Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

Resumo

Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.

Resumo

Foi relatado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados com sua plasticidade estrutural. Para identificar a estrutura morfológica de neurônios piramidais e espinhos dendrípticos, uma técnica de rotulagem balística pode ser utilizada. No presente protocolo, os neurônios piramidais são rotulados com tintura DilC18(3) e analisados usando software de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. Para investigar a estrutura neuronal, são realizadas análises de ramificação dendríticas e análise de Sholl, permitindo que os pesquisadores desenhem inferências sobre a complexidade de ramificação dendrítica e a complexidade da árvore neuronal, respectivamente. A avaliação das espinhas dendríticas é realizada utilizando-se um algoritmo de classificação assistida automática integral ao software de reconstrução, que classifica as espinhas em quatro categorias (ou seja, fina, cogumelo, stubby, filopodia). Além disso, três parâmetros adicionais (ou seja, comprimento, diâmetro da cabeça e volume) também são escolhidos para avaliar alterações na morfologia da coluna vertebral dendrítica. Para validar o potencial de ampla aplicação da técnica de rotulagem balística, neurônios piramidais da cultura celular in vitro foram rotulados com sucesso. No geral, o método de rotulagem balística é único e útil para visualizar neurônios em diferentes regiões cerebrais em ratos, o que, em combinação com um sofisticado software de reconstrução, permite aos pesquisadores elucidar os possíveis mecanismos subjacentes disfunção neurocognitiva.

Introdução

Em 2000, Gan et al. descreveram uma técnica de rotulagem rápida para neurônios individuais e glia no sistema nervoso que combinava vários corantes lipofílicos, permitindo a rotulagem simultânea de muitas células cerebrais com cores diferentes^1,2. Mais recentemente, uma técnica de rotulagem balística foi descrita por Seabold et al.³ que introduziu corantes fluorescentes (Dil) nos neurônios das fatias cerebrais. Uma técnica versátil de coloração, a rotulagem balística é apreciada por sua capacidade de ser utilizada em múltiplas espécies animais e em uma ampla gama de idades. Além disso, pode ser combinado com imunocoloração para identificar subpopulações de células cerebrais³. Em comparação com as técnicas tradicionais (por exemplo, impregnação de prata golgi-cox, microinjeção)⁴, a rotulagem balística oferece uma oportunidade para distinguir mais claramente características morfológicas, incluindo colunas dendríticas, característica que é fundamental para desenhar inferências sobre complexidade neuronal e conectividade sináptica⁵.

Neurônios piramidais excitatórios são caracterizados por um único, grande dendrito apical, múltiplos dendritos basais mais curtos, e milhares de espinhas dendríticas⁶. Neurônios piramidais são encontrados em múltiplas regiões cerebrais relacionadas ao processamento cognitivo de ordem superior, incluindo o córtex pré-frontal (PFC) e o hipocampo. No PFC, os neurônios piramidais são observados nas camadas II/III e camada V, com cada um apresentando morfologia única. Especificamente, os neurônios piramidais na camada II/III do PFC têm um dendrito apical mais curto e menos ramificação do que os neurônios piramidais na camada V⁶. Dentro do hipocampo, os neurônios piramidais estão localizados nas regiões CA1 e CA3, com cada uma exibindo morfologias distintas. Especificamente, os neurônios piramidais na região ca1 apresentam um dendrito apical mais distinto, com ramificações ocorrendo mais longe do soma, em relação à região ca3⁶.

Espinhos dendréticos em neurônios piramidais tanto no PFC quanto no hipocampo são o local principal das sinapses excitatórias⁷. As características morfológicas das espinhas dendríticas, que são classicamente caracterizadas em três categorias primárias (ou seja, finas, stubby ou cogumelo⁸), foram relacionadas com o tamanho da sinapse excitatória⁹. Espinhos finos, caracterizados por um pescoço longo e fino, cabeça bulbosa pequena e densidades postynapticas menores, são mais instáveis e desenvolvem conexões mais fracas. No entanto, as espinhas de cogumelos, que têm uma cabeça de coluna dendrítica maior, são reconhecidas por formar conexões sinápticas mais fortes, um efeito resultante de seu tamanho maior. Em contraste acentuado, as espinhas stubby são desprovidas de um pescoço de coluna, exibindo uma razão de volume de cabeça e pescoço aproximadamente igual⁸. Dentro do hipocampo, espinhos ramificados também podem ser observados, pelo qual a coluna vertebral tem múltiplas cabeças que emergem do mesmo pescoço dendrítico¹⁰. Portanto, as mudanças morfológicas das espinhas dendríticas poderiam refletir a funcionalidade e a capacidade estrutural. Além disso, estudos têm demonstrado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados à sua plasticidade estrutural, levando à ideia de que pequenas espinhas estão envolvidas na aprendizagem e na atenção, enquanto espinhas maiores e mais estáveis estão envolvidas em processos de longo prazo, incluindo a memória¹¹. Além disso, a distribuição de espinhos dendréticos ao longo do dendrito pode estar associada à conectividade sináptica^5,12.

Assim, o presente trabalho metodológico tem três metas: 1) Apresentar nosso protocolo de rotulagem balística, que tem sido utilizado com uma taxa de sucesso (ou seja, neurônios atendendo aos critérios de seleção e apropriados para análise) de 83,3%^5,12,13 e em múltiplas regiões cerebrais (ou seja, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demonstrar a generalização da técnica e sua aplicação aos neurônios cultivados in vitro; 3) Detalhe a metodologia utilizada no software de reconstrução neuronal e as inferências que podem ser extraídas desses dados.

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia federal: D16-00028).

1. Preparação da tubulação de dii/tungstênio

1. Dissolver 100 mg de polivinilpirrolido (PVP) com 10 mL de ddH₂O. Vortex a solução PVP levemente.
2. Encha a tubulação com a solução PVP (ver Tabela de Materiais) e deixe-a por 20 min. Em seguida, expulse a solução PVP através da outra extremidade do tubo usando uma seringa de 10 mL.
3. Combine 170 mg de contas microtransportadoras de tungstênio com 250 μL de cloreto de metileno. Vórtice a suspensão de abelhas de tungstênio completamente.
4. Combine 6 mg de corante lipofílico DilC18(3) com 300 μL de cloreto de metileno. Vórtice a solução de tine DilC18(3) completamente.
   NOTA: Executar as etapas 1.3-1.4 em uma capa de fumaça.
5. Pipeta 250 μL da suspensão de conta de tungstênio em um escorregador de vidro. Aguarde a suspensão a secar a ar (~3 min).
6. Adicione 300 μL de solução de corante DilC18(3) na parte superior da camada de suspensão do talude de tungstênio. Misture bem a solução de corantes DiIC18(3) e a suspensão de talitas de tungstênio com uma ponta de pipeta e deixe a mistura secar ao ar (~3 min).
7. Uma vez seco, use uma lâmina de barbear para dividir a mistura em dois tubos de centrífuga de 1,5 mL. Encha os tubos com água.
8. Sonicate em banho-maria (Amp I, 100%) até homogêneo (~5 min). Certifique-se de que a ponta do sônico esteja diretamente sobre os tubos com a suspensão do tale.
9. Combine os dois 1,5 mL de mistura homogeneizada em um tubo cônico de 15 mL. Sonicate a mistura por mais 3 min.
10. Desenhe a mistura de corante tungstênio-DilC18(3) na tubulação revestida de PVP usando uma seringa de 10 mL. Alimente o tubo na estação de preparação (ver Tabela de Materiais).
11. Gire por 1 min na estação de preparação. Remova cuidadosamente toda a água do tubo usando uma seringa de 10 mL.
12. Ligue o gás nitrogênio e ajuste o fluxo de nitrogênio para aproximadamente 0,5 Litros por minuto (LPM), gire o tubo na estação de preparação e seque com nitrogênio por 30 minutos.
13. Remova o tubo da estação de preparação e corte em comprimentos de 13 mm (correspondendo ao tamanho de carregamento do cartucho) usando um cortador de tubos. Mantenha os comprimentos de 13 mm em frascos de cintilação no escuro.

2. Preparação de seções cerebrais

NOTA: Os ratos machos adultos F344/N foram alojados em um ambiente controlado um ciclo de luz 12/12: ciclo escuro com acesso a ad libitum a alimentos e água. Todos os animais foram atendidos utilizando diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Ratos anestesiados usando 5% de sevofano.
2. Siga para o passo seguinte quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.
3. Fixe o rato em uma posição supina dentro de uma capa de fumaça química.
4. Faça uma incisão através da pele ao longo da linha média torácica. Separe o diafragma e abra o peito com uma tesoura. Insira uma agulha de 20 G × 25 mm no ventrículo esquerdo.
5. Corte imediatamente o átrio direito com uma tesoura. Perfuse 50 mL de 100 mM PBS com 5 mL/min de vazão. Perfusão 100 mL de 4% de paraformaldeído tamponado em 100 mM PBS.
6. Remova todo o cérebro de rato logo após a perfusão.
7. Fixe todo o cérebro por 10 min com 4% de paraformaldeído.
   NOTA: Não poste em 4% de paraformaldeído por mais de 30 min, pois afetará a rotulagem.
8. Corte seções coronais de 500 μm de espessura usando uma matriz cerebral de rato (ver Tabela de Materiais). Faça o primeiro corte e mantenha a lâmina no lugar. Faça um segundo corte usando uma segunda lâmina e remova verticalmente a primeira lâmina, mantendo o tecido na superfície da lâmina.
9. Coloque as fatias cerebrais em uma placa de 24 poços com 1 mL de 100 mM PBS em cada poço. Repita este processo até que todas as fatias tenham sido cortadas.

3. Rotulagem balística e visualização de seções cerebrais

1. Remova o PBS de cada bem direcionado.
2. Carregue o cartucho com um pedaço de tubo de dii/tungstênio e coloque-o no aplicador.
3. Coloque um pedaço de papel filtro entre duas telas de malha. Conecte o aplicador à mangueira de hélio. Ajuste a pressão de saída do hélio para 90 libras por polegada quadrada (psi).
4. Coloque o aplicador verticalmente à mão no centro do poço direcionado a uma distância de 1,5 cm entre a amostra e a tela de malha. Atire a tubulação de contas DiI/Tungstênio.
   NOTA: Certifique-se de remover todos os PBS dos poços alvo antes de atirar.
5. Carregue o cartucho com o próximo tubo de dii/tungstênio. Dispare continuamente as contas DiI/Tungstênio do tubo sobre as fatias restantes.
6. Encha a placa de 24 poços com 100 mM de PBS. Lave com 500 μL de 100 mM frescos de PBS 3x. Não deixe as fatias virarem enquanto lava com PBS.
7. Adicione 500 μL de PBS fresco de 100 mM e mantenha as fatias a 4 °C no escuro por 3 h.
8. Transfira as fatias cerebrais para lâminas de vidro usando um pincel fino.
   NOTA: Três seções cerebrais podem ser transferidas para cada lâmina de vidro.
9. Adicione imediatamente 1 mL de meio de montagem antifade em cada seção. Coloque um deslizamento de cobertura de 22 mm x 50 mm sobre as seções cerebrais. Seque as lâminas de vidro no escuro por 2 dias.
10. Ligue o sistema de microscópio confocal e mude para um objetivo de 60×.
11. Defina o sistema de microscópio confocal para ter uma ampliação de 60× (A/1.4, óleo) e um intervalo de plano Z de 0,15 μm (tamanho pinhole 30 μm, raio de orifício projetado para trás 167 nm). Use um comprimento de onda de 543 nm para adquirir imagens dos neurônios de interesse.
12. Obter imagens de pilha Z para o tipo de neurônio direcionado com base nos limites da região cerebral e características morfológicas dos neurônios.
    NOTA: Adquira pelo menos três imagens de cada animal.

4. Uso da metodologia com cultura celular

1. Isolar os neurônios corticais primários dos ratos F344/N no primeiro dia pós-natal utilizando a metodologia previamente relatada¹⁴.
2. Cultura neurônios corticais primários em uma placa de fundo de vidro de 35 mm por uma semana. Mude metade do meio de cultura com meio de crescimento de neurônios frescos no terceiro dia após o isolamento. Lave o prato de fundo de vidro 2x com 1 mL de 100 mM PBS.
3. Fixe com 4% de paraformaldeído por 15 min à temperatura ambiente. Repita as etapas 3.2-3.6 para rotular balísticamente as células.
4. Lave com 1 mL de 100 mM PBS 3x. Adicione 500 μL de 100 mM frescos de PBS e mantenha-o a 4 °C no escuro por 3 h.
5. Adicione 200 μL de meio de montagem antifade.
6. Obtenha imagens de pilha Z para cada neurônio alvo usando os parâmetros na etapa 3.10.

5. Análise neuronal e quantificação da coluna vertebral dendrítica

1. Neurônios cegos usando números de código para evitar viés experimentador.
2. Estabelecer critérios de seleção para neurônios com base na região de interesse cerebral.
   NOTA: Os critérios de seleção dos neurônios incluem coloração dendrítica contínua, baixo fundo, sem aglomerados de tinos dentro das células, difusão mínima do dii no espaço extracelular, morfologia correta dos neurônios piramidais(Figura 1).
3. Abra o software de reconstrução neuronal (Veja o vídeo anexo 1).
4. Carregue um arquivo de imagem clicando na imagem "File Folder" no canto superior esquerdo.
5. Cliqueem "Soma" e marque a soma dos neurônios na imagem.
6. Clique em"Árvore" e selecione "Guiado pelo usuário".
7. Rastreie todos os ramos de interesse dendrético.
   NOTA: Para neurônios piramidais, que são caracterizados por um dendrito apical e múltiplos dendritos basilares, apenas o dendrito apical é rastreado. Certifique-se de que todas as ramificações de conexão estão conectadas umas às outras.
8. Cliqueem" Espinha ".
9. Defina parâmetros de detecção e clique em "Detectar tudo".
   NOTA: Para fatias cerebrais, os parâmetros consistentes utilizados em todas as regiões cerebrais são: 2,0 (Faixa Externa), 0,3 (Altura Mínima), 100% (Sensibilidade ao Detector) e 10 (Contagem Mínima). Para a cultura celular, é necessário aumentar a Sensibilidade do Detector e diminuir a Contagem Mínima.
10. Classifique as espinhas selecionando "Classificar tudo".
    NOTA: As espinhas dendríticas são classificadas usando um algoritmo integral ao software de reconstrução neuronal¹⁵.
11. Salve o rastreamento selecionando a Imagem de Disco no canto superior esquerdo.
12. Realizar análises morfológicas da coluna neuronal e dendrítica.
    1. Software de análise quantitativa de reconstrução neuronal aberta (Ver vídeo anexado 2).
    2. Carregar imagem clicando em "Arquivo" e "Abrir arquivo de dados".
    3. Clique em "Análise" e "Análise de Estrutura Ramificada" para analisar a morfologia neuronal e a morfologia da coluna vertebral dendrítica.
    4. Para morfologia neuronal, clique em "Tree Totals" e selecione a caixa para "Dendrite Totals".
    5. Para morfologia dendrítica da coluna vertebral, clique em "Espinhas" e, em seguida, selecione a caixa para "Detalhes da Coluna".
    6. Salvar saída como um arquivo de texto (.txt) clicando com o botão direito do mouse na tabela de saída e selecionando "Salvar ao arquivo".
    7. Cliqueem" Analisar " e "Análise de Sholl".
    8. Coloque o raio de partida em 10 μm e o incremento de raio a 10 μm.
    9. Clique na caixa "Dendrites" e clique em "Exibir".
    10. Salvar saída como um arquivo de texto (.txt) clicando com o botão direito do mouse na Tabela de saída e selecionando " Salvar paraarquivo".

6. Análise de dados

1. Analisar os dados da morfologia neuronal (ou seja, complexidade de ramificação dendrítica).
   1. Adicione o número de dendritos em cada ordem de filial e divida pelo número total de dendritos. Multiplique por 100 para calcular as freqüências relativas para o número de dendritos em cada ordem de ramo.
2. Analise os dados de análise de Sholl para examinar a complexidade da árvore neuronal e a conectividade da coluna vertebral dendrítica.
   1. Calcule o erro médio e padrão da média para o número de intersecções em cada raio.
   2. Soma o número de espinhas dependentes do tipo de coluna vertebral (ou seja, fina, stubby, cogumelo) em cada raio e dividida pelo número total de espinhas para esse tipo de coluna vertebral. Multiplique por 100 para calcular as frequências relativas para o número de espinhas em cada raio.

Resultados

Na Figura 2A,os neurônios piramidais típicos na região hipocampal nas seções cerebrais de ratos foram identificados pela tecnologia de rotulagem balística, caracterizada por um grande dendrito apical e vários dendritos basais menores ao redor do soma. A Figura 2B mostra o neurônio no software de análise quantitativa da reconstrução neuronal após a destécnica, os ramos dendréticos foram rastreados e as espinhas foram detectadas. Posteriormente, os dados foram ana...

Discussão

Neste protocolo, descrevemos uma técnica de rotulagem versátil para neurônios tanto do cérebro de ratos quanto daqueles cultivados in vitro. Além disso, relatamos a metodologia de utilização do software de reconstrução neuronal e do software de análise quantitativa de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. A avaliação da morfologia neuronal e das espinhas dendríticas fornece uma oportunidade para determinar alterações na complexidade de ramificação dendrítica, complexidade da ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha PrecisionGlide 20Gx25mm	BD	305175
placa de cultura de células de 24 poços	Costar	3562
Pratos com Fundo de Vidro de 35 mm	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
Solução Antibiótico-Antimicótica	Suplemento Cellgro	30004CI	100X
B-27	Life Technologies	17504-044	50X
Revestimento cilíndrico	BIO-RAD	165-2417
Bórax	Sigma	B9876
Ácido bórico	Sigma	B0252
Suporte de cartucho	BIO-RAD	165-2426
Software de imagem confocal	Nikon	EZ-C1	versão 3.81b
Microscópio confocal	Nikon	TE-2000E
Capa vidro	VWR	637-137
DilC18(3)	Fisher Scientific	D282
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Dumont #5 Fórceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Fórceps	World Precision Instruments	14097
F344 rato	(Harlan Laboratories, Indianápolis, IN)
Glicose	VWR	101174Y
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
HBSS	Sigma	H4641	10X
Telas de difusão	Helios BIO-RAD	165-2475
Kit de pistola de genes Helios	BIO-RAD	165-2411
Sistema de pistola de genes Helios	BIO-RAD	165-2431
Conjunto de mangueira de hélio	BIO-RAD	165-2412
Fórceps de íris	World Precision Instruments	15914
Tesoura de íris	World Precision Instruments	500216
cloreto de metileno	Fisher Scientific	D150-1
Meio neurobasal	Life Technologies	21103-049
Neurolucida 360 software	mbf biociência		análise da coluna dendrítica
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldeído	Sigma	P6148
Poli-L-Lisina	Sigma	P9155
Polivinilpirrolidona	Fisher Scientific	5295
ProLong Gold reagente antidesbotamento	Meio de montagem	Fisher Scientific	P36930
Matriz cerebral de rato, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm	Ted Pella	15047
Sevoflurano	Merritt Suprimentos Veterinários	347075
Bicarbonato de Sódio	Life Technologies	25080
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Kit	de seringaBIO-RAD	165-2421
Tubulação de Tefzel	BIO-RAD	165-2441
Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054
Cortador de tubulação	BIO-RAD	165-2422
Estação de preparação de tubulação	BIO-RAD	165-2418
Microtransportador de tungstênio M-25 1.7 µ m	BIO-RAD	165-2269
Vannas Tesouras	Mundo Instrumentos de Precisão	500086