Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.
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Artigo de método
Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental
Neste artigo
Resumo
Resumo
A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune do sistema nervoso central (SNC) causada pela combinação de fatores ambientais e histórico genético suscetível. Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo típico de doença de MS amplamente utilizado para investigar a patogênese na qual linfócitos T específicos para antígenos de mielina iniciam uma reação inflamatória no SNC. É muito importante avaliar como os linfócitos do SNC regulam o desenvolvimento da doença. No entanto, a abordagem para medir a quantidade e a qualidade dos linfócitos infiltrados no SNC é muito limitada devido às dificuldades em isolar e detectar linfócitos infiltrados do cérebro. Este manuscrito apresenta um protocolo para que seja útil para o isolamento, identificação e caracterização de linfócitos infiltrados do CNS e será útil para nossa compreensão de como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune CNS.
Introdução
Como doença desmielinizante crônica do SNC, a ESM afeta cerca de 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo e carece de tratamentos curativos1. Também é considerada uma doença autoimune, na qual linfócitos T específicos de mielina iniciam uma reação inflamatória e levam à desmielinização e lesão axila no CNS2. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido amplamente utilizada para investigar mecanismos patogênicos da ESM como um modelo clássico de doença desmielinização autoimune no CNS3. Existem duas maneiras de induzir o EAE: uma é induzir o EAE ativamente imunizando animais com componente....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo comitê animal da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Xangai Jiao Tong.
1. Preparação dos materiais
- Use a sequência MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35-55 para obter o peptídeo liofilizado de fontes comerciais. Certifique-se de que a pureza do peptídeo é >95%. Prepare a solução de estoque MOG de 10 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e armazene a -20 °C.
- Prepare uma solução de estoque de 4 mg/mL de M. tuberculosis H37 Ra colocando um tubo de 100 mg de M. tuberculosis H37 Ra em 25 mL de Adjuvante Completo freund (CFA) e mi....
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Resultados
Após a imunização de camundongos C57BL/6, todos os camundongos foram pesados, examinados e classificados diariamente para sinais neurológicos. O curso clínico representativo da EAE deve resultar em uma curva da doença como apresentado na Figura 2A e uma mudança de peso corporal no camundongo como apresentado na Figura 2B. Os camundongos C57BL/6 imunizados com MOG35-55 geralmente começaram a desenvolver sintomas da doença por volta do dia 10-12 e atingiram o pico.......
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Discussão
Este estudo apresenta um protocolo para induzir e monitorar a EAE usando MOG35-55 em camundongos C57BL/6, que são considerados um modelo animal experimental neuroimunológico típico de MS. EAE pode ser induzido variando as cepas de camundongos ou o tipo de proteína usada para indução de acordo com a finalidade do estudo. Por exemplo, o uso de peptídeos PLP139-151 em camundongos SJL pode induzir um curso de doença EAE que é especialmente adequado para avaliar efeitos terapêuticos em recaídas15. O pr.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31570921 a ZJ, 81571533 para LS), Comissão Municipal de Saúde de Xangai e Planejamento Familiar (201540206 a ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 para ZJ).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16 / CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogeneizador | Wheaton | 353107542 | |
| Coquetel de Estimulação Celular eBioscience (mais inibidores de transporte de proteínas) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Fixação Intracelular & Conjunto de Buffer de Permeabilização | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400605 | |
| Adjuvante Completo de Freund (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Controle de Isotipo (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-camundongo IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE / Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE / Cy7 Rato IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-rato CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rato IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400631 | |
| toxina coqueluche (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rato IgG1 kappa Controle de isotipo (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rato IgG2a kappa Controle de isotipo (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rato MOG35– 55 peptídeos | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
Referências
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H.
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Reimpressões e permissões
