 3 lavadas (1 x PEB, 2 x WB). Antes de cada troca de buffer, adicione PMSF.
    5. Coletar as contas em 1 mL de WB e transferi-las para um tubo de 1,5 mL. Por fim, colete as contas mais uma vez no suporte magnético e remova todo o líquido. Feche o tubo e mantenha no gelo até que todas as amostras sejam processadas.
    6. Transporte as amostras para uma capa de fumaça para extração de RNA.
  6. Descarte de resíduos e recondicionamento de materiais de laboratório.
    1. Se realizado de acordo com a boa prática laboratorial (ver seção 2.2.1), o procedimento de esterilização produz uma solução NaCl aquosa. Deixe o gás cloro, bem como o HCl residual e alvejante, para defumigar na capa de fumaça.
    2. Disposição PEB e WB: À medida que o CHX se decompõe em pH alto, colete todos os líquidos e leve para pH>9. Descarte os resíduos líquidos nos resíduos químicos halogenados. Todos os sólidos (tecidos, pipetas sorológicas, luvas, etc.) devem ser descartados como resíduos químicos.
    3. Coletar líquidos contendo fenol separadamente, bem como material contaminado com fenol (pontas, tubos e luvas).
    4. Lave à mão argamassas, pestes e homogeneizadores (esponjas e escovas) com sabão e enxágue bem. Posteriormente, asse o material a >220 °C durante a noite. Enrole em papel alumínio antes do tratamento ou coloque em um recipiente coberto à prova de calor.
    5. Escove tubos de centrífuga limpos com detergente e, em seguida, dietilpyrocarbonato (DEPC) -tratar na capa de fumaça. Para isso, adicione o LÍQUIDO DEPC à água desionizada (1 mL de DEPC a 1 L de H2O) e misture via agitação. Coloque os tubos de centrífuga em uma bandeja autoclavável que captura água DEPC derramada. Despeje a suspensão nos tubos e deixe por 3 h ou durante a noite. O DEPC se decompõe no processo de autoclação subsequente.
      ATENÇÃO: O DEPC é altamente tóxico.

7. Extração de RNA e QC

  1. Extração de RNA
    1. Esfrie a centrífuga da mesa até 4 °C.
    2. Adicione 1 mL de reagente à base de ácido-guanidínio-fenol(Tabela de Materiais)a cada amostra, inverta-se para resuspender as contas ou o chorume total de RNA e incubar por 5 min no gelo. Não vórtice!
    3. Adicione 200 μL de clorofórmio e incubar por 3 min no gelo. Em seguida, completamente vórtice as amostras.
    4. Para ajudar na separação de fase, centrífuga no máximo. velocidade para 10-15 min, 4 °C.
    5. Rotular tubos de baixa retenção de 1,5 mL(Tabela de Materiais)e alíquota 650 μL de isopropanol em cada um.
    6. Pegue cuidadosamente a fase aquosa superior (ca. 650 μL) e transfira para os tubos preparados com isopropanol. Evite tocar na fase orgânica rosa.
    7. Precipitar RNA durante a noite a -20 °C.
      NOTA: Recomenda-se armazenar as amostras em isopropanol a -20 °C ou -80 °C e apenas solubilizar em água quando necessário. O RNA aquoso degrada-se mesmo a -80 °C quando armazenado por semanas/meses.
  2. Precipitação de RNA
    1. Esfrie a centrífuga da mesa até 4 °C.
    2. Prepare 80% de EtOH fresco com água sem RNase e esfrie a -20 °C (5 min a -80 °C ajuda a acelerar o processo).
    3. Centrifugar as amostras em velocidade máxima (cerca de 13.000 x g) por 30 min e descartar o sobrenadante. A pelota não será visível, tão cuidadosamente pipeta como se estivesse lá. Adicione 1 mL de frio 80% EtOH e inverta o tubo uma ou duas vezes.
    4. Centrifugar novamente por 30 min em velocidade máxima e repetir a lavagem para um total de duas lavos.
    5. Gire para baixo por 2 min e remova todos os EtOH residuais com uma ponta de 10 μL. Deixe a pelota secar por 3-5 min (não mais) à temperatura ambiente e resuspenda em água livre de RNase de 20 μL.
    6. Mantenha as amostras no gelo e realize o controle de qualidade o mais rápido possível. Proceda para armazenar as amostras a -80 °C. Evite ciclos de congelamento.
  3. Controle de qualidade utilizando equipamento dedicado (Tabela de Materiais) de acordo com as recomendações do fabricante.

8. Preparação da biblioteca

  1. síntese de cDNA e amplificação com o Kit De RNA de Entrada Ultra Baixa SMARTer v4
    1. Calcule a diluição de cada amostra para ter 1,5 ng de TRAP-RNA ou RNA total em um volume de 4,75 μL. Realize todas as reações em tubos de PCR e diluir amostras com alíquotas frescas de água livre de RNase.
    2. Realize todas as etapas de acordo com as recomendações do fabricante com 1/2 dos volumes de reação. Amplie o cDNA com ciclos PCR de 12 a 13.
    3. Limpe o PCR adicionando 0,5 μL de tampão de lyse de 10x e 25 μL de contas SPRI(Tabela de Materiais). Se muitas amostras forem processadas, o tampão de lyse e as contas podem ser pré-misturadas. Certifique-se de que as contas estão uniformemente dispersas antes de pipetting.
    4. Proceda com o protocolo em volumes de reação completos (17 μL de tampão de elução). Não deixe as contas secarem por mais de 3 minutos. Amostras sobresecas podem ser potencialmente resgatadas por tempos prolongados de incubação.
    5. Meça as concentrações da amostra com o kit de DNA Qubit HS.
      NOTA: O kit SMARTer v4 pode tolerar até 200 pg de entrada. Obtivemos bibliotecas nos casos em que os valores de Qubit não puderam ser determinados (abaixo de 250 pg, limite de detecção) com um PCR de 16 ciclos. No entanto, o material de entrada limitado também pode render bibliotecas menos complexas.
  2. Fragmentação e ligadura do adaptador PCR com o Kit de Preparação da Biblioteca de DNA Nextera XT
    1. Diluir o cDNA com água livre de RNase para obter uma concentração de 200 pg/μl e pipeta de 1,25 μL em um tubo PCR.
    2. Realize todas as etapas de acordo com o fabricante com 1/4 dos volumes de reação. Amplie o cDNA com 12 ciclos PCR e adaptadores compatíveis para as amostras que pertencem a um pool de sequenciamento. Com os Kits de Índice de Illumina A e D até 384 amostras podem ser multiplexadas.
    3. Para a limpeza do PCR adicione 12,5 μL de tampão de resuspensão e 22,5 μL de contas SPRI (razão de 0,9x). Eluir a amostra com 22 μL de tampão de elução.
      NOTA: O QC e o agrupamento foram realizados pela empresa de sequenciamento (Tabela de Materiais) e, portanto, não foi necessária a normalização baseada em bead. A reação de fragmentação enzimática (tagmentation) é muito sensível à entrada material, pois toda enzima corta apenas uma vez. Portanto, não exceda a recomendação de concentração.

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Resultados

Para avaliação da qualidade, o procedimento acima mencionado deve ser sondado em várias etapas intermediárias: validação de padrão de expressão na planta, controle de qualidade do RNA polissômal oimosois isolado, bem como das bibliotecas finais. qRT-PCR usando genes marcadores conhecidos pode, além disso, ser realizado para confirmar a resposta à condição de tratamento ou para ajustar as condições experimentais.

Análise ...

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Discussão

Verificação do padrão de localização RPL18
Crucial para evitar má interpretação dos dados de qualquer experimento TRAP é o padrão de expressão adequado da subunidade ribossômica marcada. Portanto, a incorporação do GFP como uma tag epítopoa ao RPL18 de forma muito elegante permite a verificação do padrão de expressão desejado e, consecutivamente, a retração da fração polisome do mesmo tecido. Abordagens mais invasivas para assegurar padrões de promotores adequados são seguidas por Jiao e Mayerowitz 20...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Jean-Claude Walser, do Centro de Diversidade Genética de Zurique, por conselhos cruciais de especialistas na fase inicial deste projeto. O trabalho no laboratório Vermeer foi apoiado por uma bolsa de professor do SNF (PP00P3_157524) e uma bolsa de equipamentos R'EQUIP (316030_164086) da Fundação Nacional de Ciência suíça (SNSF) concedida ao JEMV.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Esterilização
lixívia, 13%Sigma71696
copoVWR214-1172/74/75
dessecador com placa de porcelana (DURAN)Sigma/MerckZ317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a.Honeywell02860-1L
HCl, 37%Roth4625.1
Tween 20SigmaP9416
Crescimento da placa + colheita< / sais fortes>
MS, mistura de sal basal, incl. tampão MESDuchefaM0254
planta de ágar para cultura de célulasApplichem/PanreacA2111.1000
DMSOSigmaD4540
forceptsRubis Suíça5-SA modelo
KOHFluka60370
micropore/fita cirúrgica3M1530-0
NAADuchefaN0903
placas de Petri 120x120 mmGreiner bio-onebisturi 688102
VWR/Swann-Morton233-5454
tecidos, neutros, de duas camadasqualquer fornecedor à sua escolha
Imunoprecipitação
GFP-grânulos: gtma-100 GFP-Trap_MAChromotekpor exemplo, gtma-100
Brij-35SigmaP1254-500G
tubos de centrífuga (de acordo com centrífuga)Beckman Coulter357001
ChloranfenicolApplichemC0378-25G
luvas de algodãoVWR113-7355
Cicloheximida, grau HPLCSigma01810-1G
DEPCVWRE174pode ter longos prazos de entrega
DTTFluka43815
EGTAHomogeneizadores Sigma3054.3
DUALL 23KONTES GLASS CO (via VWR)SCERSP885450-0023 (conjunto)SCERSP885451-0023 apenas pilão - apenas cilindro SCERSP885452-0023; longos prazos de entrega
Igepal CA-360SigmaI3021-100ml
KClSigma60130
MgCl2 hexahydratRoth2189.2
almofariz e pilãoVWR470148-960 & 470019-978
PMSFRoche10 837 091 001
Polioxietileno-(10)-trideciléter/PTESigmaP2393-500G
Água sem RNaseRothT143.3
RNAZapThermo FisherAM9780/AM9782para limpeza de superfícies
Tris, >99,3% RothAE15.3
Triton X-100FlukaT8787-250ml
Tween 20SigmaP9416-100ml
Extração de RNA
2-Propanol, p.a.Sigma33539-1L-GL-R
Clorofórmio, grau HPLCScharlauCL02181000
EtOH, p.a.Honeywell02860-1L
, 1,5 mlEppendorf/SigmaZ666548-250EALoBind
Conjunto DNase livre de RNaseQiagen79254
RNeasy MiniElute Cleanup KitQiagen74204
TRIzol reagenteThermoFisher/Ambion15596018
Preparação de biblioteca< / strong>
15 / 50 mL Separador Magnético de TuboAbraxisPN 472250
AMPure beadsBeckman CoulterA63881
Kit de Índice AIlluminaFC-131-2001
Kit de Índice DIlluminaFC-131-2004
ímãs de neodímioAmazon/outros6 x 1,5 mm faixa: N42 (NdFeB)
Kit Nextera XTIlluminaFC-131-1024/1096https://emea.support.illumina.com/
PCR tirasThermoScientificAB-0266
Kit SMARTer v4Takara Bioscience634892https://www.takarabio.com/
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrumentequipamento especializado para controle de qualidade de RNA/DNA
TapestationAgilent4200 TapestationInstrument equipamento especializado para controle de qualidade de RNA/DNA
Analisador de FragmentosAgilent5400 Fragment Analyzer Systemequipamento especializado para controle de qualidade de RNA/DNA (alto rendimento)
LabChipPerkinElmerLabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzerequipamento especializado para controle de qualidade de RNA/DNA (alto rendimento)
Fluorômetro Qubit 4ThermoFisherQ33239equipamento especializado para determinação da concentração de RNA/
DNAqRT-PCR
GATA23Microsynthfwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3Microsynthfwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29Microsynthfwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21Microsynthfwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR GreenBio-Rad#172-5270
iScript Adv cDNA KitBio-Rad#172-5038
diversos
Falcon tubos 15 ml, CellstarGreiner bio-one188261
Falcon tubos 50 ml, CellstarGreiner pontas de210261
1 mlAxygenTF-1000-R-S
10 µ lAxygenTF-10-R-S
100 µ lAxygenTF-100-R-S
20 µ lAxygenTF-20-R-S
200 µ lAxygenTF-200-RS
1,5 mlSARSTEDT72.690.001
Iodeto de propídioSigmaP4170-100MG
empresa de sequenciamentoNovogeneen.novogene.com
, , Tubos de microcentrífuga de baixa retenção filtro bio-one Pontas de filtro Pontas de filtro Pontas de filtro Pontas de filtro Tubos de microcentrífuga

Referências

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