Artigo de método

Ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para a detecção específica e rápida do vírus do lago tilápia

DOI:

10.3791/61025

⸱

18 de maio de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Faculty of Applied Science, King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB), 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, 3Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, 4Department of Chemical and Process Engineering, The Sirindhorn Thai-German International Graduate School of Engineering (TGGS), King Mongkut's University of Technology North Bangkok (KMUTNB)

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um ensaio RT-LAMP para a detecção de TiLV em peixes de tilápia usando instrumentos simples durante um período relativamente curto de tempo em comparação com as técnicas convencionais de RT-PCR. Este protocolo pode ajudar a controlar a propagação epidêmica do TiLVD, especialmente nos países em desenvolvimento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença do vírus do lago tilápia (TiLVD), uma doença viral emergente na tilápia causada pelo vírus do lago tilápia (TiLV), é um desafio persistente na indústria da aquicultura que resultou na morbidade e mortalidade em massa da tilápia em muitas partes do mundo. Um ensaio diagnóstico eficaz, rápido e preciso para a infecção por TiLV é, portanto, necessário para detectar a infecção inicial e prevenir a propagação da doença na aquicultura. Neste estudo, um método de amplificação isotérmica mediada em loop de transcrição reversa altamente sensível e prática (RT-LAMP) é apresentado para detectar o vírus do lago tilápia no tecido dos peixes. A comparação dos ensaios RT-qPCR e RT-LAMP das amostras infectadas revelou resultados positivos em 63 (100%) e 51 (80,95%) amostras, respectivamente. Além disso, uma análise das amostras não infectadas mostrou que todos os 63 tecidos não infectados apresentaram resultados negativos tanto para os ensaios RT-qPCR quanto RT-LAMP. A reatividade cruzada com cinco patógenos na tilápia foi avaliada por rt-lamp, e todos os testes mostraram resultados negativos. Tanto as amostras de fígado quanto de muco obtidas de peixes infectados apresentaram resultados comparáveis usando o método RT-LAMP, sugerindo que o muco pode ser usado em RT-LAMP como um ensaio não letal para evitar matar peixes. Em conclusão, os resultados demonstraram que o ensaio RT-LAMP apresentado fornece um método eficaz para detecção de TiLV em tecido de tilápia no prazo de 1h. Por conseguinte, o método é recomendado como ferramenta de triagem nas fazendas para o diagnóstico rápido do TILV.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença do vírus do lago tilápia (TiLVD) é uma doença viral na tilápia (Oreochromis spp.) que supostamente causa mortes por tilápia em muitas regiões do mundo, incluindo Ásia1,2, África e América. A doença foi reconhecida pela primeira vez durante a mortalidade em massa da tilápia em 2009 em Israel, onde o número de tilápiasilvestre no Lago Kinneret despencou drasticamente de 257 para 8 toneladas por ano2. A doença é causada pelo vírus do lago tilápia (TiLV), que foi atribuído à família Amnoonviridae como um novo gênero tilápide e uma nova espécie tilápide tilápide3. A caracterização genética do TiLV mostrou que o vírus é um novo vírus RNA de sentido negativo, de sentido único, que tem 10 segmentos codificando 10 proteínas1,2,4. Várias espécies de tilápia do gênero Sarotherodon, Oreochromis, tilapine e outros peixes de água quente (por exemplo, gourami gigante(Osphronemus goramy))mostraram-se suscetíveis ao TiLV2,5. Atualmente, esse vírus continua a se espalhar globalmente, possivelmente através do movimento de peixes vivos infectados6,7, enquanto o risco de transmissão viral através de tilápia congelada ou seu produto é limitado8. A mortalidade substancial por infecção por TiLV tem o potencial de ter um impacto econômico significativamente prejudicial na indústria da tilápia. Por exemplo, o impacto econômico da síndrome da mortalidade no verão no Egito associado à infecção por TiLV foi calculado em US$ 100 milhões9. Nesse meio tempo, é importante desenvolver um método de diagnóstico rápido e adequado para facilitar o controle dessa doença nas fazendas de peixes.

Até agora, o diagnóstico de TiLVD foi baseado em ensaios moleculares, isolamento viral e histopatologia. Diferentes protocolos de PCR e primers foram desenvolvidos para o diagnóstico tilv10,11. Por exemplo, um método de PCR quantitativo de transcrição reversa baseado em verde SYBR (RT-qPCR) com sensibilidade para detectar apenas duas cópias/μL do vírus foi desenvolvido e validado para detecção de TiLV10. Outros métodos de PCR para detecção de TiLV incluem o PCR quantitativo TaqMan11,RT-PCR2,o NS-PCR12aninhado e o RT-PCR13semi-aninhado . No entanto, esses métodos requerem equipamentos de laboratório sofisticados e períodos relativamente longos de tempo para produzir resultados devido à complexidade das reações, o que os torna inadequados para a aplicação em campo.

O ensaio de amplificação isotérmica (LAMP) mediado por loop é uma aplicação rápida, simples e prática para o campo14,15. A técnica emprega o princípio de uma reação de deslocamento de fios, enquanto a reação de amplificação corre sob condições isotérmicas sem um ciclo térmico sofisticado e caro14,15. Consequentemente, produtos LAMP amplificados ou produtos RT-LAMP são analisados em bandas semelhantes a escadas usando eletroforese de gel de agarose com uma mancha fluorescente para visualização segura de DNA ou RNA14 ou observação a olho nu para a presença de turbidez ou um precipitado branco16,17,18. Por essas razões, esta técnica tem sido utilizada para a detecção in loco de diferentes patógenos de peixes17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. O objetivo deste estudo foi estabelecer um ensaio RT-LAMP rápido, sensível e preciso para detecção de TiLV. O ensaio RT-LAMP oferece triagem para TiLV em amostras de peixes dentro de 30 min. A técnica pode ser aplicada para o diagnóstico e vigilância do TiLVD.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este experimento, que envolveu o uso de tecido animal, foi aprovado pelo Comitê De Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade de Kasetsart, Bangkok, Tailândia (número de protocolo ACKU61-VET-009).

1. Coleta de tecidos

  1. Eutanie peixes de tilápia usando uma overdose de óleo de cravo (ou seja, mais de 3 mL/L). Tricaine metanosulfonato pode ser usado como uma alternativa ao óleo de cravo.
  2. Use tesouras e fórceps de maionese estéreis para abrir o abdômen da tilápia pós-morte e extirpar aproximadamente 30-50 mg de tecido hepático, ou usando um vidro de cobertura de microscópio, coletar 100 μL de muco raspando a camada de pele do peixe longitudinalmente (de anterior a posterior) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Siga imediatamente para a etapa de extração de RNA ou mantenha a amostra coletada a −80 °C até o experimento. Como o RNA intacto é mais sensível que o DNA, use materiais e reagentes livres de RNase durante a extração de RNA.

2. Extração de RNA

  1. Para extrair o RNA do tecido hepático, adicione 30-50 mg do tecido da tilápia a um tubo de microcentrífuge de 1,5 mL contendo 600-1.000 μL de reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol(Tabela de Materiais),e pulverize a amostra até homogeneizar o tecidual manual. As amostras de tecido requerem aproximadamente 10% do reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol. Para as amostras de muco, utilize apenas 300 μL do reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol (3:1).
    ATENÇÃO: O reagente de extração de guanidínio-ácido-fenol é tóxico; portanto, o manuseio deve ser realizado com cuidado. Devem ser usados equipamentos de proteção, como óculos de segurança, vestido de laboratório e luvas de segurança.
  2. Centrifugar a amostra homogeneizada a 10.000 x g por 30 s à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
  3. Adicione um volume igual de 95% de etanol ao tubo e misture bem.
  4. Transfira a solução para uma coluna de giro (Tabela de Materiais) colocada em um tubo de coleta e centrífuga a 10.000 x g para 30 s em temperatura ambiente. Descarte o fluxo e transfira a coluna de giro para um novo tubo de coleta.
  5. Adicione 400 μL de reagente pré-lavagem de RNA(Tabela de Materiais)à coluna e centrífuga a 10.000 x g para 30 s em temperatura ambiente antes de descartar o fluxo. Repita este passo mais uma vez.
    NOTA: Para preparar o RNA Pré-Lavagem, adicione 10 mL de 95% de etanol a 40 mL de concentrado pré-lavagem de RNA.
  6. Adicione 700 μL de RNA Wash Buffer(Tabela de Materiais)à coluna e centrífuga a 10.000 x g por 2 min em temperatura ambiente. Transfira a coluna para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
    NOTA: Para preparar o Tampão de Lavagem de RNA, adicione 52 mL de 95% de etanol a 12 mL de concentrado de tampão de lavagem de RNA.
  7. Elute a amostra de RNA capturada na matriz da coluna de giro com 100 μL de água livre de nuclease e centrífuga a 10.000 x g para 30 s em temperatura ambiente.
  8. Medir a concentração do RNA extraído usando um espectrofotômetro de microvolume e diluir o RNA a uma concentração desejada usando água livre de nuclease.
    NOTA: O valor de absorvância qualificado de OD260/OD280 varia de 1,6 a 1,9, indicando a pureza de RNA aceitável para o ensaio RT-LAMP.
  9. Siga para o próximo passo imediatamente ou mantenha a amostra a −80 °C até o uso.

3. Design de primer

  1. Use primer explorer versão 4 para projetar os primers específicos para o RT-LAMP. Acesse o site, https://primerexplorer.jp/e/ e clique no botão PrimerExplorer V4.
  2. Selecione o arquivo que contém as seqüências do segmento 3 do TiLV no formato FASTA e clique no botão Primer Design.
    NOTA: Recupere as seqüências no formato FASTA a partir do número de adesão do GenBank KX631923, que representa o segmento TV1 do vírus do lago tilápia 31.
  3. Para projetar os primers, insira os seguintes parâmetros básicos:
    - Um conteúdo GC de 40%-60%
    - Um amplicon de ≥280 pares base (bp)
    - Temperatura de fusão similar (Tm) entre primers com uma diferença máxima de 5 °C
    NOTA: Os primers não devem se complementar uns aos outros
    1. Evite regiões de seqüência propensas a formar estruturas secundárias.
    2. Selecione a análise de primer dimer com um mínimo de −3.5 para um design ideal para o maior ΔG, e selecione as extremidades dos primers com um máximo de −4 para um design ideal para o ΔG menor.
  4. Clique no botão Gerar.
    NOTA: Após o software terminar de processar os dados de entrada, os resultados da cartilha serão mostrados (Figura 1).

4. Ensaio RT-LAMP

  1. Prepare uma mistura mestre RT-LAMP contendo 2,5 μL de tampão de reação SD II de 1x, 3 μL de 6 mM MgSO4,1,4 μL de 1,4 mM dNTP, 4 μL de betaine de 0,8 M, 1,3 μL de mistura de calceína de 0,052 mM, 1 μL de 1,6 μM TiLV-F3 primer, 1 μL de 1,6 μM TiLV-B3 primer, 1 μL de 0,2 μM TiLV-BIP primer, 1 μL de 0,2 μM TiLV-FIP primer, 1 μL de 0,3 U U DNA polimerase, 1 μL de 0,1 U AMV transcriptase reversa e 3,8 μL de água livre de nuclease por reação.
    NOTA: Prepare o excesso de mistura mestre que compreende pelo menos 10% do volume total de reação.
  2. Dispense 22 μL da mistura mestre RT-LAMP em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5.
  3. Adicione 3 μL do RNA extraído ao tubo de reação e misture a amostra por vórtice. Para o controle negativo, use água destilada em vez de materiais de RNA.
  4. Incubar a reação a 65 °C por 60 min, seguido de 80 °C por 10 min para encerrar a reação.
  5. Após a incubação, observe visualmente as mudanças colorimétricas a olho nu. Um resultado positivo aparecerá como uma cor verde fluorescente.

5. Eletroforese de gel de agarose

  1. Prepare um gel de agarose de 1,5% c/v suspendendo 0,6 g de pó de agarose em 40 mL de tampão TAE de 1x. Derreta a mistura aquecendo-a em um microondas por 3-5 min até que a agarose esteja completamente dissolvida, e gire para misturar.
  2. Deixe a agarose esfriar até que a temperatura atinja 65 °C. Despeje 40 mL da solução de agarose em uma bandeja de gel e adicione um pente ao molde de gel.
  3. Deixe o gel de agarose definir em temperatura ambiente por 20-30 min até que tenha se solidificado completamente. Em seguida, remova o pente e coloque o gel no tanque de gel.
  4. Adicione um tampão de corrida para cobrir a superfície do gel no tanque de gel.
  5. Adicione 10 μL da amostra RT-LAMP e 2 μL de tampão de carga de gel de 6x para cada poço. Adicione 5 μL de uma escada de DNA de 1 kb à faixa de referência.
  6. Conecte a tampa presa ao cátodo e ao ânodo conectado a uma fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação, coloque-a em 100 V constantes e funcione por 40 min.
  7. Depois de completar a separação em gel, remova o gel da bandeja de gel. Em seguida, manche o gel drenado usando brometo de etídio (EtBr) a uma concentração de 10 mg/mL por 7 min e restiná-lo em água destilada por 5 min.
    ATENÇÃO: O EtBr é tóxico e considerado cancerígeno; portanto, tenha cuidado ao usar este agente.
  8. Exponha o gel à luz UV usando um sistema de documentação em gel onde as bandas aparecem e tire uma foto do gel.

6. Síntese de DNA complementar (cDNA)

  1. Prepare uma mistura mestre de síntese de cDNA contendo 2 μL de tampão RT de 5x, 0,5 μL de mistura de primer, 0,5 μL de enzima RT e 2 μL de água sem nuclease por reação.
    NOTA: Prepare o excesso de mistura mestre compreendendo 1x a reação devido à perda potencial durante a pipetting.
  2. Dispense 5 μL da mistura mestre em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
  3. Adicione 100 ng do RNA extraído diluído (obtido a partir do passo 2.8) ao tubo de reação, misture e gire para baixo para mover toda a mistura para o fundo do vaso.
  4. Incubar as reações a 42 °C por 60 min, seguido por 98 °C por 5 min em uma máquina PCR. Guarde o cDNA a −20 °C até o uso.

7. RT-qPCR

  1. Prepare uma mistura mestre TiLV qPCR contendo 0,3 μL de primer reverso de 10 μM, 0,3 μL de primer dianteiro de 10 μM, 5 μL de 2x de Polimerase de DNA verde SYBR e 0,4 μL de água sem nuclease por reação. Use os seguintes primers e controles:
    Primer dianteiro (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAAAGaggCAATATGGATT-3'
    Primer reverso (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3'
  2. Dispense 6 μL da mistura mestre TiLV qPCR em cada poço da tira qPCR compatível com o ciclotérmico em tempo real utilizado.
  3. Adicione 4 μL do modelo de cDNA, controle negativo (água sem nuclease), controle positivo (10 pg/μL) e pTiLV (plasmídeo)10 ou plasmídeo TiLV diluído serialmente para o poço, e misture cada amostra por movimento. Conduza cada amostra em triplicado.
  4. Coloque as reações qPCR no ciclotérmico programado em tempo real. Defina o programa qPCR para realizar a incubação a 95 °C por 3 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C para 10 s e 60 °C para 30 s antes da etapa da curva de fusão em que a temperatura precisa aumentar de 65 °C para 95 °C a incrementos de 0,5 °C/5 s.
  5. Conduza a análise dos dados avaliando as curvas de amplificação e fusão e, em seguida, calcule o número de cópias do TiLV usando a curva padrão obtida a partir dos dados usando os plasmídeos diluídos em série.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, foi desenvolvido um ensaio RT-LAMP para detectar a infecção por TiLV na tilápia. As amostras testadas foram coletadas em 14 fazendas localizadas em diferentes partes da Tailândia entre 2015 e 2016. Os peixes infectados e não infectados foram agrupados principalmente com base em diagnósticos físicos e aparências de TiLVD sintomático. Posteriormente, a infecção por TiLV foi confirmada por meio de RT-PCR após o processo de coleta. A eletroforese do gel de agarose e a detecção de uma cor verde luminescente fora...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A indústria da aquicultura está continuamente ameaçada por infecções virais que causam perdas econômicas substanciais9,,23,28. Por exemplo, o TiLV emergente representa uma grande ameaça aos países produtores de tilápia em muitas partes do mundo1,6,9. Até agora, não há terapêuticaespecífica disponível para prevenir o TiLVD. Enquanto o de...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O projeto é financiado financeiramente pelo Fundo de Pesquisa da Tailândia (TRF) número de subvenção RDG6050078 e o Centro de Estudos Avançados para Agricultura e Alimentação, Instituto de Estudos Avançados, Universidade de Kasetsart, Bangkok, Tailândia sob o Projeto de Pesquisa de Pesquisa de Ensino Superior e Nacional da Universidade de Pesquisa da Tailândia, Escritório da Comissão de Educação Superior, Ministério da Educação, Tailândia. A pesquisa é apoiada em parte pela Bolsa de Pós-Graduação da Escola de Pós-Graduação da Universidade Kasetsart. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Kwanrawee Sirikanchana pela narrativa falando do vídeo e Piyawatchara Sikarin pela edição do vídeo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Coleção de tecidos: < / forte >
óleo de cravoBetter PharmaN / A
Tricaine metanossulfonatoSigma-AldrichE10521Uma opção alternativa à extração de RNA de óleo
cravo:
Reagente ácido à base de guanidínio-fenol (reagente TRIzol)ThermoFisher Scientific Corp.
Reagente ácido à base de guanidínio-fenol (reagente GENEzol)GeneaidGZR100
Kit de RNA Direct-zol:Zymo ResearchR2071
- Pré-lavagem
Tampão
- Água
- ColunasZymo-spin IIICG
- Tubos
RT-LAMP:
1x tampão de reação SD IIBiotechrabbitBR1101301
Sulfato de magnésio (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
conjunto dNTPBiolineBIO-39053
BetaínaSigma-AldrichB2629
Calcein misturaMerck1461-15-0
Bst DNA polimeraseBiotechrabbitBR1101301
AMV transcriptase reversaPromegaM510A
Água sem nucleaseInvitrogen10320995
Elite incubadora de banho seco, unidade únicaMajor ScienceEL-01-220
Gel eletroforese:
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borato-EDTA (TBE) bufferSigma-AldrichSRE0062
Tris-acético-EDTA (TAE):
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- Ácido acético (glacial), EMSUREMerck Millipore1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate di-hydrate (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co., Ltd.de DNA GR107
(6X)ThermoFisher Scientific Corp.R0611
Escada de DNA e marcadoresVivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (sistema de eletroforese horizontal)Bio-Rad1704487
Fonte de alimentação PowerPac HCBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
bandeja de amostra UVBio-Rad1708271
N&alfa; Gerador de imagens BINeogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA Synthesis KitVivantis TechnologiescDSK01Uma opção alternativa para a síntese de cDNA
NanoDrop2000 (espectrofotômetro de microvolume)ThermoFisher Scientific Corp.Termociclador ND-2000
T100Bio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
Água sem nuclease, água estérilMultiCell809-115-CL
8 tiras de PCR de 8 tubos, TLS0851Bio-Rad
Tubo de PCR plano 8 tiras de tampa, ópticoBio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
Equipamento geral e materiais:
Mayo scissorsN/A
Indústrias
Microcentrífuga LM-60LioFugeCM610
Corning LSE mini microcentrífugaCorning6765
PipetasRaininPipete-Lite XLS
QSP ponteiras de pipeta filtradasScientific PlasticsSérie
Ponteiras filtradas Corning IsotipMerck CLS
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sem nuclease, NESTWuxi NEST Biotechnology615601
de 15596026 de RNA Direct-zol- de lavagem de RNA livre de DNase/RNase de coletaCorante de carregamento de gel branco Fórceps N/A Vortex Genie 2 (misturador de vórtice)Científico Quality TF Série

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431(2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83(2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342(2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Extra o de RNADesign de PrimersEletroforese em GelDetec o em Tecido de PeixesEnsaio N o LetalTriagem de Biosseguran aDetec o Viral

Artigos relacionados