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Artigo de método

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

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DOI:

10.3791/61036

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2 de maio de 2020

 ,  , 
1Division of Human Biology, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Molecular and Cellular Biology, University of Washington, 3Department of Pharmacology, University of Washington

Neste artigo

Resumo

Introduzimos um protocolo para medir a resposta de drogas em tempo real em fatias organotípicas de tecido tumoral. A estratégia experimental aqui delineada fornece uma plataforma para realizar telas de medicamentos de médio-alto consumo em fatias de tecido derivadas de tumores clínicos ou de camundongos em condições ex-vivos.

Resumo

Os tecidos tumorais são compostos de células cancerosas, células imunes infiltradas, células endoteliais, fibroblastos e matriz extracelular. Esse ambiente complexo constitui o microambiente tumoral (TME) e pode modular a resposta à terapia in vivo ou à resposta medicamentosa ex vivo. As telas convencionais de descoberta de medicamentos contra o câncer são realizadas em células cultivadas em uma monocamada, um sistema criticamente sem a influência do TME. Assim, sistemas experimentais que integram ensaios sensíveis e de alto nível com TME fisiológico suscitados fortalecerão o processo de descoberta de medicamentos pré-clínicos. Aqui, introduzimos a cultura de fatias de tecido tumoral ex vivo como uma plataforma para triagem de medicamentos de médio-alto consumo. A cultura organotípica de fatias de tecido constitui seções tumorais precisamente cortadas e finas que são mantidas com o apoio de uma membrana porosa em uma interface ar-líquido. Neste protocolo, descrevemos a preparação e manutenção de fatias de tecido preparadas a partir de tumores de camundongos e tumores de modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX). Para avaliar as mudanças na viabilidade do tecido em resposta ao tratamento medicamentoso, aproveitamos um ensaio de viabilidade baseado em luminescência biocompatível que permite a medição em tempo real, rápida e sensível de células viáveis no tecido. Usando esta plataforma, avaliamos as respostas dependentes de dose de fatias de tecido ao inibidor multi-quinase, staurosporina e agente citotóxico, doxorubicina. Além disso, demonstramos a aplicação de fatias de tecido para farmacologia ex vivo através da triagem de 17 medicamentos clínicos e pré-clínicos em fatias teciduais preparadas a partir de um único tumor PDX. Nossa plataforma de triagem ex vivo fisiologicamente relevante, altamente sensível e robusta fortalecerá muito a descoberta de medicamentos pré-clínicos e a tomada de decisões de tratamento.

Introdução

Interações das células cancerígenas com as propriedades físicas e bioquímicas do tecido estrômático circundante formam o TME. O TME pode estimular o crescimento tumoral, a metástase e a modulação da resposta tumoral à terapia1. No desenvolvimento convencional de medicamentos pré-clínicos, os candidatos a medicamentos são tipicamente triados pela primeira vez usando linhas de células cancerígenas cultivadas, uma plataforma de ensaio que criticamente não tem o TME2. Essa falta de TME fisiológico em estágios de pré-triagem baseados em células pode limitar a descoberta de agentes eficazes em modelos animais portadores de tumores e pode contribuir para a alta taxa de atrito de muitos medicamentos oncológicos promissores em estágios clínicos posteriores de desenvolvimento3.

Apesar da importância da TME na modulação das respostas de medicamentos tumorais, as restrições experimentais limitam a aplicação de sistemas mais fisiologicamente relevantes durante os estágios iniciais da descoberta e desenvolvimento de medicamentos. É impraticável a triagem de centenas de agentes terapêuticos em tumores de modelos animais ou amostras de tumores de pacientes. De fato, os espécimes cirúrgicos são recursos escassos com variadas origens genéticas e a triagem de milhares de moléculas candidatas em modelos animais não é viável devido à escala experimental, custo e bem-estar animal.

A cultura da fatia de tecido tumoral, onde precisamente cortadas, seções finas de tumores são cultivadas ex vivo, pode abordar a limitação do TME fisiológico em ensaios de rastreamento de drogas. Historicamente, o campo da neurociência foi pioneiro e fez extensas otimizações da cultura de fatias para tecido cerebral4. Recentemente, muitos estudos demonstraram a preparação de fatias de vários tipos de tecido tumoral, incluindo tumores derivados da linha celular, modelos de tumores espontâneos, xenoenxertos derivados do paciente (PDX) e tumores primários do paciente. A cultura da fatia de tecido ex vivo integra benefícios tanto da cultura in vivo quanto in vitro5. As fatias de tecido tumoral retêm arquitetura de tecido intacta e composição celular variegated, permitindo o estudo de células cancerígenas dentro do contexto TME.

Este protocolo introduz um sistema organotípico de cultura de fatias de tecido tumoral combinado com um ensaio de viabilidade em tempo real e altamente sensível para avaliar as respostas dos medicamentos. Testes de eficácia de fárfluos em fatias de tecido tumoral organotípico em protocolos previamente introduzidos dependem da medição de mudanças na viabilidade celular por incorporação de corante fluorescente, imunohistoquímica (IHC) ou MTT ((3- [4, 5-dimetilthiazol-2-yl]-2, 5 brometo de tetrazolium dipenyl)6,7,8,9. No entanto, todos esses métodos são ensaios de ponto final e sofrem de baixa sensibilidade, longo tempo de processamento, análises complexas de dados, faixa de sinal estreita e alto erro experimental. Nosso reagente compatível com células vivas à luminescência melhora esses ensaios, fornecendo uma ampla faixa de sinal e medição instantânea (~5 min) sem processamento prévio e processamento mínimo pós-processamento. Este reagente é altamente sensível e pode coexistir na mídia de cultura celular, permitindo a medição contínua e temporal da viabilidade celular. Este sistema de ensaio é aplicável à triagem de alto throughput de candidatos a medicamentos em fatias de tecido no desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos.

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Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Lei de Bem-Estar Animal e das diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisas biomédicas.

1. Preparação de fatias de tecido tumoral

  1. Prepare o meio de cultura de fatiade tecido (TSC) seguindo a receita na Tabela 1. Filtrar o meio com uma unidade de filtro de vácuo de 0,45 μm para esterilizar.
  2. Alíquota 250 μL de meio TSC por poço para uma placa de 24 poços, ou 1 mL de meio por poço para uma placa de 6 poços. Mantenha a placa em uma incubadora umidificada de 37 °C, 5% CO2 até o uso.
    NOTA: Os médios e suplementos podem ser otimizados dependendo dos tipos de tecidos e metas experimentais. A quantidade de meio deve ser suficiente para absorver a membrana porosa de uma inserção de cultura. Não exceda o nível da membrana. Ajuste o volume médio se o nível médio estiver muito baixo ou muito alto. Se os pesquisadores estiverem testando agentes imunomodulatórios, recomendamos a suplementação do meio com IL-210.
  3. Se usar tecido tumoral derivado de camundongos, eutanize camundongos com um procedimento recomendado, higienize a pele exposta de camundongos pulverizando 70% de etanol e disseque tumores com técnicas assépticas. Armazene o tecido tumoral em um tubo que contenha a solução de sal balanceado (HBSS) de Hank.
  4. Se usar tecidos tumorais frescos do paciente, armazene em HBSS frio a curto prazo ou solução da Universidade Belzer de Wisconsin (UW) para armazenamento a longo prazo (até 24 h) para preservar a viabilidade do tecido.
    NOTA: Foram preparadas fatias de um tecido PDX enviadas durante a noite em solução UW gelada.
  5. Transfira o tecido tumoral para uma placa de cultura de 10 cm contendo HBSS gelada. Corte o tumor em metades com um bisturi enquanto submerso em HBSS frio. Modele tecidos tumorais em cilindros usando um soco de biópsia de 6 mm de diâmetro e corte um lado para criar uma superfície plana. Guarde os tecidos em HBSS frio até o uso.
    NOTA: Evite incluir a área necrosada do tecido, que geralmente está no centro e tem uma aparência opaca e frágil.
  6. Configure o vibratome. Desinfetar todos os equipamentos com 70% de etanol. Coloque a bandeja de tampão de vibratome coberta com uma tampa de vidro acrílica no centro do banho de gelo vibratome. Adicione gelo ao banho de gelo e encha a bandeja de tampão com HBSS resfriado para manter o tecido frio durante o corte. Coloque uma lâmina de barbear no suporte da lâmina.
    NOTA: Embora manter vibratomas em um ambiente semiestéril não tenha afetado experimentos anteriores, recomenda-se armazenar o vibratome sob um gabinete de biossegurança, se disponível.
  7. Levante cuidadosamente um tecido tumoral perfurado por biópsia do HBSS usando fórceps dentados e remova o excesso de tampão, esfregando o tecido com uma toalha de papel sem fiapos.
  8. Coloque uma gota de cola cianoacrilato de grau médico na placa do espécime e coloque o tecido nesta gota. Seque a cola a ar por 2-3 min e coloque a placa na bandeja de tampão. Suplemente com alguns HBSS até que o tecido esteja totalmente imerso no tampão.
    NOTA: A montagem de tecidos em posição vertical e estável é fundamental para gerar fatias uniformemente cortadas. Se os tecidos montados estiverem instáveis, adicione mais cola ao tecido circundante para manter uma posição vertical ou descarregar o tecido, achate o fundo e cole-o novamente. Os tecidos elásticos tendem a ser empurrados e dobrados mais facilmente durante o corte, nesse caso comprimentos mais curtos (<5 mm) e múltiplas corridas podem ser apropriados. Para tecidos extremamente frágeis, toalhas de papel podem destruir o tecido. Neste caso, o tecido pode ser colocado sobre uma superfície plástica para afastar algum excesso de HBSS.
  9. Ajuste as configurações de vibratome. As seguintes configurações são utilizadas: espessura de corte = 250 μm, amplitude = 3,00 mm, velocidade de corte = 0,01-0,25 mm/s e ângulo da lâmina = 15°-21°.
    NOTA: Otimize as configurações de corte dependendo da rigidez do tecido. Tecidos mais macios são mais facilmente cortados com um ângulo de lâmina mais profundo em menor velocidade. Um ângulo de lâmina de 18°, velocidade de corte entre 0,10-0,18 mm/s, e uma amplitude de 3,00 mm funciona bem para os tumores mouse 4T1 e PDX HCI010. O tecido mais rígido pode ser cortado com uma velocidade de lâmina mais rápida.
  10. Ajuste os locais de partida e fim da lâmina e ajuste a altura do palco. Execute o instrumento com modo contínuo para cortar fatias por vários ciclos até que os tecidos sejam cortados uniformemente.
  11. Continue cortando o tecido. Transfira as fatias juntamente com uma pequena quantidade de tampão HBSS para a inserção de cultura celular com meio com uma pipeta de transferência de ponta larga, usando sucção para levantar toda a fatia. Coloque uma fatia por inserção em uma placa de 24 poços. Uma inserção para 6 placas de poço pode acomodar até quatro fatias para um ensaio de réplica.
    NOTA: Se a última borda da fatia de tecido ainda estiver presa ao tecido sem cortes, pare o vibratome e separe a fatia de tecido com dois pares de fórceps de ponta fina sem tocar ou cutucar as fatias de tecido. Uma lâmina de barbear separada pode ser útil na remoção de tecido pendurado.
  12. Remova qualquer tampão em excesso com uma pipeta de transferência de ponta fina.
  13. Quando a lâmina chegar perto dos tecidos colados, pare o instrumento, baixe o palco, remova o tecido endurecido com uma lâmina separada e monte um novo tecido. Continue cortando até que foram coletadas fatias suficientes.
  14. Cultura as placas em uma incubadora umidificada fixada a 37 °C, 5% CO2. As fatias de tecido são cultivadas na interfase ar-líquido na inserção da cultura celular. As fatias de tecido estão prontas para experimentos 24-48 h após a preparação inicial da fatia. Para cultivo a longo prazo, troque o meio a cada 2-3 dias.

2. Medição de viabilidade

  1. Para a medição da viabilidade da fatia de tecido, troque o meio por um reagente de medição de viabilidade à base de luminescência contendo a luciferase e o prosubstrato a 1:1.000 de diluição no meio TSC seguindo as instruções do fabricante. O reagente mede a atividade de redução das células vivas do prosubstrato metabolizado à luciferina11. Transfira 50 μL de mistura enzimática-substrato em cima de cada fatia de tecido.
  2. Incubar com agitação suave em um agitador orbital localizado dentro de uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite.
  3. Sinais luminescentes podem ser medidos usando um leitor de microplacas ou um instrumento de imagem in vivo para tecidos cultivados em uma placa de 24 poços. Para medir a viabilidade individual de múltiplos tecidos em uma placa de 6 poços, deve ser utilizado um sistema de imagem in vivo.
    1. Ao usar um leitor de microplaca, defina a microplaca sem a tampa. Qualquer tipo de leitor de microplaca capaz de medir a intensidade luminescente deve ser adequado para o experimento. Utilizou-se as seguintes configurações: tempo de leitura = 1 s, medição do topo, ganho = 200.
      NOTA: Para maior precisão, use uma microplaca de parede branca para configurar o experimento. As placas de 24 poços de parede branca e fundo claro foram testadas e, na maioria dos casos, as placas claras não comprometem os resultados.
    2. Ao utilizar um sistema de imagem in vivo para medir a viabilidade, coloque a placa no centro do palco e remova a tampa. Adquira imagens fotográficas normais seguidas por imagens luminescentes com um campo de configuração de palco em C, tempo de exposição automática, f-stop = 1, configuração objetiva como microplaca com altura do sujeito = 0,0 cm.
    3. Quantifique a intensidade luminescente utilizando o software de imagem acompanhado do sistema de imagem in vivo. Desenhe regiões de interesse consistentes (ROI) em torno de cada fatia de tecido. Este protocolo usa um círculo de 1 cm de diâmetro como um ROI (Ver Figura 1). Medir o fluxo total (p/s) da área.

3. Avaliação do efeito da droga nas fatias de tecido

  1. Medir a viabilidade da linha de base antes do tratamento usando o reagente de medição de viabilidade baseado em luminescência, conforme explicado na seção 2.
    NOTA: Se vários tecidos tiverem viabilidade significativamente menor em relação a outros, omitam os tecidos do ensaio.
  2. Dissolver medicamentos em sulfóxido de dimetila (DMSO) para fazer soluções de estoque. Prepare uma solução de droga de 10x com TSC ou outro meio de cultura (25 μL/poço para uma placa de 24 poços contendo 250 μL de meio) nas concentrações desejadas. Para o controle do veículo, prepare o meio contendo um volume equivalente de DMSO.
  3. Suplemente a solução de 10x para o meio de cultura na parte inferior do poço. Misture por pipetting e transfira 50 μL do meio em cima dos tecidos.
    NOTA: Se houver várias fatias de tecido disponíveis, teste duplicatas ou triplicados para cada condição.
  4. Incubar durante a noite com agitação suave em um agitador orbital em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2, umidificada.
  5. Retire a placa do agitador e incuba-se estáticamente na incubadora 37 °C, 5% CO2,umidificada.
  6. Nos pontos de tempo desejados, meça a intensidade luminescente dos tecidos usando um leitor de microplacas ou um sistema de imagem in vivo. Normalmente, os efeitos medicamentosos tornam-se detectáveis após 1-6 dias de tratamento.
    NOTA: O reagente de viabilidade à base de luminescência é estável por pelo menos 3 dias sob condições culturais. No entanto, o substrato pode ser esgotado durante o ensaio, dependendo da atividade metabólica do tecido. Se uma queda significativa de sinal for observada em tecidos com sinais anteriormente elevados, suplemente o substrato em todos os poços.
  7. Calcular a viabilidade restante dos tecidos tumorais tratados utilizando a seguinte equação:
    figure-protocol-1
    A viabilidade do tecido tratado é normalizada pela sua viabilidade e viabilidade dos tecidos tumorais de controle.

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Resultados

Aqui, demonstramos um protocolo de avaliação de eficácia múltipla de medicamentos para fatias de tecido tumoral preparadas a partir de tecidos tumorais de camundongos 4T1 e um modelo PDX de câncer de mama, HCI01012. Preparamos com sucesso fatias de tecido de vários tumores derivados de camundongos, PDX e tumores de pacientes frescos10. O fluxo de trabalho geral da preparação do tecido tumoral e o teste de eficácia da droga são descritosna Figur...

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Discussão

Neste protocolo, demonstramos uma plataforma para estudos quantitativos e em tempo real de eficácia de medicamentos em fatias organotípicas de tecido tumoral. O sistema de cultura de fatias teciduais oferece vantagens distintas sobre os métodos in vitro tradicionais baseados em células, capturando heterogeneidade celular e características fisiológicas do microambiente tumoral nativo. Esta plataforma também permite maior rendimento para testes de eficácia de medicamentos, ajudando a preencher a lacuna entre estudos de cul...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], e Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Gostaríamos de agradecer à Dra. Alana Welm (Universidade de Utah) por fornecer o tumor PDX do câncer de mama. Gostaríamos também de agradecer aos funcionários do Centro de Pesquisa do Câncer Comparativo, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) pela manutenção do modelo PDX e aos membros do laboratório Gujral para discussões úteis. O N.N.A é apoiado pela JSPS Overseas Research Fellowship e interdisciplinary Training Grant da FHCRC. A.J.B. é apoiado pelo Chromosome Metabolism and Cancer Training Grant da FHCRC.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Prato de 10 cmCorning430293
prato de 24 poçosCytoOneCC7682-7524
4T1ATCCCRL-2539
Punção de biópsia de 6 mm de diâmetroIntegra Miltex33-36
Placa de 6 poçosCytoOneCC7682-7506
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA8960-5gpara TSC médio
Belzer UW solcução de armazenamento a frio (solução UW)Bridge to Life500 mL
Corning Matrigel Membrane MixFisher scientific356234
DMSOCorningMT-25950CQC
Lâminas de corte de aço inoxidável de borda duplaTED PELLA121-6para fatiar
Doxorrubicina (cloridrato)Cayman Chemical15007
FBSGibco26140-079
Pinça de ponta finaROBOZRS-4974
Pinça de ponta finaROBOZRS-4976
GlicoseSigma-AldrichG5767-500gPara TSC médio
HBSS sem Cálcio, Magnésio ou Fenol VermelhoGibco14-175-103
HCI010Dr. Alana Welm, Universidade de UtahCâncer de mama PDX
HEPES Buffer SolutionGibco15630080para TSC meio
ITS + PremixFisher Scientific354352para TSC médio
IVIS SpectrumPerkinElmer124262
Leica VT1200S VibratomeLeicaVT1200S
L-GlutaminaGibco25030164Para TSC medium
Millicell Cell Cell Culture Insert, 12 mm, PTFE hidrofílico, 0.4 µ mde Cultura deMillipore
Millicell, 30 mm, PTFE hidrofílico, 0.4 µ mMilliporePICM03050
NicotinamidaSigma-AldrichN0636-500gPara TSC médio
PELCO Pro CA44 Adesivo de tecidoTED PELLA10033Caneta de cola
StrepGibco15140-122
Penicilina-estreptomicinaFisher Scientific15140163para TSC médio
RealTime-Glo MT Cell Assay585608G9711
para o meio de TSC
RPMI1640Gibco11875135
únicas lâminas de barbear industriaisVWR55411-050da borda para remover tecidos colados
Bicarbonato de sódioCorning25-035-CIpara o meio Fisher
piruvato de sódioTSC ScientificBW13115EPara TSC médio
StaurosporineSanta Cruz Biotechnologysc-3510A
Synergy H4BioTek
Tooothed fórcepsROBOZRS-5155
Pipetas de transferênciaFisher scientific13-711-7MPonta larga
Pipetas de transferênciaSamco Scientific235Ponta fina
Meio E de William, sem glutaminaThermoFisher Scientific12551032para meio TSC
Inserção Células PICM01250 de recombinação do rato EGF BioLegend de Promega do de

Referências

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  14. Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).
  15. Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).

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