Palmitoilação implica a incorporação de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína de proteínas alvo de forma reversível. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse em lysatos cerebrais de camundongos.
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Artigo de método
Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral
Neste artigo
Resumo
Resumo
Acredita-se que alterações dependentes da atividade nos níveis de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro da densidade postynaptic (PSD) representem um mecanismo celular para aprendizagem e memória. Palmitoilação regula a localização e a função de muitas proteínas sinápticas, incluindo AMPA-Rs, fatores auxiliares e andaimes sinápticos de forma dependente da atividade. Identificamos a família de genes induzidos por diferenciação sinapse (SynDIG) de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs e regulam a força da sinapse. SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de cisteína localizados nas posições 191 e 192 na região justxta-transmembrana importante para o desenvolvimento da sinapse excitatória dependente da atividade. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse e demonstrar sua utilidade com a família SynDIG de proteínas em lysates cerebrais de camundongos.
Introdução
S-palmitoylation é uma modificação pós-translacional reversível de proteínas-alvo que regula a associação estável de membranas, tráfico de proteínas e interações proteína-proteína1. Envolve a adição de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína via ligação thioester catalisado por enzimas palmitoxil aciltransferase (PAT). Muitas proteínas sinápticas no cérebro são palmitoiladas, incluindo AMPA-Rs e PSD-95, de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função2,3,4. Alterações nos níveis de AMPARs sináptic....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais seguiram as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis.
1. Preparação de membranas cerebrais do camundongo
- Decapitar o rato usando um aparelho de guilhotina e dissecar o cérebro rapidamente (em <1 min, se possível, para minimizar as alterações de palmitoilação que podem ocorrer durante o procedimento de dissecção). Homogeneize imediatamente em 10 mL de tampão de homogeneização(Tabela 1)em um homogeneizador de vidro (~12 traços) no gelo.
- Linsa....
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Resultados
A imunoaspiração com anticorpos contra a proteína de interesse revela o estado palmitoylated (não, sozinho, duplamente, etc.) em lysatos cerebrais de camundongos determinados por mudança de mobilidade em comparação com amostras em que o HAM não foi incluído. Anteriormente, tínhamos demonstrado que o SynDIG1 foi palmitoilado em dois locais usando o ensaio ABE6; no entanto, não pudemos determinar se ambos os locais foram modificados no tecido cerebral. Aqui mostramos.......
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Discussão
Em nosso trabalho anterior, utilizamos o ensaio ABE para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Ciscos de justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. Uma limitação é que o ensaio ABE requer purificação de afinidade com resinas agaroseconjugadas aos moieties avidin como a etapa final do procedimento, resultando em perda significativa de sinal que complica mati.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a K. Woolfrey por conselhos e contribuições sobre o ensaio da APEGS. Esses estudos foram financiados por bolsas de pesquisa para a E.D. da Whitehall Foundation e do NIH-NIMH (1R01MH119347).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Hidroxilamina (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Metoxi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | ou equipamento equivalente |
| N-etilmalemida (NEM) | Calbiochem | 34115 | Altamente tóxico. |
| Gerador de imagens ópticas para densitometria | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | ou equipamento equivalente |
| Tubos de polipropileno com tampa | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Pipetas sorológicas (vidro) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Beckman | Allegra X-15R | ou equipamento equivalente | |
| Cloridrato de tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
Referências
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience.
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Reimpressões e permissões
