Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência

Resumo

Descrito aqui é um procedimento estereotático que pode atingir regiões cerebrais desafiadoras e de difícil acesso (devido a limitações espaciais) usando uma abordagem coronal angular. Este protocolo é adaptável tanto aos modelos de camundongos quanto a ratos e pode ser aplicado a diversas aplicações neurocientíficas, incluindo implantação de cânulas e microinjeções de construções virais.

Resumo

A cirurgia estereotática é uma ferramenta essencial no laboratório de neurociência moderno. No entanto, a capacidade de atingir com precisão e precisão regiões cerebrais de difícil acesso ainda apresenta um desafio, particularmente quando se mira estruturas cerebrais ao longo da linha média. Esses desafios incluem evitar o seio sagital superior e o terceiro ventrículo e a capacidade de atingir consistentemente núcleos cerebrais seletivos e discretos. Além disso, técnicas de neurociência mais avançadas (por exemplo, optogenética, fotometria de fibras e imagem de dois fótons) dependem da implantação direcionada de hardware significativo para o cérebro, e limitações espaciais são um obstáculo comum. Apresentado aqui é um protocolo modificável para alvo estereotático de estruturas cerebrais de roedores usando uma abordagem coronal angular. Pode ser adaptado para 1) modelos de camundongos ou ratos, 2) várias técnicas de neurociência e 3) múltiplas regiões cerebrais. Como exemplo representativo, inclui o cálculo de coordenadas estereotáticas para direcionamento do núcleo ventromedial hipotalâmico do camundongo (VMN) para um experimento de inibição optogenética. Este procedimento começa com a microinjeção bilateral de um vírus associado ao adeno (AAV) codificando um canal de cloreto sensível à luz (SwiChR++) a um modelo de rato dependente de Cre, seguido pela implantação bilateral em ângulo de cânulas de fibra óptica. Usando essa abordagem, os achados mostram que a ativação de um subconjunto de neurônios VMN é necessária para respostas contra-regulatórias de glicose intactas à hipoglicemia induzida pela insulina.

Introdução

O controle neural do comportamento, da alimentação e do metabolismo envolve a coordenação de neurocircuitos altamente complexos, integrativos e redundantes. Um objetivo do campo da neurociência é dissecar a relação entre estrutura de circuito neuronal e função. Embora as ferramentas clássicas de neurociência (ou seja, lesões, injeções farmacológicas locais e estimulação elétrica) tenham descoberto conhecimentos vitais sobre o papel de regiões cerebrais específicas que controlam o comportamento e o metabolismo, essas ferramentas são limitadas pela falta de especificidade e reversibilidade¹.

Os recentes avanços no campo da neurociência melhoraram muito a capacidade de interrogar e manipular a função do circuito de forma específica do tipo celular com alta resolução espacial. Abordagens optogenéticas² e^{quimiogenética 3,} por exemplo, permitem a manipulação rápida e reversível da atividade em tipos celulares geneticamente definidos de animais em movimento livre. A optogenética envolve o uso de canais de íons sensíveis à luz, denominados channelrhodopsins, para controlar a atividade neuronal. A chave para esta técnica é a entrega genética de channelrhodopsin e uma fonte de luz para ativar a opsina. Uma estratégia comum para a entrega de genes é através de uma combinação de 1) camundongos geneticamente modificados expressando Cre-recombinase em neurônios discretos, e 2) vetores virais dependentes de Cre codificando channelrhodopsin.

Embora a optogenética forneça um meio elegante e altamente preciso para controlar a atividade neuronal, o método depende da microinjeção estereotática bem sucedida do vetor viral e da colocação fibra óptica em uma região cerebral definida. Embora os procedimentos estereotáticos sejam comuns dentro do moderno laboratório de neurociência (e existem vários protocolos excelentes descrevendo este procedimento)^4,5,6, ser capaz de atingir de forma consistente e reprodutivelmente regiões cerebrais discretas ao longo da linha média (ou seja, o hipotálamo mediobasal, uma área cerebral crítica à regulação das funções homeostáticas⁷) apresenta desafios adicionais. Esses desafios incluem evitar o seio sagital superior, terceiro ventrículo e núcleos hipotalâmicos adjacentes. Além disso, há limitações espaciais significativas para a implantação bilateral de hardware que é necessária para estudos de inibição. Com esses desafios em mente, este protocolo aqui apresenta um procedimento modificável para atingir regiões cerebrais discretas através de uma abordagem estereática angular.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde, o Guia de Cuidado e Uso de Animais e foram aprovados tanto pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) quanto pela Saúde e Segurança Ambiental da Universidade de Washington.

1. Cálculo de coordenadas angulares

1. Usando um atlas cerebral coronal, marque um triângulo retângulo para que a hipotenusa passe pela região alvo de interesse. No exemplo representativo(Figura 1),o núcleo ventromedial hipotalâmico (VMN) é direcionado a um ângulo de 15° da linha média coronal.
   NOTA: A colocação do eixo de rotação retratado na Figura 1 (e, portanto, o comprimento do lado C) é arbitrária e pode ser modificada para atingir qualquer região cerebral. Embora isso possa parecer contra-intuitivo, etapas posteriores no protocolo ajustarão a posição da cabeça no eixo z de modo que este ponto se alinhe com o centro estereotático de rotação (ver seção 6). No entanto, recomenda-se não exceder um ângulo de rotação coronal de 15° devido a restrições físicas do aparelho do porta-cabeça.
2. Estabeleça o ângulo desejado (a) e o comprimento estimado do lado B e use trigonometria para calcular o comprimento dos lados A e C. Esta etapa é importante para o posicionamento adequado da cabeça durante a rotação.
   NOTA: No exemplo da Figura 1,as linhas de grade atlas são usadas para aproximar o comprimento do lado B, rendendo um comprimento de 7.576 mm. Essas informações são usadas para calcular o comprimento do lado A:
   
   Neste exemplo, 2,03 mm indica a distância de R/L da linha média em que a cânula fibraótica entra no cérebro quando a cabeça é girada em 15°.
   1. Opcionalmente, calcule o comprimento do lado C para aproximar a coordenada D/V:
      
      NOTA: 1) O comprimento do hipoteno (C) não representa a profundidade da injeção, mas será útil na determinação da coordenada D/V, que pode precisar ser ajustada para acomodar o comprimento aumentado versus o lado B para injeções diretas. Recomenda-se, portanto, realizar injeções de teste para otimizar a coordenada D/V. 2) Neste exemplo visando a VMN, dois conjuntos de coordenadas são obtidos: um para a microinjeção que não é angular (A/P = -1,4, R/L = 0,4 a 0°, D/V = -5,7) e um para a implantação em ângulo de fibra óptica (A/P = -1,4, R/L = 0,0 a 15°, D/V = -5,4).

2. Preparação do estereotax para procedimento em ângulo

1. Confirme se o quadro estereotático e o micromanipulador foram calibrados (consulte o manual kopf para o protocolo completo).
2. Coloque o medidor de altura central na tomada da placa base do suporte da cabeça.
3. Fixar o escopo de centralidade no suporte da ferramenta e, em seguida, avistar o escopo. Ajuste a posição do micromanipulador até que a mira esteja alinhada e focada na mira do medidor.
   NOTA: Durante esta etapa, o escopo está sendo posicionado no plano focal do centro de rotação do porta-cabeça. Uma vez estabelecido, o micromanipulador não deve ser movido durante as etapas restantes.
4. Coloque as barras de ouvido nos suportes e centrale-as de forma que as linhas indicadoras de ambos os lados estejam em 0 (Figura 3A).
5. Use os botões medial-lateral e anterior-posterior no suporte da cabeça (Figura 2) para alinhar as barras de ouvido no x- e y-planos acima da mira do medidor de altura central(Figura 3A).
6. Para alinhar a posição da barra de ouvido no eixo z, remova as barras da orelha do suporte e remova o medidor de altura central. Substitua as barras de ouvido e centrale-as novamente em 0.
7. Visão para baixo do escopo. Use o botão de mudança vertical(Figura 3B) e o botão de inclinação coronal, respectivamente, para baixar e girar as barras de ouvido até que a mira do escopo permaneça centrada entre as barras de ouvido durante a rotação coronal.
8. O estereotax está agora calibrado e pronto. Não faça mais ajustes na posição do titular.

3. Preparação de materiais para injeção/implantação

1. Certifique-se de que todos os instrumentos, ferramentas cirúrgicas e materiais sejam esterilizados e colocados em um campo cirúrgico estéril ao lado do estereotax.
2. Manuseie e armazene construções virais de acordo com seu nível de biossegurança e requisitos regulatórios de biossegurança institucionais relevantes.
3. Desenhe o vírus na seringa, tomando cuidado para usar práticas de manuseio adequadas e equipamentos de proteção individual.

4. Anestesia

1. Grave o peso corporal do rato antes da cirurgia.
2. Anestesia profundamente o rato usando isoflurano.
3. Certifique-se de que o mouse está profundamente anestesiado realizando um teste de beliscão do dedo do dedo do dedo até que a resposta vacilante esteja ausente. Se o animal continuar a apresentar reflexos fortes, aumente a concentração e/ou duração da anestesia.
4. Aplique pomada ocular em cada olho para mantê-los úmidos durante a cirurgia.
5. Raspe o couro cabeludo de trás das orelhas para apenas atrás dos olhos com um cortador de cabelo.
6. Forneça ao mouse analgésico aprovado pelo IACUC.
7. Monitore continuamente o animal durante todo o procedimento cirúrgico e forneça suporte térmico.

5. Procedimento cirúrgico

1. Coloque a cabeça no suporte da cabeça colocando os incisivos superiores na abertura da barra de mordida, certificando-se de que a língua está abaixo da barra de mordida.
2. Fixar a cabeça nas barras de ouvido inserindo suavemente as barras de ouvido no meatus auditivo externo, garantindo que as barras de ouvido sejam colocadas simetricamente (tipicamente entre três e quatro para um rato adulto). Esta etapa é fundamental para garantir que a cabeça esteja estável e centrada para rotação.
3. Prepare aseticamente a área de incisão raspada com três esfoliantes alternados de cotonetes betadina e álcool, ou com preparação alternativa do local cirúrgico aprovado institucionalmente.
4. Coloque uma cortina cirúrgica sobre o animal para manter um campo cirúrgico estéril e reduzir o risco de infecção pós-operatória.
5. Exponha o crânio fazendo uma incisão ao longo da linha média sagital do couro cabeludo. Raspe suavemente a superfície do crânio para remover qualquer fáscia e expor as suturas.
   NOTA: Se as linhas de sutura forem difíceis de visualizar, o peróxido de hidrogênio pode ser aplicado ao crânio usando um aplicador de ponta de algodão estéril para melhorar a visualização da sutura.
6. Coloque o escopo central no suporte e centralizar a mira na bregma(Figura 4, painel esquerdo). Zero o micromanipulador.
7. Mova a mira caudaly para lambda, observando a distância bregma-lambda (B-L).
   NOTA: Se as linhas de sutura não seguirem uma linha reta ao longo da linha média, recomenda-se estabelecer a linha média usando a "linha de melhor ajuste" através de bregma e lambda. No entanto, se os passos acima forem seguidos, a colocação inicial da ântice de escopo deve estar no meio do caminho entre as barras de ouvido e aproximar-se de perto da sutura de linha média B-L.
8. Se a distância B-L for significativamente menor ou superior a 4,21 mm, ajuste gradualmente o bregma atribuído para obter uma distância B-L de 4,21 mm ± 0,2 mm.
9. Substitua o escopo central de centro pelo indicador de alinhamento. Coloque as sondas em lambda e bregma e ajuste o botão de inclinação dorsal no suporte da cabeça para nivelar no plano sagital (nariz voltado para cima ou para baixo), em seguida, use o escopo central para redesignar bregma.
10. Use o indicador de alinhamento para nivelar no plano coronal usando o botão de inclinação coronal. Meça em vários pontos ao longo do eixo rostral/caudal para explicar as deformações superficiais no crânio.
11. Observe a posição no mostrador do botão de inclinação coronal, pois esta é a posição de rotação 0°.

6. Alinhando os eixos centrais de rotação para coordenadas angulares

1. Fixar o escopo de centralidade no suporte da ferramenta e posicionar o micromanipulador à coordenada calculada da seção 1. Observe que a coordenada R/L para a implantação em ângulo corresponde ao comprimento do lado A.
   1. No exemplo da Figura 1,as coordenadas angulares para colocação em fibra óptica visando o VMN são (A/P = -1,4, R/L = [2,03] a rotação coronal de 0°, [0,00] a 15° rotação coronal, D/V = -5,4).
2. Avistar o escopo e marcar esta coordenada (R/L 2,03 mm da linha média pelo exemplo VMN; Figura 4, painel do meio). Esta marca representa o ponto em que a cânula entrará no cérebro assim que a cabeça for girada.
3. Reposicionar o micromanipulador sobre a linha média (R/L = 0,00). Use o botão de inclinação coronal para girar a cabeça para o ângulo calculado na seção 1.
   1. Se a mira já estiver alinhada com a marca, siga para a seção 7.
   2. Se a mira do escopo não se alinhar com a marca de referência, ajuste a posição da cabeça no eixo z usando o botão de mudança vertical(Figura 2) até que a mira se aproxime o mais possível da marca.
4. Gire a cabeça de volta para a posição coronal de 0°. Se a mudança vertical foi ajustada na etapa 6.3, reatribuir bregma usando o escopo central.
5. Repita as etapas 6.3 e 6.4 até que a mira atinja consistentemente a marca de referência quando a cabeça é girada(Figura 4C).
6. Neste ponto, o ponto arbitrário de rotação estabelecido na seção 1 deve agora estar alinhado com o centro estereotático de rotação.

7. Microinjeção

1. Coloque a broca estereotática no suporte e manoenda o micromanipulador até a primeira coordenada de injeção.
   1. Por exemplo de mira da VMN, fure em A/P = -1,4 e R/L = 0,4 enquanto a cabeça estiver nivelada.
2. Abaixe a broca até que a broca esteja logo acima do crânio. Ligue a broca e baixe suavemente até que a broca tenha perfurado o crânio (não a duraza).
3. Repita para o local de injeção contralateral.
4. Use um condutor de agulha estéril para introduzir uma curva de 90° em uma agulha de 27-30G (por exemplo, de uma seringa de insulina estéril de 0,5 mL), e use a agulha dobrada para cutucar suavemente a dura-minga.
5. NOTA: Se ocorrer sangramento, aplique pressão com um aplicador estéril com ponta de algodão e limpe com água estéril até que o sangramento pare.
6. Quando estiver pronto para injetar, coloque cuidadosamente uma seringa Hamilton preenchida no suporte estereotático.
   NOTA: As coordenadas do micromanipulador não se aplicam mais após a mudança para uma nova ferramenta. Use o centro do orifício de rebarba como o novo alvo para injeção.
7. Posicione cuidadosamente a agulha acima do orifício da rebarba.
8. Abaixe a agulha até que toque ligeiramente a dura dentro do centro do orifício da rebarba. CRÍTICA: Zero o micromanipulador apenas no eixo z, de modo que as coordenadas do micromanipulador para o escopo de centro estereotático e broca sejam mantidas.
9. Abaixe lentamente a agulha para dentro do cérebro, observando de perto para garantir que a agulha não desvie na borda do orifício da rebarba. Continue baixando até 0,05 mm de ventral para a coordenada de injeção D/V e espere 1 min. Esta etapa extra cria um pequeno "bolso" para minimizar o fluxo de backflow viral na remoção da agulha.
10. Levante lentamente a agulha para a coordenada D/V e inicie a injeção.
    NOTA: A taxa de fluxo e o volume variam dependendo da região alvo e do design experimental. Para o silenciamento optogenético dos neurônios VMN, deseja-se cobertura suficiente, de modo que 200 nL de vírus é injetado a uma taxa de 1 nL/s.
11. Após a microinjeção, espere 10 min no local da injeção para minimizar o efflux do vírus durante a retirada.
12. Retire lentamente a micropipette do cérebro a uma taxa aproximada de 1 mm/min.
13. Uma vez que a agulha esteja limpa do crânio, ejete um pequeno volume de vírus para garantir que a agulha não tenha entupido com sangue ou tecido. Use um aplicador de ponta de algodão estéril para remover o vírus antes de continuar.
14. Repita as etapas 7.6-7.12 para o lado contralateral.
15. Sele os orifícios de microinjeção com cera óssea para melhorar a cicatrização(Figura 5B).

8. Implantação de fibra óptica

NOTA: Após a injeção viral, as cânulas de fibra óptica bilaterais são implantadas no ângulo calculado por seção 1. Observe que essas coordenadas já devem estar marcadas no crânio da seção 6.

1. Repita as etapas 7.1 -7.4 para as coordenadas angulares.
2. Volte a cabeça para a posição nível 0°.
3. Em seguida, use a broca manual para produzir quatro orifícios adicionais para os parafusos ósseos: dois devem ser colocados anteriormente e dois posteriormente(Figura 5A). Estes servirão como âncoras para fixar as fibras ópticas ao crânio(Figura 5D).
   NOTA: Certifique-se de espaçar os orifícios longe o suficiente dos orifícios de rebarbas de coordenadas angulares para acomodar a porção de ferrule da fibra óptica que fica acima do crânio.
4. O mais suave possível, use a pequena chave de fenda plana para definir os parafusos ósseos de tal forma que eles se sentem firmemente no crânio, mas não penetrem no cérebro.
5. Fixar uma cânula fibra óptica no suporte da cânula e colocá-la no suporte estereotático.
6. Gire a cabeça para o ângulo calculado, observando novamente que as coordenadas do micromanipulador não se aplicam à nova ferramenta. Use o centro dos orifícios de rebarba angular como alvo de implantação.
7. Abaixe a fibra óptica até que ela só toque a dura dentro do centro do orifício de rebarba(Figura 5C). Zero o micromanipulador no eixo z, depois lentamente mais lento o fibra óptica para a coordenada angular D/V (-5,4 por exemplo VMN).
8. Use gel de cianoacrilato para conectar a ferrule fibra óptica aos parafusos de âncora ipsilateral e, em seguida, aplique um acelerador com uma ponta de micropipette(Figura 5D).
9. Uma vez que o gel de cianoacrilato tenha endurecido completamente, solte suavemente o suporte da cânula e levante até ficar longe da ferrula fibra óptica.
10. Repita as etapas 8.5-8.9 para a coordenada em ângulo contralateral e, em seguida, nivele a cabeça. Para maior segurança, faça uma conexão adicional entre as duas cânulas de fibra óptica angulares com o gel cianoacrilato e o acelerador(Figura 5D).
11. Prepare uma pequena e relativamente fina quantidade de cimento dental. Aplique na superfície do crânio, certificando-se de cobrir completamente os parafusos de âncora e base das cânulas fibraóticas. Deixe o suficiente da ferrula limpa para o acasalamento subsequente com os cabos de remendo de fibra óptica.
12. Uma vez que o cimento esteja seco, remova o mouse do aparelho estereotático.
13. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação com suporte térmico. Permita que ele se recupere e transfira para a gaiola doméstica assim que aparecer alerta, móvel e estiver preparando.

9. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Monitore os animais diariamente durante 3 dias pós-operatórios para comportamento, postura, atividade e aliciamento, e mantenha registros de ingestão de alimentos e peso corporal.
2. Se os animais apresentarem algum indicador geral de dor ou saúde ruim, consulte os serviços veterinários.
3. Permita aos camundongos pelo menos 2 semanas para recuperação e para expressão viral antes de iniciar estudos comportamentais.

10. Optogenética

1. Para a realização de estudos optogenéticos, consulte Sidor et al.⁸.
2. Validar a expressão viral e a colocação de fibras na conclusão dos estudos.

Resultados

Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para a realização de estudos optogenéticos para interrogar o papel dos neurônios VMN hipotalâmicos no controle glicêmico⁹. A primeira utilização foi uma abordagem estereotática padrão (não angular) para a microinjeção bilateral de um vírus de canalrhodopsina inibitória para o VMN. Embora uma abordagem angular também seja adequada, a abordagem padrão (não angular) foi selecionada porque é suficiente para atingir a região do cérebro de interesse e é ...

Discussão

Os recentes avanços na neurociência têm apoiado a visão avançada e a compreensão sobre a atividade e a função dos neurociruques cerebrais. Isso inclui a aplicação de tecnologias optogenéticas e quimiéticas para ativar ou silenciar populações neuronais discretas e seus locais de projeção in vivo. Mais recentemente, isso incluiu o desenvolvimento de indicadores de cálcio geneticamente codificados (por exemplo, GCaMP, RCaMP) e outros biosensores fluorométricos (por exemplo, dopamina, norepinefrina) para o registro in vivo d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lentes dóricas	cânulas de fibra óptica	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Sistema de
alinhamento estereotáxico Kopf modelo 1900 personalizável Kopf	modelo 1900		Kopf
modelo 1900-51 medidor de altura central	Kopf	modelo 1900-51
Kopf modelo 1905 indicador de alinhamento	Kopf	modelo 1905
modelo 1911 broca estereotáxica	Kopf	Modelo 1911
Kopf Modelo 1915 Escopo de Centralização	Kopf	Modelo 1915
Kopf Modelo 1922 Barras de orelha sem ruptura de 60 graus	Kopf	Modelo 1922
Kopf Modelo 1923-B Suporte de cabeça de anestesia a gás de camundongo	Kopf	Modelo 1923-B
Kopf Modelo 1940 Micro Manipulador	Kopf	Modelo 1940
Micro44 Sistema de Microinjeção	World Precision Instruments	--
Parafusos de osso de rato	Plásticos Um	00-96 X 1/16
Suporte de cânula estereotáxica, ponteira de 1,25 mm	Broca cirúrgica Thor Labs	XCL
Ponto	célula	Micro broca