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Artigo de método

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

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DOI:

10.3791/60998

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9 de abril de 2020

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1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Resumo

Culturas celulares bidimensionais (2D) não imitam o crescimento do tumor in vivo de forma satisfatória. Assim, foram desenvolvidos modelos esferóides de cultura tridimensional (3D). Esses modelos podem ser particularmente importantes no campo da neuro-oncologia. De fato, tumores cerebrais têm a tendência de invadir o ambiente cerebral saudável. Descrevemos aqui em um ensaio 3D baseado em glioblastoma baseado em esferóide sheroide que desenvolvemos para estudar a invasão de tumores. Fornecemos todos os detalhes técnicos e ferramentas analíticas para realizar este ensaio com sucesso.

Introdução

Na maioria dos estudos usando linhas celulares primárias ou comercialmente disponíveis, os ensaios são realizados em células cultivadas em superfícies plásticas como culturas de monocamada. Gerenciar a cultura celular em 2D representa desvantagens, pois não imita um ambiente celular in vivo 3D. Em culturas 2D, toda a superfície celular está diretamente em contato com o meio, alterando o crescimento celular e modificando a disponibilidade de medicamentos. Além disso, a superfície plástica não fisiológica desencadeia a diferenciação celular1. Modelos de cultura tridimensional foram desenvolvidos para superar essas dificuldades. Eles têm a vantagem de imitar a arquitetura multicelular e a heterogeneidade dos tumores2, e, portanto, poderiam ser considerados um modelo mais relevante para tumores sólidos3. A morfologia complexa dos esferóides contribui para avaliar melhor a penetração e resistência da droga4. A heterogeneidade tumoral no esferóide impacta a difusão de oxigênio e nutrientes, e a resposta aos agentes farmacológicos (Figura 1A). A difusão de oxigênio é alterada quando o tamanho esferoide atinge 300 μm, induzindo um ambiente hipóxico no centro do esferóide(Figura 1A,C). Os metabólitos também são menos penetrantes através das camadas celulares e as reações metabólicas compensatórias ocorrem5. Quando o diâmetro do esferóide aumenta, núcleos necrosados podem ser observados, imitando ainda mais características encontradas em muitos cânceres sólidos, incluindo o agressivo glioblastoma de câncer cerebral (GBM)6.

Vários ensaios de invasão 2D ou 3D para glioblastoma foram relatados na literatura7,8. Ensaios bidimensionais são principalmente para estudar a invasão em um plano horizontal em uma fina camada de matriz ou em um ensaio de câmara de Boyden9. Ensaios tridimensionais foram descritos com culturas esferóides 3D usando linhas celulares glioblastoma clássicas10. Variantes mais complexas são representadas pela invasão de organóides cerebrais por esferóides tumorais em culturas de confronto11. No entanto, ainda é importante desenvolver um ensaio fácil de usar e reprodutível disponível para qualquer laboratório. Desenvolvemos um protocolo para gerar células-tronco de glioblastoma a partir de amostras de pacientes. A quantificação desses ensaios é facilmente gerenciável e requer apenas software on-line de acesso aberto. Resumidamente, os pedaços do tumor são cortados em pequenos pedaços e digeridos enzimticamente. As células únicas derivadas da digestão são cultivadas em meio neurobasal. Após 4-7 dias, estruturas esferóides formam-se espontaneamente. Após a implantação intracraniana em modelos de camundongos, formam tumores exibindo um núcleo necrosado cercado por células pseudo-palisading12. Isso se assemelha muito às características encontradas em pacientes GBM.

Neste artigo, descrevemos nosso protocolo de produção de esferóides a partir de um determinado número de células para garantir a reprodutibilidade. Duas matrizes complementares podem ser utilizadas para este fim: Matrigel e colágeno tipo I. Matrigel é enriquecido em fatores de crescimento e imita a membrana basal mamífera necessária para o apego celular e migração. Por outro lado, o colágeno tipo I, um elemento estrutural do estroma, é a matriz extracelular fibriária mais comum e é usado em ensaios de invasão celular. Aqui, ilustramos nosso modelo esferóide GBM realizando ensaios de migração e proliferação. A análise foi feita não apenas em pontos de tempo fixo, mas também por monitoramento da expansão esferóide e movimento celular por imagem ao vivo. Além disso, a microscopia eletrônica foi feita para visualizar detalhes morfológicos.

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Protocolo

O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com as regulamentações do comitê de ética local). Nosso protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.

1. Geração de esferóides tumorais de tamanho uniforme

NOTA: As células-tronco são cultivadas em meio neurobasal complementado com suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito nos artigos anteriores12. Essas células formam espontaneamente esferóides na cultura.

  1. Lave as células tumorais com soro torário tamponado de 5 mL (PBS) e incubar as células com enzima de dissociação de 0,5-1 mL (ver Tabela de Materiais) por 5 minutos a 37 °C.
  2. Lave com PBS de 4-4,5 mL e adicione 10 mL do meio de crescimento completo (meio neurobasal completo, cNBM).
  3. Conte as células usando uma técnica de contagem automática com trypan azul e um slide de câmara de contagem de células.
  4. Para gerar 100 esferóides com 104 células por esferoide (de acordo com o tamanho preferencial), misture 106 células em 8 mL de NBM com 2 mL de 2% de metilcelulose.
  5. Transfira a suspensão para um recipiente de sistema estéril e dispense 100 μL/poço com uma pipeta multicanal em uma placa inferior redonda de 96.
  6. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade. Esferóides de tamanho igual formarão e poderão ser usados após 3-4 dias.

2. Experimentos tridimensionais

  1. Proliferação
    1. Preparação
      1. Suspender inibidores (por exemplo, rotenona como na Figura 4A) e produtos químicos em 100 μL de médio e adicionar aos 100 μL de meio em cada poço (ou seja, um esferoide por poço).
      2. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2e 95% de umidade.
    2. Aquisição e análise de imagens
      1. Tire fotos com um microscópio de vídeo em brightfield para criar uma série de condições em T0 e os seguintes tempos esperados.
      2. Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe um círculo em torno do núcleo esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área de cada esferóide. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, use a macro mostrada no Documento Complementar 1 apenas com área //Núcleo.
  2. Invasão
    1. Preparação
      1. Prepare a matriz de colágeno em um tubo no gelo com colágeno tipo I a 1 mg/mL de concentração final, 1x PBS, 0,023xVde colágeno,1 M de hidróxido de sódio e H2O. Estéreo Incubar a solução no gelo por 30 min.
      2. Coletar esferóides da placa do poço de fundo redondo em tubos de 500 μL e lavar 2x com 200 μL 1x PBS.
      3. Pipa os esferóides cuidadosamente em 100 μL da matriz de colágeno e inserir no centro de um poço em 96 placas normais de poço.
      4. Incubar o gel de colágeno por 30 min a 37 °C e, em seguida, adicionar cNBM em cima do gel. Inibidores ou ativadores (por exemplo, cloreto de hidrogênio como mostrado na Figura 4B, 4C) podem ser adicionados ao meio nesta etapa.
    2. Aquisição e análise de imagens
      1. Tire fotos sequencialmente com um microscópio de vídeo no modo brightfield 24 h após a inclusão de colágeno.
      2. Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe ao redor do núcleo e da área total do esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área invasiva de cada esferóide subtraia a área total com a área central. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, utilize a macro conforme indicado no Documento Complementar 1 para determinar a área invasiva.
  3. Migração
    1. Preparação
      1. Cubra uma placa de 6 poços com Matrigel (0,2 mg/mL) em NBM por 30 min a 37 °C, depois retire o Matrigel e adicione 2 mL de cNBM.
      2. Transfira os esferóides para 50 μL de cNBM da placa do poço de fundo redondo para a placa de 6 poços.
      3. Incubar a placa a 37 °C e esperar 30 min para que os esferóides aderem.
      4. Após 24 h de incubação, manche com 10 ng/mL de Hoechst e incubação de 30 min a 37 °C.
    2. Aquisição e análise de imagens
      1. Obter imagens usando um microscópio de vídeo em brightfield. Um laser de 405 nm é usado para visualização da coloração de Hoechst.
      2. Use o software Fiji para analisar imagens e executar a macro conforme indicado no Documento Complementar 1.
        NOTA: Tocar na parte inferior do poço ou remover completamente o sobrenadante danifica os esferóides. Para o manuseio de gel tipo colágeno I, mantenha o gel no gelo para evitar a polimerização do colágeno, não adicione um componente ácido porque a mudança no pH afetará a compactação do gel, e as células de pipeta rapidamente no colágeno para evitar a morte celular e a degradação do gel.

3. Fiji Macro

NOTA: Fiji é um programa de análise de imagens desenvolvido em domínio público que permite o desenvolvimento de macros para acelerar a análise de imagens. A análise manual também é possível, mas este é um processo lento e pode introduzir vieses. As imagens podem ser importadas por arrastar e soltar no software e quantificadas com o plugin ROI Manager Tools. O procedimento utilizado neste estudo é descrito abaixo:

  1. Abra a janela de macro: Plugins | Macros | Intérprete Interativo.
  2. Copie e cole o seguinte laço roxo adaptado. Mantenha as frases roxas e adicione as frases verdes de interesse (Documento Complementar 1).
  3. Para analisar toda a série, ajuste os parâmetros em vermelho para uma quantificação específica e execute a macro usando Macros | Executar macro ou pressionar Ctrl+R.
  4. Verifique e, se necessário, adapte manualmente a região de interesse (ROI).

4. Microscopia eletrônica de esferóides

NOTA: A maioria das etapas a seguir deve ser feita em uma coifa química.

  1. Etapa de fixação
    1. Recolhado o esferóide com uma ponta de pipeta cortada, coloque-o em um tubo de 1,5 mL e lave 1x com tampão de fosfato de 0,1 M (PB).
    2. Fixar o esferóide durante a noite a 4 °C em 2% de glutaraldeído/2% de paraformaldeído (PFA) em 0,1 M PB.
    3. Substitua a solução de fixação por uma solução de 1% de PFA em 0,1 M PB seguida de preparação da amostra.
  2. Preparação da amostra
    1. Transfira os esferóides para um coador e coloque-os em um copo de vidro, a fim de evitar danos esferóides.
    2. Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.
    3. Incubar com ósmio por 2 h no escuro. Diluir o ósmio para 4% em 1% de tampão PB de 0,1 M.
    4. Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.
      1. Desidratar da seguinte forma: mergulhe em 50% de etanol por 10 min, 70% de etanol por 10 min, 2x 90% de etanol por 15 min, 2x 100% de etanol por 20 min e 2x de acetona por 30 min.
    5. Incubar as amostras em uma mistura de acetona/resina 50/50 por 2 h. Durante esta etapa, prepare a resina EPON (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
    6. Descarte a mistura acetona/resina, substitua por resina recém-preparada e incuba durante a noite.
    7. Substitua a resina por uma nova e incuba entre 2-6 h.
    8. Adicione os esferóides na resina em um molde a 60 °C por 48-72 h.

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Resultados

Os esferóides foram preparados conforme descrito na seção de protocolos e observações foram feitas sobre migração, invasão, proliferação e microscopia. Para medir a hipóxia em áreas distintas da estrutura esférica, utilizou-se a coloração da anidraIX carboxica para determinar a atividade hipóxica(Figura 1A-C). Mais células CAIX positivas foram observadas no centro esferóide (Figura 1A-C). Células...

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Discussão

Os ensaios esferóides tumorais são bem adaptados para estudar características tumorais, incluindo proliferação, invasão e migração, bem como morte celular e resposta a medicamentos. As células cancerígenas invadem a matriz 3D formando um microtumor invasivo, como visto na Figura 4B,C. Durante o processo invasivo, as matrizes de metaloproteinases matriciais (MMP) digerem matrizes ao redor das células tumorais13, e os inibidores de MMP (por exemplo, GM6...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon é bolsista do Hospital Universitário de Toulouse (CHU Toulouse).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de fundo redondo de 96 poçosFalcon08-772-212
AccutaseGibcoA11105-01Armazenado a 4 ° C, enzima de dissociação de esfera
B27Gibco12587Armazenado a -20 ° C, descongele antes de usar
Fator de Crescimento Básico de FibroblastosPeprotech100-18BArmazenado a -20 ° C, descongele antes
de usar Lâminas de Câmara de Contagem de Células CountessInvitrogenC10283
DPBS 10XPan BiotechP04-53-500Armazenado a 4 ° C
Fiji softwareImageJUsado para analisar imagens
Frasco 75 cm2Falcon10497302
MatrigelCorning354230Armazenado a -20 ° C, diluído a uma concentração final de 0,2 mg/mL em frio NBM
MetilceluloseSigmaM0512Diluído em NBM para uma concentração final de 2%
NBMGibco21103-049Armazenado a 4 &graus; C
Meio neurobasalGibco21103049Armazenado a 4 ° C
Penicilina - EstreptomicinaGibco15140-122Armazenado a 4 ° C
Trypan azul 0,4%ThermoFisherT10282Usado para contagem de células
Tipo I colágenoCorning354236armazenado a 4 ° O

Referências

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