Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.
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Artigo de método
Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os modelos de xenoenxerto derivados do paciente são fundamentais na definição de como diferentes cânceres respondem ao tratamento medicamentoso em um sistema in vivo. Os modelos de mouse são o padrão no campo, mas os zebrafish surgiram como um modelo alternativo com várias vantagens, incluindo a capacidade de alta taxa de entrega e triagem de medicamentos de baixo custo. Os zebrafish também permitem a triagem de medicamentos in vivo com grandes números de réplicas que antes só eram obtidos com sistemas in vitro. A capacidade de realizar rapidamente telas de medicamentos em larga escala pode abrir a possibilidade de medicina personalizada com rápida tradução dos resultados de volta à clínica. Modelos de xenoenxerto de zebrafish também poderiam ser usados para testar rapidamente mutações acionáveis com base na resposta do tumor a terapias-alvo ou para identificar novos compostos anticancerígenos de grandes bibliotecas. A maior limitação atual no campo vem quantificando e automatizando o processo para que as telas de drogas possam ser feitas em uma escala maior e serem menos trabalhosas. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para xenoenxeragem de amostras primárias de pacientes em larvas de zebrafish e realizando telas de drogas em larga escala usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e unidade de amostragem automatizada. Este método permite a padronização e quantificação da área tumoral enxertada e a resposta ao tratamento medicamentoso em grande número de larvas de zebrafish. No geral, este método é vantajoso em relação ao rastreamento de drogas de cultura celular tradicional, pois permite o crescimento de células tumorais em um ambiente in vivo durante todo o tratamento medicamentoso, e é mais prático e econômico do que os camundongos para telas de drogas in vivo em larga escala.
Introdução
O xenoenxerto de cânceres primários ou linhas de células cancerígenas humanas em organismos modelo é uma técnica amplamente utilizada para estudar a progressão e o comportamento do tumor in vivo, a resposta tumoral ao tratamento medicamentoso e a interação celular do câncer com o microambiente, entre outros. Tradicionalmente, as células são xenoenxertadas em camundongos imunocomprometidos, e isso continua sendo o padrão no campo. No entanto, este sistema modelo tem várias limitações, como alto custo, baixonúmero de réplicas, dificuldades em quantificar com precisão a carga tumoral in vivo, e o tempo prolongado que leva para que os tumores se enebrem e os testes medicamentosos sejam concluídos. Nos últimos anos, os zebrafish emergiram como um modelo alternativo de xenoenxerto, com o primeiro sendo relatado em 2005, com linhas de células de melanoma humano rotuladas como proteína sumária verde (GFP) transplantadas em embriões em estágio de blastula1,2. Mais recentemente, larvas de zebrafish pós-fertilização (dpf) de 2 dias têm sido utilizadas como receptores de xenoenxerto para permitir o controle da localização anatômica da injeção e para uso em imagens in vivo de alta resolução da interação tumoral com o microambiente circundante3,4.
Zebrafish oferecem muitas vantagens como modelo de xenoenxerto. Primeiro, os zebrafish adultos podem ser alojados e rapidamente criados em grandes quantidades a um custo relativamente baixo. Cada par de zebrafish adultos pode produzir centenas de peixes larvais por semana. Devido ao seu pequeno tamanho, esses zebrafish larvas podem ser mantidos em placas de 96 poços para triagem de drogas de alto desempenho. As larvas não devem ser alimentadas durante um experimento típico de xenoenxerto, pois sua gema-saca fornece os nutrientes para sustentá-las durante sua primeira semana de vida. Além disso, os zebrafish não têm um sistema imunológico totalmente funcional até 7 dpf, o que significa que eles não requerem irradiação ou regimes imunossupressores antes da injeção de xenoenxerto. Finalmente, linhas de zebrafish opticamente claras permitem imagens de alta resolução de interações tumorais-microambientes.
Talvez a aplicação mais promissora do zebrafish como modelo de xenoenxerto seja a capacidade de realizar o rastreamento de drogas de alto rendimento em amostras de câncer humano de uma maneira que não é possível usando qualquer outro organismo modelo. As larvas absorvem drogas da água através da pele, aumentando a facilidade da administração de medicamentos5. Como os animais são mantidos em placas de 96 poços, tipicamente em 100-300 μL de água, as telas requerem quantidades menores de drogas em comparação com os camundongos. Atualmente, existem vários métodos diferentes para padronização e quantificação do efeito de drogas sobre a carga tumoral humana em zebrafish, alguns dos quais são mais práticos do que outros para escalar testes de drogas individuais para rastreamento de alto desempenho. Por exemplo, alguns grupos dissociam os peixes em suspensões unicelulares e quantificam as células tumorais rotuladas ou manchadas fluorescentemente por imagens individuais de gotículas da suspensão e quantificando fluorescência usando uma macro ImageJ semi-automatizada. Foi desenvolvido um método semi-automatizado de imagem de larvas inteiras em que os peixes larvais foram fixados em placas de 96 poços e imagem usando um microscópio fluorescente invertido antes do realinhamento de imagens compostas e quantificação de focos de células tumorais6. Ambos os ensaios são métodos bastante intensivos em trabalho para quantificação, o que tornou impraticável a triagem de drogas de alto desempenho em modelos de xenoenxerto de zebrafish.
Esta questão foi abordada pelo desenvolvimento da Tecnologia de Triagem Automatizada de Vertebrados (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e unidade de amostragem automatizada(Figura 1 e Tabela de Materiais),que é um método verdadeiramente automatizado para imagens de alto throughput de larvas de zebrafish7,8,9. Com esta unidade, os peixes são anestesiados, amostrados automaticamente a partir de uma placa de 96 poços, posicionados em um capilar e girados para a orientação do conjunto com base em uma preferência de usuário predefinida, imagem, e, em seguida, colocados de volta no mesmo poço de uma nova placa de 96 poços para estudos adicionais ou descartados. A combinação desta tecnologia de imagem com os xenoenxertos de zebrafish pode permitir a possibilidade de uma medicina personalizada que usa a triagem de medicamentos de alto nível de grandes bibliotecas de compostos medicamentosos contra tumores individuais de pacientes. Os xenoenxertos de zebrafish também oferecem um método de grande escala e baixo custo para testar tanto a toxicidade quanto a eficácia de novos compostos in vivo. Zebrafish pode ser usado como um passo de triagem preliminar antes de prosseguir para modelos de xenoenxerto de rato.
Desenvolvemos um fluxo de trabalho simplificado para xenoenxerção de células de leucemia primárias em zebrafish e realizando telas de medicamentos de alto rendimento com imagens e quantificação automatizadas, que podem ser aplicadas a qualquer outra célula tumoral primária do paciente ou linha celular cancerosa. Este fluxo de trabalho utilizou uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e uma unidade de amostragem automatizada para melhorar os métodos atuais de padronização e quantificação e oferece uma alternativa automatizada aos métodos anteriores e mais intensivos em mão-de-obra para quantificar a massa tumoral in vivo.
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Protocolo
Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da Universidade de Kentucky (protocolo 2015-2225). Amostras de pacientes foram coletadas no Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Kentucky (protocolo 44672). Todos os experimentos em animais realizados seguindo este protocolo devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do usuário.
1. Descongelamento de células de leucemia linfoblástica aguda do paciente primário
- Descongele as células mononucleares periféricas do paciente primário (PBMCs) do estoque congelado em um banho de água de 37 °C. Imediatamente após as células terem descongelado, transfira as células em sua mídia de congelamento (90% FBS + 10% de sulfóxido de dimetila [DMSO]) para um tubo cônico de 15 mL com pipetação lenta, evitando bolhas de ar. Adicione 10 mL de mídia de descongelamento pré-aquecida de 37 °C (25% de soro bovino fetal [FBS] no meio de Dulbecco modificado de Iscove [IMDM]) dropwise (aproximadamente 2-3 s por mL) às células no tubo cônico de 15 mL.
NOTA: Os PBMCs foram coletados a partir de amostras de sangue de pacientes no momento do diagnóstico. A camada buffy foi separada por centrifugação de densidade e as células foram lavadas 2x em RPMI 1640 + 10% FBS. As células foram contadas e 107 células foram congeladas por criovial em 1 mL de mídia congelante, e armazenadas a -80 °C. - Células centrífugas a 100 x g por 10 min e mídia aspirada da pelota celular. Repita a adição de mídia de degelo, centrifugação e aspiração de um tempo adicional para remover qualquer DMSO residual.
- Resuspender as células em 5 mL de solução salina tamponada por fosfato (PBS) e remover 10 μL para contar com um contador celular automatizado ou hemocytometer. Adicione 10 μL de trippan azul a 10 μL de células removidas para contagem. Contagem número de células por mL e registro para posteriormente calcular o volume para resuspender células para xenoenxerto (ver passo 2.5).
NOTA: Normalmente, 500 células são xenografadas por zebrafish larval. Por exemplo, 5 x 105 células são necessárias para injetar 1.000 zebrafish. A viabilidade deve ser de >85% de uso para xenoenxerto. Neste experimento, a viabilidade celular foi de 96% após o descongelamento, avaliada pela coloração azul trypan.
2. Células de rotulagem fluorescente com DiI
- Centrifugar o número de célula desejado em 5 mL de PBS a 200 x g por 5 min e aspirar sobrenadante. Manche no mínimo 2 x 106 células em caso de desabar ou problemas de carga da agulha durante a injeção.
- Fazer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbociananatona solução (DiI) solução de coloração (5 mL de PBS contendo 4 μL por mL de mancha DiI, Tabela de Materiais) e resuspender a pelota celular na solução de coloração.
NOTA: A densidade celular não deve exceder 2 x 106 células/mL quando ressuspensa na solução de coloração. - Incubar células a 37 °C protegidas da luz por 20 min, vórtice suavemente, em seguida, incubar células no gelo por 15 min protegidos da luz.
- Células centrífugas a 200 x g por 5 min e aspiram sobrenadante. Lave células com 5 mL de PBS, centrífuga a 200 x g por 5 min e aspirando sobrenadante. Repita a lavagem, a centrifugação e a aspiração mais uma vez.
- Resuspender células em 1 μL de PBS por 250.000 células vivas e transferir para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Mantenha as células resuspensas no gelo no escuro e imediatamente continue com microinjeções.
NOTA: Isso garante que 500 células do paciente sejam injetadas no zebrafish com cada bomba de injeção de 2 nL de volume.
3. Larvas zebrafish microinjetadas
NOTA: As microinjeções devem ser concluídas dentro de 1-3 h de coloração para melhorar a viabilidade das células.
- Antes de colorir células e injetar, faça placas de agarose para injetar, despejando 25 mL de 3% de agarose em 1x Tris/borate/EDTA (TBE) em uma placa de Petri e permita que ela se solidifique. Guarde as placas a 4 °C por até 2 semanas.
- Também antes de manchar células e injetar, dechoriona2 dpf zebrafish usando fórceps sob um microscópio dissecando. Para descolinação manual, puxe de extremidades opostas do chorion protetor do peixe-zebra com fórceps até que o chorion rasga e o zebrafish fica sem envolta10.
NOTA: A descolinanação também pode ser realizada usando tratamento enzimático com pronase, como descrito anteriormente10. Casper (roy-/-;nacre-/-) zebrafish foram usados para estes experimentos11. Qualquer cepa larval de zebrafish pode ser usada para xenoenxerto. Se o pigmento interferir com a imagem ou visualização, o tratamento proilacílico (PTU) pode ser usado para bloquear a síntese de melanina se as cepas de zebrafish opticamente claras não estiverem disponíveis12. - Agulhas de pré-calafrio a 4 °C ou no gelo para evitar o aglutinamento das células durante a microinjeção. Carregue 5 μL de células manchadas em uma agulha de vidro borosilicato não ficondicional refrigerada usando pontas de pipeta de microcarregador.
NOTA: Os métodos de configuração de microinjetores e agulhas foram publicados anteriormente13. - Coloque a agulha no braço do microinjetor. Chanfrar a ponta da agulha usando uma lâmina de barbear estéril. Meça o tamanho da gotícula em óleo mineral usando um micrômetro de estágio, mantendo o volume de gotículas consistentemente a 2 nL (~0,15 mm de diâmetro) ao longo de todo.
- Use 350 μL de 4 mg/mL tricaine-S para anestesiar ~30 zebrafish dechorionados 2 dpf em uma placa de Petri contendo 25 mL de mídia E3. Após ~1 min, as larvas anestesiadas transferem para uma placa de injeção de superfície plana (3% de agarose em uma placa de Petri) e injetem larvas com uma bomba de células manchadas no local de injeção desejado (por exemplo, a gema ou o pericárdio; veja a Figura 2A,B).
NOTA: O local da injeção deve ser escolhido com base no objetivo do experimento. O local de injeção mais comum é a gema. Para obter células circulando na corrente sanguínea, o pericárdio, o ducto de Cuvier, o espaço perivitelline ou o espaço retro-orbital podem ser usados como locais de injeção. Locais de injeção ortotópica também podem ser usados, como o cérebro. - Lave as larvas da placa de injeção em uma placa de Petri de 10 cm2 (30 larvas por placa) contendo a mídia E314 sem azul de metileno e incubada a 28 °C durante um período de recuperação de 1 h. Continue injetando até que um número desejado de larvas tenha sido injetado.
NOTA: Idealmente, injete 2-2,5 vezes o número de larvas necessárias para experimentos. Haverá alguma morte de larvas devido ao estresse da injeção e ao aumento da temperatura de incubação. Normalmente, após a prática com a técnica, 800-1.500 larvas de zebrafish podem ser injetadas por uma única pessoa dentro de 1-3 h quando as células manchadas devem ser injetadas. - Mova as placas de larvas injetadas para uma incubadora de 34 °C. Não coloque as placas de Petri das larvas diretamente em uma prateleira metálica na incubadora para evitar o superaquecimento da água E3. Por exemplo, coloque uma placa de Petri vazia entre a prateleira e a placa de Petri de larvas para agir como um tampão. Remova as larvas de zebrafish mortas após 24 e 48 horas após a injeção (hpi).
4. Configuração da tela de drogas com zebrafish xenografados
-
A 48 hpi, larvas de zebrafish de tela para enxerto de fluorescência/tumor e saúde (Figura 2C,D). Remova qualquer zebrafish morto ou malformado e selecione zebrafish com enxerto semelhante(Figura 2C,D, 1−3 e 1'−3'). Remova o zebrafish não enxertado(Figura 2C,D, 5 e 5').
- Para peixes injetados com gema, remova os peixes onde as bordas da gema não podem ser vistas ao redor da massa celular enxertada (Figura 2C, 4) pois dificulta a quantificação. Para peixes injetados com pericárdio, remova os peixes onde a massa celular injetada invade o saco de gema(Figura 2D, 4').
- Adicione zebrafish a um prato de 96 poços. Para isso, corte a ponta de uma ponta de pipeta de 200 μL, apenas grande o suficiente para um zebrafish de 4 dpf para caber. Aspirar 150 μL de mídia E3 com um zebrafish da placa usando uma pipeta P200, e adicionar a um poço vazio de uma placa de 96 poços de fundo plano.
- Diluir a droga a ser testada no volume necessário de mídia E3, a 150 μL por poço. Prepare a droga a 2 vezes a concentração desejada. Por exemplo, prepare 20 μM de droga em E3 se a concentração final desejada for de 10 μM, uma vez que metade do volume total em cada poço é composta pela solução da droga. Para o grupo de controle DMSO, adicione DMSO no mesmo volume que a droga.
- Adicione 150 μL de solução de droga diluída 2x a cada poço contendo larvas de zebrafish em 150 μL de E3, para um volume final de 300 μL com 1x solução de droga por poço.
- Incubar a placa a 34 °C. Verifique se há zebrafish mortos diariamente. Após 2 dias, se desejar, atualize a droga removendo 200 μL de líquido de cada poço da placa de 96 poços e substituindo por 200 μL de 1x de solução de droga diluída ou DMSO em mídia E3.
NOTA: Os melhores resultados foram encontrados após 3 dias de tratamento medicamentoso para este experimento; no entanto, o tempo de tratamento medicamentoso pode variar entre 2-4 dias e pode precisar ser otimizado com base no experimento que está sendo feito ou drogas sendo usadas.
5. Zebrafish xenoenxertado de imagem usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e unidade de amostrador automatizado
- Prepare 1 L de tricaine fresco de 4 mg/mL e 1,5 L de mídia E3. Encha a garrafa de mídia 1 com a mídia E3 e a garrafa de mídia 2 com tricaine.
- Remova todos os canais fluorescentes indesejados no software de imagem e adicione o canal desejado (DiI para este experimento). Verifique o canal fluorescente desejado, pois uma imagem só será tirada para os canais com uma marca de seleção. Além disso, selecione como as imagens serão tiradas (pilhas z, automação, loops em série, etc.).
NOTA: Para este experimento, o foco foi definido manualmente para cada peixe imagemdo para obter o maior número de imagens com foco ideal. - Imagem do dmso controle peixe antes do peixe tratado com drogas para que o tempo de exposição apropriado possa ser definido no software de imagem. Uma vez definida a exposição, não altere o tempo de exposição durante a duração do experimento.
NOTA: O foco pode ser ajustado manualmente para cada zebrafish para garantir que não haja imagens fora de foco, ou para imagens totalmente automatizadas, o mesmo foco pode ser usado entre peixes com imagens fora de foco sendo descartadas ou peixes recapturados antes da realização da análise. Além disso, este experimento poderia ser conduzido usando qualquer imager fluorescente seguido de quantificação de fluorescência usando o software ImageJ.
6. Quantificar fluorescência usando imagej
- Abra o software ImageJ.
-
Ir para Arquivo | Abra e selecione o arquivo .czi desejado. O software trará uma janela de opções de importação.
- Para visualização em pilha selecionar Hyperstacks,verifique Arquivos abertos individualmente,verifique autoescalae verifique 'Canais divididos. Para a opção de cor, selecione Colorized.
- Clique em Plugins | Macros | Registro.
- Clique em Imagem | Ajuste | Limiar. Selecione o tipo de imagem como vermelho no menu suspenso no lado direito da janela de limiar. Ajuste o limiar mínimo até que o software esteja apenas destacando áreas com fluorescência(Figura 3A)e clique em Aplicar. O software converterá a foto em preto e branco, com a área selecionada em preto.
NOTA: Use o mesmo limiar para cada imagem na tela da droga para manter os resultados padronizados e comparáveis. - Clique em Analisar | Medida. O software puxará uma janela de resultados contendo a área fluorescente para essa imagem.
- Clique em Criar na janela Gravador de macro. Isso abrirá uma nova janela com o código para a macro. Destaque todas as imagens desejadas para análise e abertas como na etapa 6.2.
- Selecione Executar na janela com a macro. A janela de resultados agora conterá a área para cada imagem.
NOTA: A análise de imagem pode ser feita individualmente sem gravar e executar uma macro, bem como repetindo as etapas acima para cada imagem. - Copie os dados medidos em uma planilha. Média da fluorescência total de todas as amostras de controle (DMSO). Calcule a diferença percentual usando a seguinte fórmula: –[(área média de DMSO – área experimental)/área DMSO média] x 100%(Figura 3B).
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Resultados
Seguindo o protocolo descrito acima, os zebrafish foram xenoenxertados na gema e no pericárdio com PBMCs de pacientes primários que foram originalmente isolados de um paciente com leucemia linfoblástica aguda t-célula (T-ALL) no diagnóstico e bancado como uma amostra viável e congelada. Aos 48 hpi, os peixes xenoenxertos foram rastreados para células tumorais fluorescentemente rotuladas(Figura 2C,D) e tratados com quimioterapia (dexametasona ou vincristina) ou DMSO. Os peixe...
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Discussão
Neste estudo, demonstramos um método padronizado para descongelamento e injeção de células primárias de leucemia em zebrafish como modelo de xenoenxerto. Também estabelecemos um protocolo para a triagem de drogas de alto custo de peixe-zebra xenoenxertado usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência e unidade de amostragem automatizada. Anteriormente, os xenoenxertos foram relatados com linhas de células humanas, e a quantificação de tumores xenografados de forma de alto nível tem sido um desafi...
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por um V Foundation V Scholar Award e NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (para J.S. Blackburn) e NIH Training Grant T32CA165990 (para M.G. Haney).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x TBE Concentrado Líquido | VWR | 0658-5L | |
| Placa de 96 poços, fundo plano | CELLTREAT | 229195 | VAST é compatível com uma variedade de placas padrão ou profundas de 24, 48 ou 96 poços |
| Gás Capilar | de Vidro | Fisher Scientific BP160-500 | |
| sem Filamento | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexametasona | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Pontas de Microcarregador Femtotips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Soro Bovino (Inativado por Calor Premium) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | |
| Meio modificado de Dulbecco de Iscove | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Amostrador de partículas grandes (LP) | União Biometrica | N/A | unidade de amostrador automatizada http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Metotrexato | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Óleo Mineral | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Micrômetro de Estágio (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/ Uma | unidade de imagem microscópica equipada com fluorescência https://www.unionbio.com/vast/ |
| Sulfato de vincristina | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
Referências
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Reimpressões e permissões
