Aqui descrevemos um protocolo para imagens de células vivas do citoesqueleto de microtúbulos cortical no meristem apical de tiro e monitorando sua resposta às mudanças nas forças físicas.
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Artigo de método
Imagem celular ao vivo do citoesqueleto microtubulo e manipulação micromecânica da Arabidopsis Shoot Apical Meristem
Neste artigo
Resumo
Resumo
A compreensão da regulação do nível celular e tecidual do crescimento e da morfogênese está na vanguarda da pesquisa biológica há muitas décadas. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter insights sobre como os sinais bioquímicos influenciam eventos morfogenéticos. No entanto, é cada vez mais evidente que, além dos sinais bioquímicos, as pistas mecânicas também impactam vários aspectos do crescimento celular e tecidual. A Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) é uma estrutura em forma de cúpula responsável pela geração de todos os órgãos acima do solo. A organização do citoesqueleto de microtúbulo cortical que media a deposição de celulose apoplásica em células vegetais é espacialmente distinta. A visualização e a avaliação quantitativa dos padrões dos microtúbulos corticais são necessárias para entender a natureza biofísica das células no SAM, já que a celulose é o componente mais rígido da parede celular da planta. A forma estereotipada da organização dos microtúbulos cortical também é uma consequência das forças físicas em todo o tecido existentes no SAM. A perturbação dessas forças físicas e o monitoramento subsequente da organização de microtúbulos corticais permitem a identificação de proteínas candidatas envolvidas na mediação da mecano-percepção e transdução. Aqui descrevemos um protocolo que ajuda a investigar tais processos.
Introdução
As células vegetais são cercadas por uma matriz extracelular de polissacarídeos e glicoproteínas que se assemelha mecanicamente a um material composto reforçado com fibra capaz de mudar dinamicamente suas propriedades mecânicas1. O crescimento das células vegetais é impulsionado pela absorção de água na célula, o que resulta em um acúmulo concomitante de forças de tração na parede celular. Em resposta a tais forças, modificações no estado físico da parede celular permitem a expansão celular. As células com paredes primárias são capazes de sofrer um rápido crescimento em comparação com a parede celular secundária contendo células principalmente ....
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Protocolo
1. Crescimento das plantas
- Semear sementes arabidopsis expressando domínio de ligação de microtúbulos fundido com proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 no solo e manter-se em longo dia (16 h dia /8 h noite), 20 °C/6 °C condições para 1 semana para germinação.
- Após a germinação, transfira mudas para novos potes com espaço de crescimento suficiente para permitir um crescimento vegetativo robusto. Mantenha as plantas em dias curtos (8h dia /16h à noite), 20 °C/16 °C condições por 3-5 semanas.
- Transfira as plantas para o dia longo (16h dia /8h à noite), 20 °C/16 °C e mantenha até as plantas parafuso (2-3 sem....
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Resultados
A Figura 1 mostra imagens típicas de projeção obtidas a partir de linhas MBD-GFP com células no centro da cúpula contendo microtúbulos corticais desorganizados, e células na periferia com uma distribuição circunferencial(Figura 1A,B),enquanto as células de domínio de fronteira contêm microtúbulos corticais alinhados paralelos ao eixo longo da célula. Estas observações mostram diferenças na distribuição espacial d.......
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Discussão
A avaliação dos eventos de transdução de sinal mecânico é crucial para identificar os reguladores moleculares envolvidos nas vias de mecano-percepção e transdução. O protocolo descrito aqui fornece uma visão quantitativa de tais eventos usando a resposta de microtúbulos corticais como leitura para tal processo em SAMs Arabidopsis. O procedimento descrito aqui é utilizado rotineiramente em diversos estudos em diversos tipos de tecidos16,17,
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glicina | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 microscópio confocal | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| fita micropore | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Métodos Mol Biol. 2019 | ||
| mio-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benziladenina | Sigma | B3408 | |
| ácido nicotínico | Sigma | N4126 | |
| caixa articulada de plástico | Ciências de microscopia eletrônica | 64312 | |
| PPM (Mistura de Conservantes de Plantas) | Tecnologia de Células Vegetais | PPM | |
| Iodeto de propídio | Sigma | P4864 | |
| cloridrato de piridoxina | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| cloridrato de tiamina | Sigma | T4625 |
Referências
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology....
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Reimpressões e permissões
