Modelo in vitro de cicatrizes hipertróficas cutâneas humanas usando aglomeração macromolecular

Resumo

Este protocolo descreve o uso de aglomeração macromolecular para criar um modelo de tecido de cicatrizes hipertróficas hipertróficas in vitro humano que se assemelha a condições in vivo. Quando cultivados em um ambiente macromolecular lotado, os fibroblastos da pele humana exibem fenótipos, bioquímica, fisiologia e características funcionais semelhantes ao tecido cicatricial.

Resumo

Foi demonstrado que os tecidos in vivo são altamente lotados por proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polissacarídeos, etc. O protocolo a seguir aplica uma técnica de aglomeração macromolecular (MMC) para imitar essa aglomeração fisiológica através da adição de polímeros neutros (crowders) às culturas celulares in vitro. Estudos anteriores usando Ficoll ou dextran como crowders demonstram que a expressão de colágeno I e fibronectina em linhas celulares WI38 e WS-1 são significativamente melhoradas usando a técnica MMC. No entanto, essa técnica não foi validada em fibroblastos de pele humana derivados de cicatrizes hipertróficas primárias (hHSFs). Como a cicatriz hipertrófica surge da deposição excessiva de colágeno, este protocolo visa construir um modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico em colágeno, aplicando a técnica mmc com hHSFs. Este modelo otimizado de MMC tem mostrado possuir mais semelhanças com o tecido in vivo cicatriz em comparação com os sistemas tradicionais de cultura celular bidimensional (2-D). Além disso, é econômico, econômico e eticamente desejável em comparação com modelos animais. Portanto, o modelo otimizado aqui relatado oferece um modelo avançado "in vivo" para estudos hipertróficos relacionados à cicatriz.

Introdução

O tecido cicatricial representa o ponto final da reparação tecidual. No entanto, em muitos indivíduos, especialmente aqueles que sofrem de queimaduras ou^{traumas 1}, cicatrizes podem ser excessivas e impor efeitos indesejáveis sobre a morfologia e o funcionamento da pele curada. Embora os mecanismos exatos da formação de cicatrizes patológicas (hipertróficas e quelóides) não sejam totalmente compreendidos, a deposição excessiva de colágeno durante a cicatrização de feridas tem sido demonstrada como uma contribuição essencial².

Está bem estabelecido que a transformação do fator de crescimento beta 1 (TGF-β1) e a actina muscular alfa lisa (αSMA) desempenham papéis-chave na formação de cicatrizes hipertróficas. As evidências sugerem que o TGF-β1 elevado estimula diretamente a deposição excessiva de colágeno através da regulação da via de sinalização SMAD³. Além disso, verificou-se que αSMA contribui para a formação de cicatrizes hipertróficas, regulando a contração celular e a reepitelalização no processo de cicatrização da ferida⁴. A falta de modelos in vitro e in vivo adequados é um grande impedimento para o desenvolvimento e avaliação de intervenções e terapias para remediação de cicatrizes. O objetivo deste estudo é utilizar a técnica existente de MMC para construir um modelo de cicatriz hipertrófica "in vivo" adequado para avaliar intervenções novas e emergentes relacionadas à cicatriz.

Reproduzir tecido vivo fora do corpo tem sido uma meta há anos na comunidade científica. O desenvolvimento de técnicas in vitro no início do século XX atingiu parcialmente esse objetivo. As técnicas in vitro atuais evoluíram ligeiramente da demonstração original de Roux de que as células embrionárias podem sobreviver ex vivo por vários dias em soro quente⁵. No entanto, as metodologias in vitro são limitadas principalmente a tipos de células únicas cultivadas em 2-D e não recapitularem tecidos in vivo com precisão. Embora úteis para examinar a bioquímica celular, fisiologia e genética, os tecidos nativos são 3D e incorporam vários tipos de células. Sistemas in vitro simples 2-D submetem células mamíferas a ambientes altamente artificiais nos quais a arquitetura nativa específica do tecido é perdida⁶. Por sua vez, isso afeta eventos intracelulares e extracelulares, resultando em morfologia celular anormal, fisiologia e comportamento⁷.

O interesse por trás desse protocolo está no desenvolvimento e manejo clínico de cicatrizes hipertróficas e quelóides. Embora esteja bem estabelecido que os fibroblastos dérmicos são em grande parte responsáveis pela produção abundante de colágenos presentes no tecido cicatricial, o cultivo de fibroblastos dérmicos utilizando sistemas in vitro 2-D não consegue reproduzir o volume de negócios de colágeno observado in vivo⁸. Métodos in vitro contemporâneos ainda usam essencialmente "soro fisiológico quente", um ambiente completamente diferente daquele dos tecidos vivos. Os tecidos in vivo são extremamente aglomerados, com proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas e polissacarídeos, ocupando 5%-40% do volume total. Como nenhuma molécula pode ocupar o mesmo espaço ao mesmo tempo, há pouco espaço livre disponível e uma ausência quase completa de água livre⁹.

A técnica mmc impõe restrições que afetam as propriedades termodinâmicas de citostes e fluidos intersticiais. Interações moleculares, complexos de sinalização receptor-ligantes, enzimas e organelas estão confinadas e restritas de interagir livremente⁹. As interações dentro do ambiente pericelular (ou seja, interstício) também são restritas. Evidências recentes confirmam que altas concentrações de macromoléculas inertes em soluções lotadas perturbam a difusão, associação física, viscosidade e propriedades hidrodinâmicas¹⁰.

Curiosamente, vários agentes populares de aglomeração (ou seja, Ficoll, dextran, polivinilpirrorolido [PVP], e sódio 4-estirenosulfonato [PSS]) não são equivalentes quando aplicados a diferentes tipos de células e em diferentes configurações. Em um estudo anterior, Ficoll foi relatado como menos citotóxico para células-tronco mesenquimais em comparação com PVP. Esses resultados foram interpretados como conseqüência de sua carga neutra e do raio hidrodinâmico relativamente pequeno¹¹. Em contraste, um segundo estudo descobriu que dextran é mais eficaz em estimular a deposição de colágeno I por fibroblastos pulmonares humanos em comparação com Ficoll¹². Dados de nosso próprio estudo sugerem que Ficoll aumenta a deposição de colágeno por fibroblastos hipertróficos derivados de cicatrizes, enquanto pvp é tóxico para essas células¹³.

Foi demonstrado que a conversão de procolágeno para colágeno é mais rápida em um ambiente in vivo altamente lotado¹⁴, enquanto a taxa de reações biológicas é retardada em um sistema de cultura 2D diluído¹⁵. Otimizamos o protocolo in vitro aqui, incorporando o MMC para mostrar o cultivo de fibroblastos dérmicos servindo como um modelo mais "in vivo" para fibrose dérmica e formação de cicatrizes. Em contraste com o sistema de cultura 2D comum, cultivar hHSFs com MMC estimula significativamente a biossíntese e a deposição do colágeno¹³. Notavelmente, outras características da fibrose (ou seja, aumento da expressão das metaloproteinases matriciais [MMPs] e citocinas proinflamatórias) também são evidentes sob este protocolo otimizado de McMc¹³. Quando cultivadas usando este método, mostra-se que as células dérmicas recapitulam os parâmetros fisiológicos, bioquímicos e funcionais medidos in vivo.

O protocolo in vitro otimizado do MMC tem sido utilizado para avaliar a expressão de colágeno e outras proteínas de ECM por fibroblastos dérmicos isolados da derme de cicatriz hipertrófica e derme adjacente não envolvido. Quando cultivados em ambientes de MMC in vitro, observou-se que os HHSFs expressam certas características (ou seja, mRNA, bioquímica, fisiologia e fenótipo) semelhantes ao tecido cicatrizhipertrófico dérmico in vivo. As evidências indicam que propriedades físicas e químicas são considerações importantes ao selecionar crowders e otimizar as condições de MMC para cultivo in vitro.

Para a prova de princípio, o protocolo MMC é aplicado aqui para avaliar qualitativamente e quantitativamente a capacidade de Shikonin e seus análogos para induzir a apoptose. Isso permite avaliar as aplicações potenciais desses compostos de Medicina Tradicional Chinesa (TCM) naturalmente derivados para o gerenciamento de cicatrizes dérmicas¹³. Não obstante, a simplicidade, a eficácia e a pontualidade deste protocolo In vitro MMC também satisfaz regulamentos recentes para eliminar a experimentação em mamíferos pela Diretiva DA UE 2010/63/UE e pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA).

Protocolo

1. Cultura celular

1. Manter hHSFs e fibroblastos dérmicos normais derivados de tecido não patológico (hNSFs) no meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro de bezerro fetal (FCS) e 1% v/v solução de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37°C em uma incubadora com 5% de CO₂/95% de ar.
2. Compre Ficoll 70, Ficoll 400, e ácido ascórbico das empresas apropriadas.

2. Construção do modelo de cicatriz hipertrófica MMC

1. Semeie os hHSFs ou hNSFs (50.000/well) em uma placa de 24 poços contendo 1 mL de mídia em cada poço.
2. Coloque em uma incubadora de 37°C a 5% de CO₂ e deixe durante a noite.
3. Prepare a mídia da MMC. Com base no volume total necessário para o experimento, produza 10% de mídia FCS/DMEM misturando Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) e ácido ascórbico (100 μM).
4. Coloque a mistura em um banho de água de 37°C por 1 h para dispersar os aglomeradores na solução e, em seguida, esterilize a mídia MMC usando um filtro de 0,2 μm.
5. Apirate a mídia gasta e substitua com a mídia Recém-Feita MMC.
6. Incubar as células durante 6 dias a 37°C e 5% CO_2,mudando a mídia a cada 3 dias.

3. Expressão da quantidade total de colágeno

1. Prepare a solução vermelha Sirius (0,1% c/v). Dissolver 0,2 g de vermelho direto 80 em pó em 200 mL de água destilada deionizada (ddH₂O) com 1 mL de ácido acético.
2. Apirate a mídia MMC e adicione 300 μL de solução Sirius Red em cada poço. Incubar a 37 °C por 90 min.
3. Enxágüe suavemente a solução Sirius Red com água da torneira e deixe a placa secar ao ar durante a noite.
4. Extrair a mancha vermelha sirius adicionando 200 μL de hidróxido de sódio (0,1 M) em cada poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 5-10 min para extrair totalmente a mancha vermelha sirius.
5. Transfira 100 μL da mancha vermelha sirius extraída em uma placa 96 bem transparente e meça a absorvância a 620 nm usando um leitor de microplaca.

4. Expressão de colágeno I (imunocoloração)

1. Lave os poços utilizando 200 μL de solução salina tamponada por fosfato (PBS, pH = 7,35).
2. Fixar as células usando metanol (500 μL/poço) a 4 °C por 10 min.
3. Bloqueie interações não específicas com albumina de soro bovino de 3% por 30 min à temperatura ambiente (RT).
4. Apiratee a solução de bloqueio e incubacom 200 μL de anticorpo anti-colágeno I (10 μg/mL) por 90 min no RT.
5. Apiratee o anticorpo primário e lave 3x com PBS por 5 min cada.
6. Incubar com 200 μL de anticorpo secundário anti-coelho-FITC de cabra (1:400 diluição) e 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 2000 diluição) por 30 min em RT. Cubra a placa com papel alumínio.
7. Descarte o anticorpo secundário e o DAPI e lave 3x com PBS por 5 min cada.
8. Visualize a coloração de fluorescência diretamente sob um microscópio.

5. Mancha ocidental

1. Lave as células 2x com PBS.
2. Adicione 40 μL de tampão de lyse em cada poço e raspe a camada celular com uma ponta de pipeta. O tampão de lyse contém tampão RIPA, coquetel inibidor de protease (PIC), vanadate de sódio de 2 mM e flúor de sódio de 10 mM.
3. Transfira o lysato de proteína em tubos de microcentrífuga e meça a concentração de proteínas usando um ensaio proteico de acordo com as instruções do fabricante¹⁶.
4. Carregue 10 μg de proteína de cada grupo nos poços de 4%-12% de géis protéicos Bis-Tris. Realize a eletroforese dodecil sulfato de poliacrilamida em gel (SDS-PAGE) a 200 V por 30 min.
5. Transfira a proteína para a membrana de nitrocelulose executando uma mancha ocidental a 90 V por 90 min. Evite a formação de bolhas de ar entre o gel e a membrana de nitrocelulose.
6. Bloqueie a membrana com 10 mL de tampão de bloqueio.
7. Incubar com anticorpos primários a 4°C durante a noite. Os anticorpos primários são: anti-colágeno I, anti-colágeno III, anti-colágeno IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13 e anti-glicerldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH).
8. Lave a membrana com 0,1% TBS-Tween 20 (5x para 5 min cada). TBS/Tween 20 (1 L) contém os seguintes: 50 mL de 1 M Tris (pH = 7,4), 30 mL de 5 M cloreto de sódio, 1 mL de Tween 20 e 920 mL de ddH₂O.
9. Incubar com uma espécie de anticorpo secundário apropriado em RT por 1h.
10. Repita o passo 5.8 e visualize a fluorescência usando um sistema de imagem.

6. RT-PCR

1. Coletar o RNA total utilizando o tampão de lysis misturado com 2-mercaptoetanol incluído no kit de ensaio de extração de RNA.
2. Purifique o RNA de acordo com as instruções do fabricante¹⁷.
3. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume.
4. Execute a primeira síntese de CDNA da cadeia usando um kit de síntese de CDNA de acordo com as instruções do fabricante.
5. Os primers de oligonucleotídeos RT-PCR são fornecidos (pré-revestidos) em placas de poço personalizadas de 96. Misture 100 ng das amostras de cDNA com 10 μL de supermix verde SYBR na placa personalizada.
6. Aumente o volume total para 20 μL/poço usando ddH₂O.
7. Execute RT-PCR usando um ciclotérmico seguindo as instruções do fabricante: 40 ciclos de desnaturação a 98°C para 15 s e recozimento/extensão a 60 °C para 60 s. Os genes testados no RT-PCR incluem: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 e VEGF.

Resultados

Amostras triplicadas foram realizadas em cada experimento, e cada experimento foi repetido 3x usando células de três pacientes individuais. Os dados são expressos como percentuais do grupo controle. O teste pós-hoc de ANOVA e Tukey foi aplicado para analisar diferenças estatísticas (*p. 0,05).

O MMC utilizando Ficoll a 9% FVO (ocupação de volume fracionado) aumenta a quantidade total de colágeno e colágeno I deposição em hHSF¹³. Conforme ilustrado na

Discussão

Este protocolo visa otimizar e autenticar um modelo in vitro melhorado de "cicatriz-em-um-frasco" para tecido cicatrizado humano. Estudos anteriores relataram a aplicação da técnica MMC aos fibroblastos pulmonares humanos¹², células-tronco mesenquimais de medula óssea humana²³, e fibroblastos dérmicos humanos²³ usando dextran¹², Ficoll¹², e PVP²³ como crowders. No estudo aqui rel...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,2 μ filtro m	Sartorius	16534
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	P36962
Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific	A-21076
Alexa Fluor 800	Thermo Fisher Scientific	A-11371
anticorpo primário de actina de músculo liso alfa (α SMA)	Abcam	ab5694
Applied Biosystems 7500 Sistema de PCR rápido em tempo real (termociclador)	Thermo Fisher Scientific	4351106
Ácido ascórbico	Wako	# 013-12061
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	#A2153
Ensaio de proteína Bradford	Bio-Rad	500-0006
Anticorpo primário de colágeno I (para imunocoloração)	Abcam	6308
Anticorpo primário de colágeno I (para western blot)	Abcam	ab21286
Anticorpo primário de colágeno III	Abcam	ab7778
Anticorpo primário de colágeno IV	Abcam	ab6586
Direct Red 80	Sigma-Aldrich	2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11996-065
Soro fetal de bezerro (FCS)	Life Technologies	6000-044
Ficoll 400	GE HealthCare	#17-0300-10
Ficoll 70	GE HealthCare	#17-0310-10
GAPDH anticorpo primário	Sigma-Aldrich	G8795
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra	Abcam	ab97050
Cicatriz hipertrófica humana/fibroblastos normais (hHSF/hNSF)	Cell Research Corporation	106, 107, 108
Kit de Síntese de cDNA iScript	Bio-Rad	#1708890
MMP-1 anticorpo primário	Abcam	ab38929
MMP-13 anticorpo primário	Abcam	ab39012
Anticorpo primário MMP-2	Abcam	ab37150
Anticorpo primário MMP-9	Abcam	ab38898
Espectrofotômetros de microvolume NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	N/A
Membrana de nitrocelulose	Bio-Rad	10484060
NuPAGE 4-12% Géis de proteína Bis-Tris	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX
Buffer de bloqueio Odyssey	LI-COR Biosciences	927– 40000
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Microscópio Olympus IX-81 HCS (para imunocoloração)	Olympus	N/A
Solução de penicilina/estreptomicina (P/S)	Life Technologies	15140-122
PrimePCR Assays	Bio-Rad		Primers personalizados pré-revestidos em placas de 96 poços com base na necessidade
Coquetel de inibidor de protease (PIC)	Sigma-Aldrich	11697498001
PVP 360	Sigma	#PVP360
PVP 40	Sigma	#PVP40
Tampão RIPA	Merck	R0278
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	#74134
Vanadato de sódio	Sigma-Aldrich	450022
Sódio vanadato	Sigma-Aldrich	450243
SpectraMax M5 Leitor de microplacas multimodo	Molecular Devices	N/A
SsoAdvanced universal SYBR verde supermix	Bio-Rad	#172-5270
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416