Artigo de método

Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

DOI:

10.3791/60935

⸱

8 de abril de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biological Systems Analysis, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), University of Freiburg, 4BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, University of Freiburg, 5IMTEK Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 6Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.

Resumo

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Blocos de construção protecários sob medida são candidatos versáteis para a montagem de estruturas supramoleculares, como células mínimas, veículos de entrega de drogas e andaimes enzimáticos. Devido à sua biocompatibilidade e sintonia no nível genético, as proteínas semelhantes à Elastina (ELP) são blocos de construção ideais para aplicações biotecnológicas e biomédicas. No entanto, a montagem de estruturas supramoleculares baseadas em proteínas com propriedades fisioquímicas distintas e bom potencial de encapsulamento permanece desafiadora.

Aqui fornecemos dois protocolos eficientes para a auto-montagem guiada de ELPs anfífilos em arquiteturas de proteínasupramolecular, tais como coacervates esféricos, fibras e vesículas estáveis. Os protocolos de montagem apresentados geram compartimentos à base de membrana siproteica (PMBCs) baseados em ELPs com propriedades físico-químicas adaptáveis. Os PMBCs demonstram o comportamento de separação de fase e revelam a fusão de membranadependente do método e são capazes de encapsular moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas. Os PMBCs resultantes têm um alto potencial de aplicação como uma plataforma de formulação e entrega de medicamentos, células artificiais e espaço de reação compartimentado.

Introdução

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A montagem de estruturas supramoleculares para aplicações biotecnológicas está se tornando cada vez mais importante1,2,3,4,5. Para a montagem de arquiteturas funcionais como coacervates, vesículas e fibras com propriedades físico-químicas desejadas é importante entender e controlar as propriedades físico-químicas e conformacionais dos componentes. Devido à precisão molecular das moléculas encontradas na natureza, os blocos de construção para estruturas supramoleculares são cada vez mais baseados em lipídios....

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Protocolo

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1. Projeto e clonagem de proteínas anfífilas semelhantes à elastina (ELPs)

  1. Clonar e projetar as construções como descrito em outros lugares8,20. Plasmids estão disponíveis mediante solicitação.

2. Expressão proteica, purificação e preparação

  1. Expressão de F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry
    1. Inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura da noite para odia 600 de 0,3. Incubar a 37 °C, 200 rpm em meio estéril de 400 mL LB suplementado com antibióticos apropriados em um frasco de 2 L.
    2. Preparar a solução de estoque iPTG (1 M) pa....

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Resultados

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Desenvolvimento de protocolos para produção de vesículas
A Figura 1 descreve os dois métodos diferentes de preparação da vesícula. O método de inchaço THF no lado esquerdo é composto de três passos sucessivos e resulta em diferentes conjuntos supramoleculares do ELP, dependendo da temperatura. Na Figura 1A imagens de microscopia de epifluorescência mostram vesículas montadas a partir de BDP-R20F20 e estruturas fib.......

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Discussão

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Uma falha ao seguir os protocolos descritos para a montagem de estruturas supramoleculares definidas leva principalmente à formação de agregados inespecíficos(Figura 2, IV) ou a anfífilos ELP-anfifilos homogeneamente distribuídos. As etapas críticas do protocolo são discutidas abaixo:

Para o alto rendimento de expressão do ELP anfífilo, uma temperatura relativamente baixa de 20°C é ótima. Para a purificação bem-sucedida da eLP anfífila, foi comprovada a concentraç.......

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Divulgações

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Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores agradecem ao BMBF pelo apoio financeiro e ao Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) pelo fornecimento da instalação de pesquisa. Somos gratos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Califórnia, EUA por fornecer o plasmídeo pEVOL-pAzF. Agradecemos à equipe do Centro de Imagens de Vida (LIC) do Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) da Universidade Albert-Ludwigs-Universidade de Freiburg pela ajuda com seus recursos de microscopia confocal, e pelo excelente apoio na gravação de imagens.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 µ m e 0,2 µ m Filtro estérilVWR
1,4-DitiotreitolMerck
1-butanol. >99,5% a.a.Roth
2log DNA ladderNEB
2-MercaptoethanolRoth
50 mL Falcon tubesVWR
79249 Alkyne Mega Stokes coranteSigma Aldrich
Ácido acético glacialVWR
Acetonitrila, anidra, 99,8%Sigma-Aldrich
Ampicilina de sódio-sal, 99%Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
Filtro de Garrafa Superior com membrana PES (45 µ m, 22 µ m)Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Câmera DS Qi1Nikon
Centrífuga 5417rEppendorf
Centrífuga 5810rEppendorf
CF-400-grade de cobre de malha quadradaEMS
CloranfenicolRoth CompactStar
CS 4VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutroLife Technologies
Sonifier digitalBranson
Dimethylsulfoxide (DMSO)Aplicação
NEB
EcoRI-HFNEB
Incubadora de agitação ambiental ES-20Biosan
Etanol absolutoRoth
Solução de brometo de etídioRoth
Suportes de filtroAvanti
Placas de vidroBio-Rad
Glicerol Proteômica GrauAmresco
GlycinApplichem
H4-Azido-Phe-OHBachhem
Placa de aquecimento MR HeiTecHeidolph
HindIIINEB
HisTrap FF coluna brutaGE Life SciencesColuna de níquel
Cloridrato ácido fumegante, 37%, p.a. Merck
Iluminador ix 20INTAS
Iluminador LAS-4000Fujifilm
ImidazolMerck
Óleo de imersão para microscopiaMerck
Incubadoras agitadores Unimax 1010Heidolph
Inkubator 1000Heidolph
IPTG, >99%Roth
KanamycinsulfateRoth
L(+)-ArabinoseRoth
Escalas de laboratório Extend ed2202s/224s-OCESartorius
LB-MediumRoth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSCChrist
Lysozyme, 20000 U/mgMicroscópio Roth
CM 100Philips
Microscópio Eclipse TS 100Nikon
Microscopia óculos de cobertura (15 x 15 mm)VWR
MicrowaveStudio
Avanti Polar Lipids
NaCl, >99,5%, a.a.Pellets de Roth
NatriumhydroxidRoth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane Medidor deAvanti
766calimatic Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)Colunas
(1 mL)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Escada de proteína 10-250 kDaNEB
Resfriador de recirculação F12Julabo
Anéis de reforçoHerma
SacI HFNEB
SDS PelletsRoth
Sódiodi-hidrogenofosfato di-hidratado, NaH2PO4VWR
Filtro de seringa estéril 0,2 mm Acetato de celuloseVWR
T4 DNA LigaseNEB
TEMEDRoth
TexasRed Dextran-ConjugadoMolecularSondas
Thermomix confortoEppendorf
THF, >99,5% a.a.Acros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton da CaseinRoth
Produto de limpeza ultrassónicoVWR
Ureia p.a.Roth
Bomba de vácuo 2.5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
Membrana tubular de celulose regenerada ZelluTrans (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)Roth
Lâminas de microscopia Conjunto de miniextrusora VWR PH de Polipropileno Roth

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Reco....

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Elastin like ProteinsProtein AssemblyVesicle FormationFiber FormationCoacervate FormationProtein PurificationFluorescent Cargo EncapsulationDialysis MethodExtrusion TechniqueConfocal Microscopy

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