Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.
Artigo de método
Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.
Culturas celulares bidimensionais (2D) não imitam o crescimento do tumor in vivo de forma satisfatória. Assim, foram desenvolvidos modelos esferóides de cultura tridimensional (3D). Esses modelos podem ser particularmente importantes no campo da neuro-oncologia. De fato, tumores cerebrais têm a tendência de invadir o ambiente cerebral saudável. Descrevemos aqui em um ensaio 3D baseado em glioblastoma baseado em esferóide sheroide que desenvolvemos para estudar a invasão de tumores. Fornecemos todos os detalhes técnicos e ferramentas analíticas para realizar este ensaio com sucesso.
Na maioria dos estudos usando linhas celulares primárias ou comercialmente disponíveis, os ensaios são realizados em células cultivadas em superfícies plásticas como culturas de monocamada. Gerenciar a cultura celular em 2D representa desvantagens, pois não imita um ambiente celular in vivo 3D. Em culturas 2D, toda a superfície celular está diretamente em contato com o meio, alterando o crescimento celular e modificando a disponibilidade de medicamentos. Além disso, a superfície plástica não fisiológica desencadeia a diferenciação celular1. Modelos de cultura tridimensional foram desenvolvidos para superar essas dificuldades. Eles têm a vantage....
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O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com as regulamentações do comitê de ética local). Nosso protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.
1. Geração de esferóides tumorais de tamanho uniforme
NOTA: As células-tronco são cultivadas em meio neurobasal complementado com suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito nos artigos anteriores12. Essas células formam espontaneamente esferóides na cultura.
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Os esferóides foram preparados conforme descrito na seção de protocolos e observações foram feitas sobre migração, invasão, proliferação e microscopia. Para medir a hipóxia em áreas distintas da estrutura esférica, utilizou-se a coloração da anidraIX carboxica para determinar a atividade hipóxica(Figura 1A-C). Mais células CAIX positivas foram observadas no centro esferóide (Figura 1A-C). Células.......
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Os ensaios esferóides tumorais são bem adaptados para estudar características tumorais, incluindo proliferação, invasão e migração, bem como morte celular e resposta a medicamentos. As células cancerígenas invadem a matriz 3D formando um microtumor invasivo, como visto na Figura 4B,C. Durante o processo invasivo, as matrizes de metaloproteinases matriciais (MMP) digerem matrizes ao redor das células tumorais13, e os inibidores de MMP (por exemplo, GM6.......
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Este trabalho foi apoiado pela Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon é bolsista do Hospital Universitário de Toulouse (CHU Toulouse).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de fundo redondo de 96 poços | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Armazenado a 4 ° C, enzima de dissociação de esfera |
| B27 | Gibco | 12587 | Armazenado a -20 ° C, descongele antes de usar |
| Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos | Peprotech | 100-18B | Armazenado a -20 ° C, descongele antes |
| de usar Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Armazenado a 4 ° C |
| Fiji software | ImageJ | Usado para analisar imagens | |
| Frasco 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Armazenado a -20 ° C, diluído a uma concentração final de 0,2 mg/mL em frio NBM |
| Metilcelulose | Sigma | M0512 | Diluído em NBM para uma concentração final de 2% |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Armazenado a 4 &graus; C |
| Meio neurobasal | Gibco | 21103049 | Armazenado a 4 ° C |
| Penicilina - Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Armazenado a 4 ° C |
| Trypan azul 0,4% | ThermoFisher | T10282 | Usado para contagem de células |
| Tipo I colágeno | Corning | 354236 | armazenado a 4 ° O |
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