Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido

Resumo

Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do procedimento para induzir biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e rastrear o fechamento de feridas em tempo real. Além disso, são fornecidos métodos para a preparação de tecidos para análises histológicas, imunohistoquímicas e moleculares do leito da ferida.

Resumo

Compreender as alterações teciduais e celulares que ocorrem na resposta de lesão aguda, bem como durante o processo de cicatrização da ferida, é de suma importância no estudo de doenças do trato gastrointestinal (GI). O modelo de biópsia de pinças coloniais murinas é uma ferramenta útil para definir esses processos. Além disso, a interação entre o conteúdo luminal intestinal (por exemplo, micróbios) e o cólon pode ser estudada. No entanto, a indução da ferida e a capacidade de rastrear o fechamento da ferida ao longo do tempo de forma confiável podem ser desafiadoras. Além disso, a preparação e orientação tecidual devem ser realizadas de forma padronizada para interrogar de forma ideal alterações histológicas e moleculares. Aqui, apresentamos um método detalhado descrevendo a lesão induzida pela biópsia e o monitoramento do fechamento da ferida através de colonoscopias repetidas. Uma abordagem é descrita que garante medições consistentes e reprodutíveis do tamanho da ferida, a capacidade de coletar o leito da ferida para análises moleculares, bem como visualizar o leito da ferida após a secção dos tecidos. A capacidade de realizar com sucesso essas técnicas permite estudos da resposta de lesão aguda, cicatrização de feridas e interações luminal-hospedeira dentro do cólon.

Introdução

O trato gastrointestinal (GI) é um sistema de órgãos complexo dadas suas múltiplas funções, tipos de células hospedeiras (por exemplo, epiteliais, imunes, estromicas, etc.) bem como trilhões de micróbios. Diante dessa complexidade, as doenças do trato de GI muitas vezes envolvem a interação de todos esses fatores. Por exemplo, as doenças inflamatórias intestinais (DII) estão associadas a ciclos de inflamação e remissão no trato GI, envolvendo a ativação de células inflamatórias, disbiose e reparação epitelial^{1,2,3,4,5,6,7}. Ter sistemas de modelos adequados para estudar o DIB e outras condições inflamatórias do trato GI é fundamental para elucidar a patogênese da doença. Existem vários modelos para estudar a patogênese do IBD, incluindo camundongos geneticamente modificados e o uso de produtos químicos como o sulfato de sódio dextran (DSS) em roedores^8,9,10. As limitações desses modelos incluem a incapacidade de controlar precisamente a indução da inflamação, bem como dificuldades na avaliação da cicatrização da ferida. Métodos alternativos para imitar aspectos da patogênese do IBD podem ser úteis para o desenvolvimento de terapias.

Biópsias de pinças orientadas colonoscópicas em camundongos oferecem um sistema modelo útil para estudar a patogênese da resposta inflamatória, a cicatrização de feridas, bem como interações hospedeira-micróbios no cólon. Esta abordagem foi usada pela primeira vez como ferramenta experimental em 2009, que demonstrou sua utilidade para estudar a resposta inflamatória aguda e a cicatrização de feridas no intestino¹¹. Estudos subsequentes utilizaram essa técnica para avaliar os papéis de diferentes vias de sinalização, bem como a microbiota intestinal, na cicatrização de feridas coloniais^{11,12,13,14,15,16,17,18}. Mais recentemente, nosso grupo usou esse modelo para investigar a importância da sinalização de sphingosine-1-fosfato e bactérias na resposta aguda à lesão cólon¹⁹. Embora útil, realizar biópsias de pinças guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliar alterações de tecido subsequentes pode ser tecnicamente desafiador. Por exemplo, a perfuração do intestino pode ocorrer após a indução de lesão e garantir medidas consistentes do leito da ferida através de colonoscopias seriais pode ser difícil. Além disso, orientar adequadamente o tecido colonial para visualizar o leito da ferida para análises histológicas ou imunohistoquímicas pode ser um desafio. Embora existam algumas informações sobre esses métodos^18,20, uma descrição precisa dessas técnicas junto promete melhorar a confiabilidade e a utilidade mais ampla deste modelo. Aqui, apresentamos um método detalhado para realizar biópsias de pinças colonoscópicas guiadas em camundongos, rastrear o fechamento de feridas ao longo do tempo e preparar o tecido para permitir análises histológicas e moleculares do leito da ferida. A criação de um método padrão para a realização dessas técnicas pode expandir o uso deste modelo para estudar mediadores não investigados anteriormente que são potencialmente importantes para inflamação gi e reparação de feridas.

Protocolo

Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Weill Cornell Medicine." Para: "Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Weill Cornell Medicine e da Universidade Stony Brook.

1. Colonoscopia e indução de feridas

1. Pré-monte os componentes do endoscópio inserindo primeiro o endoscópio de furo rígido de 1,9 mm na baia(Figura 1A-B). Conecte a bomba de ar (para fornecer insuficiência cólon) utilizando a tubulação fornecida, à válvula de gás no lado esquerdo da baia ao lado do canal de trabalho(Figura 1C).
   NOTA: Embora a lente descrita aqui seja 0°, uma lente de 30° também pode ser usada para este fim.
2. Certifique-se de que o canal de trabalho está na posição aberta e insira 3 fórceps de biópsia fr através do canal de trabalho e avance-o até o final da bainha (garantindo que ele não se saliente para fora da bainha) (Figura 1C). Conecte o endoscópio montado à fonte de luz e ao dispositivo de imagem de vídeo por instruções do fabricante.
3. Anestesiar o rato com 5% de isoflurane com oxigênio em uma câmara de indução. Em seguida, mova o mouse para uma plataforma de estadiamento endoscópica contendo um sistema de aquecimento (para evitar hipotermia) em seu lado ventral e mantenha sob anestesia usando um cone de nariz com 2% de isoflurano com oxigênio. Adicione pomada veterinária aos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia. Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado, apertando suavemente o pé traseiro para testar um reflexo.
   NOTA: Qualquer cepa ou qualquer sexo de camundongos pode ser usado com esta técnica; no entanto, é preferível que os camundongos tenham pelo menos 8 semanas de idade para que sejam grandes o suficiente para o procedimento.
   1. Adicione pomada veterinária aos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
   2. Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado, apertando suavemente o pé traseiro para testar um reflexo.
4. Encha uma seringa de 3 mL com uma agulha de gavage de rato anexada com soro fisiológico tamponado por fosfato de temperatura ambiente (PBS). Insira agulha de aproximadamente 1 cm no ânus do rato e infunda suavemente o PBS para limpar o material fecal. Várias pelotas fecais devem sair do rato junto com o PBS que foi infundido.
   NOTA: A instilação de um volume excessivo de PBS pode resultar na formação de espuma no lúmen que poderia obscurecer a visualização do lúmen.
5. Insira o endoscópio montado 0,5 cm no ânus do mouse. Avançar os fórceps de biópsia para o lúmen do reto até que as 'mandíbulas' completas (incluindo a dobradiça) dos fórceps estejam além do fim da bainha (como observado no monitor de vídeo) (Vídeo Suplementar 1). Gire os fórceps 90° para que as mandíbulas abram em uma orientação leste-oeste(Vídeo Suplementar 1).
6. Para biópsia, abra os fórceps e avance aproximadamente 1 cm, feche os fórceps e em um movimento suave puxe rapidamente para trás nos fórceps, deixando-os fechados(Vídeo Suplementar 1).
   1. Evite insususpecionar totalmente o cólon durante a realização da biópsia. Portanto, deixe o lado direito da válvula de gás aberto durante esta etapa; embora deva ser observado que ao abrir os fórceps há o risco de danificar a mucosa quando o cólon está nesta posição.

2. Visualizando e medindo o leito da ferida

1. Inicie a gravação de vídeo imediatamente após a biópsia pressionando o pedal do pé ligado ao dispositivo de gravação de colonoscópe. Insuflê totalmente o cólon pressionando firmemente um dedo indicador contra o lado direito da válvula de gás para cobrir completamente a abertura, a fim de forçar o ar para dentro do endoscópio e, assim, para o cólon.
   NOTA: Embora este protocolo descreva o uso de uma bomba de ar na qual o fluxo de ar é controlado manualmente, uma bomba peristáltica com uma fonte de ar controlada também pode ser usada.
2. Avance os fórceps para fora da bainha, e para o lúmen retal enquanto estiver na posição fechada(Vídeo Suplementar 1). Coloque os fórceps contra a parede retal imediatamente acima da ferida até que a base das mandíbulas esteja alinhada com a borda superior do campo de visão (Figura 2 & Vídeo Suplementar 1). Continue insusentando o cólon até que uma visão clara da ferida possa ser observada.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para estender os fórceps o suficiente para revelar apenas as mandíbulas dos fórceps até a base para cada rato que está sendo examinado, a fim de garantir uma distância consistente entre a lente do endoscópio e a lesão(Figura 2,seta branca).
3. Se realizar biópsias em vários camundongos no mesmo dia, remova o tecido biópsia do rato anterior dos fórceps (usando a escova de limpeza fornecida) e limpe a bainha da lente com 70% de etanol para limpá-lo antes de induzir uma ferida no próximo rato.
   NOTA: Embora este protocolo descreva a realização de uma única biópsia por rato, várias biópsias podem ser realizadas em um único rato, desde que o tecido retirado da biópsia anterior seja removido dos fórceps, a fim de garantir que uma biópsia completa possa ser feita em biópsias subsequentes.
4. Coloque o rato em uma gaiola vazia de outros ratos e em cima de uma toalha para manter as vias aéreas limpas até que ele se recupere da anestesia após completar o procedimento. Monitore o mouse para garantir que ele se recupere da anestesia, conforme indicado pela recuperação da atividade.
   NOTA: Duas pessoas são obrigadas a induzir a ferida e visualizar o leito da ferida no dia 0 (uma operando o endoscópio e a outra operando os fórceps biópsias), mas apenas um indivíduo é necessário para visualizar feridas nos dias subsequentes (como descrito abaixo).
5. Siga o mesmo procedimento de preparação do camundongo e colonoscopia para medidas subsequentes da ferida (tipicamente dias 2, 4 e 6 após biópsia), conforme descrito acima nas seções 1.1-1.4, exceto pela indução da ferida.
6. Localize o leito de ferida no monitor de vídeo nestes pontos de tempo após a inserção do endoscópio, e avance os fórceps (na posição fechada) para imediatamente acima do leito da ferida, insuflou o cólon e inicie a gravação de vídeo, conforme descrito nas seções 2.1 e 2.2(Figura 2).
   NOTA: Pode ser difícil localizar o leito da ferida mais de 6 dias após a biópsia.
7. Avance os fórceps para o lúmen nestes dias subsequentes para a mesma distância do dia 0 para garantir uma distância consistente entre a lente do endoscópio e a lesão ao longo dos dias. Garantir uma distância consistente entre a lente e a lesão aumentará a precisão das medidas ao longo do tempo.
   NOTA: Um indivíduo pode realizar medições nestes dias (o endoscópio é operado com a mão direita e os fórceps da biópsia são avançados com a mão esquerda).
8. Uma vez concluídas todas as medições, abra as gravações de vídeo das colonoscopias seriais em software de edição de vídeo que permite a criação de fotos paradas a partir de vídeo.
9. Avance o vídeo para um quadro mostrando um ponto no tempo em que o leito da ferida pode ser facilmente visualizado, os fórceps fechados estão acima do leito da ferida e contra a parede retal e a parede está esticada. Tire um instantâneo deste quadro e codificou o nome do arquivo para garantir que as medidas das camas de ferida sejam realizadas de forma cega.
10. Abra as imagens com nomes de arquivos codificados no NIH ImageJ para quantificar o tamanho da cama ferida. Na guia Analisar, selecione Definir medidas e verifique a caixa Área.
    1. Selecione a ferramenta seleções Freehand na barra principal do menu e desenhe um perímetro ao redor da ferida (ver Figura 2). Na guia Analisar a medida e o valor dessa medição será preenchido automaticamente na janela Resultados.
11. Exporte os resultados para uma planilha após concluir as medições para todas as imagens, selecionando Salvar Como na guia Arquivo dentro da janela Resultados e alterando a extensão para se tornar um arquivo de planilha.
12. Calcule o tamanho da ferida nos dias seguintes à indução da ferida (ou seja, dias 2, 4 e 6) em relação ao tamanho do dia 0 (imediatamente após o ferimento) em uma planilha. Este é o seguinte dividindo o tamanho da ferida em cada dia pelo tamanho da ferida no dia 0 e convertendo esse valor em uma porcentagem.
    NOTA: Em condições normais utilizando este método de visualização colonoscópica, o maior fechamento da ferida é observado após os primeiros 2 dias (~75% de redução de tamanho) com fechamento mais gradual nos dias 4 e 6 (~80% e ~95% de redução no tamanho, respectivamente).

3. Coleta do leito de ferida para análise molecular

1. Eutanize o camundongo usando asfixia de CO₂ seguida de luxação cervical (ou técnica equivalente) no dia selecionado após a biópsia.
2. Colher a região distal do cólon abrindo a pele e o músculo abdominal para expor a cavidade corporal. Coloque a tesoura fechada sob o cólon e levante-a suavemente para soltá-la da mesenteria subjacente e, em seguida, corte o cólon no seu ponto médio e no ânus para removê-lo do rato.
3. Lave o teor fecal usando uma agulha de gavage de rato presa a uma seringa de 20 mL cheia de PBS 1x gelado e, em seguida, deite o cólon sobre o papel filtro.
4. Abra o cólon longitudinalmente no papel do filtro, garantindo que o lado mesentérico esteja de frente para baixo contra o papel filtro. Aplique 0,2% de azul de metileno na mucosa usando um tubo de aperto enquanto o tecido ainda está no papel do filtro e, em seguida, drene o excesso de azul de metileno. Veja o cólon sob um microscópio dissecando e localize o leito da ferida(Figura 3A).
5. Usando uma tesoura micro-íris de 4 polegadas, corte ao redor da borda do leito de ferida(Figura 3A, círculo tracejado) tomando cuidado para não cortar na camada muscular (a menos que o músculo seja desejado) e transfira a cama de ferida dissecada para um tubo usando pinças de ponta fina para congelar ou método de armazenamento desejado.
   NOTA: A quantidade de tecido coletada dessa forma é suficiente para extrair RNA para RNA-seq ou análise equivalente.

4. Preparação de tecido para análise histológica

1. Eutanize o rato e colher o cólon como descrito na etapa 3.1-3.2.
2. Abra o cólon longitudinalmente no papel do filtro, garantindo que o lado mesentérico esteja de frente para baixo contra o papel filtro. Aplique suavemente 4% de paraformaldeído (ou fixador de escolha) usando um tubo de aperto e cubra o tecido com parafilme. Deixe o apartamento em um recipiente selado por 4-6 horas.
3. Transfira tecidos para 70% de etanol para armazenamento. Quando estiver pronto para processar os tecidos, remova o parafilme e aplique 0,2% de azul metileno na mucosa usando uma pipeta de aperto enquanto o tecido ainda está no papel filtro. Em seguida, escorra o excesso de azul de metileno.
4. Veja o cólon sob um microscópio dissecando e localize o leito da ferida(Figura 3A). Usando um bisturi com uma #10 lâmina, corte diretamente pelo centro da cama da ferida e continue cortando o restante do cólon em linha reta, de tal forma que o cólon tenha sido cortado ao meio, em termos de comprimento(Figura 3A, linha preta).
5. Processe o cólon e, em seguida, incorporar parafina (um ou ambos os lados que permanecem após o corte) de tal forma que o lado que foi cortado pelo bisturi (o lado que era o centro da cama ferida antes da biseção) está de bruça para baixo na parafina. Proceda a seções de corte e coloração para manchas desejadas ou fabricantes.s.
6. Se forem necessárias crioseções para uma determinada coloração, colde o cólon conforme descrito na etapa 3.1 e abra longitudinalmente sobre o papel filtro, garantindo que o lado mesentérico esteja de bruça contra o papel filtro.
7. Bissecte o leito de ferida dentro do cólon recém-colhido como descrito na etapa 4.5 e incorpore o cólon (um ou ambos os lados que permanecem após o corte) de modo que o lado que foi cortado pelo bisturi esteja de bruços em um molde de base meio cheio de meio de congelamento tecidual.
8. Fixar o tecido no lugar com pinças finas e colocar o molde base em uma placa de metal em cima de gelo seco para endurecer o meio de congelamento. Uma vez que a porção inferior do meio esteja congelada (e o tecido seja mantido no lugar), solte o tecido e encha o volume restante do molde base com meio de congelamento e coloque de volta no gelo seco.
   1. Depois que todo o volume do meio de congelamento estiver congelado, transfira para um congelador de -80 °C até a secção.
9. Para parafina ou seções congeladas, corte e manche seções adicionais por H&E para garantir que o leito da ferida tenha sido capturado na seção antes de prosseguir para a coloração específica do estudo. A Figura 3B mostra um exemplo de uma seção na qual o leito da ferida pode ser claramente observado.

Resultados

Os pequenos itens (lente, bainha, biópsia) necessários para a realização de biópsias são mostrados na Figura 1, juntamente com indicadores de montagem adequada desses componentes. A Figura 2 mostra imagens representativas de visões aceitáveis do leito da ferida, a fim de quantificar com precisão o tamanho do leito da ferida e a taxa de fechamento da ferida. Um exemplo de visão ex vivo do leito da ferida é mostrado na Figura 3A, incl...

Discussão

Garantir biópsias consistentes e precisas, bem como medidas de tamanho da ferida são de suma importância ao tentar avaliar efetivamente a taxa de fechamento da ferida neste modelo. Portanto, várias medidas devem ser tomadas para ter certeza de que os procedimentos estão sendo realizados corretamente. Primeiro, a profundidade da biópsia não deve ser muito rasa ou profunda. Se for muito raso, não haverá uma janela suficiente para avaliar o fechamento da ferida. A Figura 2 demonstra uma ótima p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça de biópsia, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Sistema Coloview Tower	Karl Storz	empresa de contato
Bainha de exame, 9 Fr, Kit	Karl Storz	61029DK
Telescópio Hopkins, 0', 1,9 mm x 10 cm	Karl Storz	64301AA
isofluorano	Covetrus	2905
azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140
	Integra	18-1619
NIH ImageJ NIH		N / A	software disponível para download gratuito em: https://imagej.nih.gov/ij/
Bomba de aquário Pawfly MA-60	Amazon	N / A
bisturi com lâmina # 10	Hill-Rom	372610