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Artigo de método

Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral

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DOI:

10.3791/61018

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29 de março de 2020

 , 
1Department of Pharmacology, UC Davis School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Palmitoilação implica a incorporação de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína de proteínas alvo de forma reversível. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse em lysatos cerebrais de camundongos.

Resumo

Acredita-se que alterações dependentes da atividade nos níveis de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro da densidade postynaptic (PSD) representem um mecanismo celular para aprendizagem e memória. Palmitoilação regula a localização e a função de muitas proteínas sinápticas, incluindo AMPA-Rs, fatores auxiliares e andaimes sinápticos de forma dependente da atividade. Identificamos a família de genes induzidos por diferenciação sinapse (SynDIG) de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs e regulam a força da sinapse. SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de cisteína localizados nas posições 191 e 192 na região justxta-transmembrana importante para o desenvolvimento da sinapse excitatória dependente da atividade. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse e demonstrar sua utilidade com a família SynDIG de proteínas em lysates cerebrais de camundongos.

Introdução

S-palmitoylation é uma modificação pós-translacional reversível de proteínas-alvo que regula a associação estável de membranas, tráfico de proteínas e interações proteína-proteína1. Envolve a adição de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína via ligação thioester catalisado por enzimas palmitoxil aciltransferase (PAT). Muitas proteínas sinápticas no cérebro são palmitoiladas, incluindo AMPA-Rs e PSD-95, de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função2,3,4. Alterações nos níveis de AMPARs sinápticas no PSD por interação de fatores auxiliares com andaimes sinápticos como o PSD-95 subjacentes à plasticidade sináptica; assim, métodos para determinar o estado de palmitoilação de proteínas sinápticas fornecem uma visão importante sobre mecanismos de plasticidade sináptica.

Anteriormente, identificamos a família SynDIG de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs5. A superexpressão ou derrubada do SynDIG1 em neurônios hipocampais de ratos dissociados aumenta ou diminui, respectivamente, o tamanho e o número da sinapse AMPA-R em ~50% conforme detectado usando imunocitoquímica e eletrofisiologia5. Utilizamos o ensaio de troca de acilina (ABE) para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Cisa justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. O ensaio ABE baseia-se na troca de biotina em cisteínas protegidas por modificação e posterior purificação de afinidade7. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS)8,,9,,10,,11,,12,que não requer purificação de afinidade e, em vez disso, utiliza mudanças na mobilidade do gel para determinar o número de modificações para uma proteína de interesse. O protocolo é descrito para investigação de proteínas endógenas de membrana do cérebro do camundongo para as quais anticorpos adequados estão disponíveis.

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Protocolo

Todos os procedimentos animais seguiram as diretrizes estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis.

1. Preparação de membranas cerebrais do camundongo

  1. Decapitar o rato usando um aparelho de guilhotina e dissecar o cérebro rapidamente (em <1 min, se possível, para minimizar as alterações de palmitoilação que podem ocorrer durante o procedimento de dissecção). Homogeneize imediatamente em 10 mL de tampão de homogeneização(Tabela 1)em um homogeneizador de vidro (~12 traços) no gelo.
  2. Linsatos de centrífuga saem por 15 min a 1.400 x g a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo no gelo. Ressuspensão da pelota (~6 traçados) em um volume igual de tampão de homogeneização e centrífuga a 710 x g por 10 min a 4 °C.
  3. Combine os sobrenatantes do passo 1.2 e centrífugas a 40.000 x g por 20 min a 4 °C.
  4. Descarte o sobrenadante (fração citossólica) e resuspenda a fração da membrana pelleted (P2) no tampão de homogeneização.
    NOTA: As amostras podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C para uso posterior.
  5. Realize um ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) para quantitar os níveis de proteína. Para o ensaio APEGS, comece com ~100-200 mgs de proteína (máximo de 250 mgs) em um volume de 470 μL de tampão A(Tabela 1)em um tubo de 1,5 mL. Sonicate e centrífuga em >13.000 x g por 10 min a 25 °C para remover proteína insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.

2. Ensaio de troca acil-PEGyl (APEGS)

  1. Interrompa as ligações de dissulfeto e bloqueie cisteínas livres.
    1. Interromper as ligações de dissulfeto incubando em 25 mM tris (2-carboxyethyl)fosfina (TCEP; 25 μL, adicionado a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) por 60 min a 55 °C.
    2. Bloquear cisteínas livres com N-etilmaleimida de 50 mM (NEM; 12,5 μL, adicionadas a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) em temperatura ambiente por 3 h.
      NOTA: A reação pode ser estendida durante a noite.
  2. Realizar precipitação de metanol clorofórmio (CM).
    1. Transfira a solução proteica de tubo de 1,5 mL para um tubo de polipropileno ou vidro que pode ser centrifugado em um rotor de balde balançando a uma velocidade modesta. Um tubo de 5 mL é ideal. Adicione quatro volumes (2 mL) de metanol (MeOH) e vórtice brevemente.
    2. Adicione dois volumes (1 mL) de clorofórmio e vórtice brevemente.
    3. Adicione três volumes (1,5 mL) de dH2O e vórtice brevemente.
    4. Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 30 min a 25 °C em um rotor de balde balançando.
    5. Remova cuidadosamente e descarte a fase superior.
    6. Adicione 3 volumes (1,5 mL) de MeOH e misture suavemente, mas cuidadosamente, tomando cuidado para não fragmentar a panqueca de proteína opaca.
    7. Centrifugação a 3.000 x g por 10 min a 25 °C em um rotor de balde balançando.
    8. Usando um tubo sorológico de vidro, remova o máximo possível da fase superior sem perturbar a panqueca de proteína.
    9. Enxágüe cuidadosamente a pelota com 1 mL de MeOH.
    10. Seque a pelota por pelo menos 10 min.
      NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C.
  3. Realizar decotes de ligações palmitoyl-thioester com hidroxilamina (NH2OH, HAM).
    1. Resuspender a proteína precipitar em 125 μL de tampão A e sônica brevemente. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C para remover material insolúvel. Transfira a proteína solubilizada para um novo tubo de 1,5 mL.
    2. Adicionar 375 μL de buffer H (HAM+; Tabela 1) ou tampão T (HAM-; Tabela 1) e incubar amostras para 60 min a 25 °C.
  4. Repita a precipitação cm descrita na etapa 2.2.
    NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C.
  5. Adicione mPEG a cisteínas desprotegidas.
    1. Ressuspensão da pelota em 100 μL de tampão A contendo 10 mM TCEP. Transfira para um tubo de 1,5 mL.
      NOTA: É normal que a perda significativa de proteína tenha ocorrido durante as etapas de precipitação de CM. Todas as etapas subseqüentes serão realizadas em um tubo de 1,5 mL, restringindo o volume de proteína a um máximo de ~120-130 μL. Isso reduzirá a perda de proteínadurante a precipitação final de CM.
    2. Adicionar 20 mM mPEG-5k (25 μL, adicionado a partir de uma solução de estoque; Tabela 1) à amostra de proteínas e mistura por pipetting. Incubar por 60 min a 25 °C com rotação de extremidade superior.
    3. Para remover mPEG-5k não incorporado, realize a precipitação cm conforme descrito na etapa 2.2 utilizando estes volumes ajustados: 4 volumes de MeOH (500 μL), 2 volumes de clorofórmio (250 μL) e 3 volumes de dH2O (375 μL). Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.
    4. Remova cuidadosamente a fase superior como antes, evitando a panqueca espessa e floculente. Adicione 1 mL de MeOH e misture delicadamente, mas completamente. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C.
    5. Retire cuidadosamente o sobrenadante e enxágue a pelota com 1 mL de MeOH. Centrifugação a >13.000 x g por 10 min a 25 °C. Pelota seca a ar.
      NOTA: A pelota seca pode ser armazenada a -20 °C.
    6. Ressuspensão da pelota seca em 50 μL de tampão A (sem TCEP ou qualquer agente redutor). Reserve 5 μL para quantificar proteína BCA. Após a quantificação, adicione uma quantidade apropriada de tampão de amostra de 4x Laemmli e, dependendo da proteína de interesse, potencialmente aqueça a amostra a 70-100 °C por 10 min.
      NOTA: A ebulição pode causar agregação de algumas proteínas de membrana.

3. Análise de manchas ocidentais de proteínas PEGylated

  1. Carregue a amostra em um gel de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecil de sódio13.
    NOTA: Neste protocolo foi utilizado 10% de poliacrilamida.
  2. Use protocolos padrão de separação, transferência e detecção para manchas ocidentais14.
  3. Use a densitometria14 para determinar as quantidades relativas de proteínas PEGylated versus nonPEGylated.

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Resultados

A imunoaspiração com anticorpos contra a proteína de interesse revela o estado palmitoylated (não, sozinho, duplamente, etc.) em lysatos cerebrais de camundongos determinados por mudança de mobilidade em comparação com amostras em que o HAM não foi incluído. Anteriormente, tínhamos demonstrado que o SynDIG1 foi palmitoilado em dois locais usando o ensaio ABE6; no entanto, não pudemos determinar se ambos os locais foram modificados no tecido cerebral. Aqui mostramos...

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Discussão

Em nosso trabalho anterior, utilizamos o ensaio ABE para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Ciscos de justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. Uma limitação é que o ensaio ABE requer purificação de afinidade com resinas agaroseconjugadas aos moieties avidin como a etapa final do procedimento, resultando em perda significativa de sinal que complica mati...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a K. Woolfrey por conselhos e contribuições sobre o ensaio da APEGS. Esses estudos foram financiados por bolsas de pesquisa para a E.D. da Whitehall Foundation e do NIH-NIMH (1R01MH119347).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hidroxilamina (HAM)ThermoFisher26103
Metoxi-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)NOFME-050MAMW ~5000 kDa
MicrofugeEppendorf5415Rou equipamento equivalente
N-etilmalemida (NEM)Calbiochem34115Altamente tóxico.
Gerador de imagens ópticas para densitometriaAzure BiosystemsSapphire Biomolecular Imagerou equipamento equivalente
Tubos de polipropileno com tampaFisher Scientific14-956-1D
Pipetas sorológicas (vidro)Fisher Scientific13-678-27D
BeckmanAllegra X-15Rou equipamento equivalente
Cloridrato de tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP)EMD Millipore580560
Centrífuga de mesa

Referências

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
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  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
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  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

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