Artigo de método

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

DOI:

10.3791/61050

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17 de novembro de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Research Center, Ruijin Hospital North, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Tongji University School of Medicine, 3Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Key Laboratory for Tumor Microenvironment and Inflammation, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Resumo

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A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune do sistema nervoso central (SNC) causada pela combinação de fatores ambientais e histórico genético suscetível. Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo típico de doença de MS amplamente utilizado para investigar a patogênese na qual linfócitos T específicos para antígenos de mielina iniciam uma reação inflamatória no SNC. É muito importante avaliar como os linfócitos do SNC regulam o desenvolvimento da doença. No entanto, a abordagem para medir a quantidade e a qualidade dos linfócitos infiltrados no SNC é muito limitada devido às dificuldades em isolar e detectar linfócitos infiltrados do cérebro. Este manuscrito apresenta um protocolo para que seja útil para o isolamento, identificação e caracterização de linfócitos infiltrados do CNS e será útil para nossa compreensão de como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune CNS.

Introdução

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Como doença desmielinizante crônica do SNC, a ESM afeta cerca de 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo e carece de tratamentos curativos1. Também é considerada uma doença autoimune, na qual linfócitos T específicos de mielina iniciam uma reação inflamatória e levam à desmielinização e lesão axila no CNS2. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido amplamente utilizada para investigar mecanismos patogênicos da ESM como um modelo clássico de doença desmielinização autoimune no CNS3. Existem duas maneiras de induzir o EAE: uma é induzir o EAE ativamente imunizando animais com componentes de mielina, outra é a transferência adotiva transferindo células T encefalitárias para o receptor2,,4,,5. As suscetibilidades à EAE são diferentes em diferentes cepas animais6. Em camundongos C57BL/6, o desafio de mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG) 35-55 induz uma doença monofásica com desmielinização extensiva e inflamação no CNS, que é frequentemente usado em experimentos com camundongos direcionados a genes7.

A geração de células T reativas específicas da mielina é necessária para a ocorrência e desenvolvimento da doença na EAE e é um sinal imunológico tanto da EAE quanto da EAE. Linfócitos T autoretivos ativados cruzam a barreira cerebral sanguínea (BBB) para a doença saudável do CNS e iniciam a doença da EAE. Quando o MOG 35-55 Ag é encontrado, esses linfócitos T induzem inflamação e o recrutamento de células effectoras para o CNS, resultando em desmielinização e destruição de axônio8,,9. No modelo EAE, há amplas evidências de que as células CD4+ T específicas do neuroantígeno podem iniciar e sustentar neuroinflamação e patologia3,,10. Dependendo das principais citocinas produzidas, os linfócitos CD4+ T foram classificados em diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado pela produção de interferon-γ), Th2 (caracterizado pela produção de interleucina 4) e Th17 (caracterizado pela produção de interleucina 17). Acredita-se que a ativação das células Th1 e Th17 contribuam para a indução, manutenção e regulação da desmielinização inflamatória na EAE e MS, secretando os efeitos IFN-γ e IL-17, capazes de ativar macrófagos e recrutar neutrófilos para os locais inflamatórios para acelerar as lesões11.

Como as células T autoativas cruzam o BBB para o CNS e induzem o desenvolvimento da doença em MS e EAE, é muito importante analisar as células T no SNC. No entanto, há muito poucos protocolos estabelecidos para o isolamento de linfócitos do CNS12. Por isso, foi desenvolvido um método otimizado para isolar células mononucleares do cérebro e analisar linfócitos T com marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para citometria de fluxo. O método utiliza o MOG35-55 adjuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra and Pertussis Toxin Working Solution (PTX) para induzir um modelo ativo de imunização de EAE em camundongos. Em seguida, métodos de centrifugação de gradiente de separação mecânica e densidade são usados para o isolamento de células mononucleares CNS. Finalmente, uma estratégia otimizada de citometria de fluxo é usada para identificar linfócitos T e subconjuntos do cérebro, manchando vários marcadores.

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Protocolo

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo comitê animal da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Xangai Jiao Tong.

1. Preparação dos materiais

  1. Use a sequência MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK de MOG35-55 para obter o peptídeo liofilizado de fontes comerciais. Certifique-se de que a pureza do peptídeo é >95%. Prepare a solução de estoque MOG de 10 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e armazene a -20 °C.
  2. Prepare uma solução de estoque de 4 mg/mL de M. tuberculosis H37 Ra colocando um tubo de 100 mg de M. tuberculosis H37 Ra em 25 mL de Adjuvante Completo freund (CFA) e mistura. Armazene a solução de estoque a -20 °C.
  3. Prepare 1 ng/μL Pertussis Toxin Working Solution (PTX) adicionando 50 μg de PTX em 50 mL de PBS. Armazene a solução de trabalho a -20 °C.
  4. Armazene todos os anticorpos (ou seja, FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A e APC anti-mouse IFN-γ) a 4 °C.
  5. Faça o Tampão de Coloração de Citometria de Fluxo (FCS) adicionando 2 mM de diamiánico ácido tetraacético (EDTA) e 1% de soro bovino fetal (FBS) em 500 mL de PBS.

2. Habitação de ratos C57BL/6

  1. Use camundongos C57BL/6 fêmeas com idade entre 8 e 12 semanas.
  2. Aclimate C57BL/6J camundongos por pelo menos 7 dias antes da injeção.
  3. Abrigar ratos em uma instalação animal sob condições livres de patógenos a temperatura e umidade constantes em um ciclo claro/escuro de 12 horas e fornecer acesso gratuito à água e alimentos padrão de pelotas.

3. Imunização de camundongos C57BL/6

  1. Deixe todas as soluções de estoque por 15 minutos à temperatura ambiente (RT) para garantir a reidratação completa.
  2. Diluir 300 μL de solução de estoque mog-peptídeo com 700 μL de PBS para a preparação de 3 mg/mL solução de trabalho.
  3. Coloque 1 mL de solução de estoque M. tuberculosis H37 Ra e 1 mL de solução de trabalho mog35-55 em seringas separadas de 10 mL, em seguida, use um galo de parada de quatro vias para emulsionar por pelo menos 10 min. Certifique-se de emulsificação completa antes da injeção.
  4. Anesthetize camundongos no pico da EAE com uma injeção intraperitonial de 1% de sódio pentobarbital (50 mg/kg).
  5. Com uma seringa de 1 mL, injete subcutâneamente ratos com 100 μL de uma emulsão MOG 35-55/CFA (300 μg/200 μL) em dois locais, ambos na parte de trás perto do pescoço. Injete subcutâneamente ratos de controle com 200 μL de PBS.
  6. No mesmo dia (dia 0) e no dia 2 pós-imunização (PI), injetou intraperitoneally camundongos com 200 μL de 1 ng/μL PTX solução de trabalho. Ratos de controle de injeção intraperitoneal com 200 μL de PBS.
  7. Transfira os ratos para a jaula com um bloco de aquecimento.
  8. Examine e qual é a nota de todos os camundongos todos os dias após a injeção de forma cega para os sinais neurológicos mostrados na Tabela111,13. Table 1 Eutanize os animais se as notas forem piores que a nota 4.
  9. Regissce as mudanças de peso durante o curso da doença. Trata-se de uma medida adicional valiosa para a atividade da doença no modelo11,13.
  10. Adicione o primeiro dia de sinais clínicos para camundongos individuais e divida pelo número de camundongos no grupo; o resultado é o início. Adicione o primeiro dia da pontuação máxima do EAE para ratos individuais e divida pelo número de ratos no grupo; o resultado é o pico.

4. Preparação de suspensão unicelular do cérebro

  1. Gradiente de densidade diluída em proporção 9:1 com PBS em um tubo cônico de 15 mL para produzir uma solução final de 100%.
  2. Camundongos anestesiados no pico da EAE com uma injeção intraperitonial de 1% de sódio pentobarbital (50 mg/kg) e perfumado intracardialmente com 20 mL de PBS gelado estéril. Consiga isso injetando PBS lentamente e de forma constante no ventrículo esquerdo do coração usando uma seringa de 20 mL e abrindo o átrio direito.
  3. Corte o crânio cuidadosamente do nariz para o pescoço, em seguida, remova o cérebro da caixa craniana em 10 mL de RPMI em tubos cônicos de 50 mL. Misture bem para remover glóbulos vermelhos aderentes. Em seguida, remova o meio por aspiração e adicione 10 mL de RPMI.
  4. Coloque o cérebro e o meio em um prato de 100 mm. Pique bem com uma lâmina de barbear.
  5. Transfira 6 mL do prato para um homogeneizador de vidro sinterizado de 7 mL gelado com uma pipeta limpa. Evite deixar grandes quantidades de tecido na pipeta. Uma pequena quantidade é inevitável.
  6. Triture o cérebro usando o êmbolo "solto" do pilão primeiro, depois use o êmbolo "apertado" até que a suspensão seja homogênea, e despeje em um tubo cônico de 15 mL pré-edículo e mantenha no gelo.
  7. Depois de todas as amostras serem homogeneizadas, estime o volume. Ajuste o volume com RPMI para 7 mL. Em seguida, coloque 3 mL de matriz de membrana 100% porão gelada em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL refrigerado e adicione 7 mL do cérebro homogeneizar para produzir um meio gradiente de densidade final de 30%. Misture por inversão algumas vezes. Não vórtice.
  8. Para garantir uma interface afiada, adicione cuidadosamente e lentamente 1 mL de 70% de gradiente de densidade inferior em RPMI com uma pipeta de 3 mL.
  9. Centrifugar a 800 x g por apenas 20 min a 4 °C. Defina a aceleração para 1 e desacelere para 0. Após a centrifugação, aspire quase toda a fase superior, tomando cuidado para remover completamente a mielina na parte superior(Figura 1).
  10. Remova a interface em um novo tubo de centrífuga de 15 centrífugas. Ajuste o volume para 10 mL com RPMI.
  11. Centrifugar a 500 x g por 10 min. Depois da centrifugação, aspire o supernante. Resuspenque a pelota em ~200 μL de tampão de coloração de citometria de fluxo (FSC). As pelotas estão então prontas para coloração para FACS.

5. Análise citométrica de fluxo de células únicas do cérebro

  1. Use um hemótmetro e microscópio para contar as células. Adicione 10 μL das células a 10 μL de azul trypan, misture bem e coloque 10 μL em um hemócito para contar as células. Em seguida, calcule o número de células vivas por microliter sob um microscópio invertido (por exemplo, microscópio invertido Olympus).
  2. Alíquota aproximadamente 2 x 106 de células em RPMI em um único poço de uma placa de 96 poços.
  3. Adicione 500x de estimulação celular mais inibidores de transporte de proteínas aos poços.
  4. Incubar a placa na incubadora a 37 °C por 4h.
  5. Centrifugar as células a 400 x g por 5 min no RT. Descarte o supernaspeuta e resuspenque as células em 100 μL de FcS Buffer.
  6. Pré-insuscie as células com bloco CD16/CD32 Fc anti-mouse (1:33) por 10 minutos a 4 °C antes de coloração para bloquear interações não específicas mediadas por Fc.
  7. Manchar marcadores de superfície celular sem lavar. Adicionar cd45.2 anti-mouse (1:200), anticorpos CD11b anti-mouse (1:200), CD3 anti-mouse (1:200) e anticorpos CD4 anti-mouse (1:200).
    NOTA: Para determinar portões positivos e negativos, uma fluorescência menos uma (FMO) para cada cor e um anticorpo de controle de isótipo devem ser manchados.
  8. Incubar a placa por pelo menos 30 min a 4 °C ou no gelo. Proteja-se contra a luz.
  9. Lave as células adicionando fcs buffer. Use 200 μL/well para placas de microtúrmetro. Centrifugar a 400 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante.
  10. Adicione 200 μL de tampão de fixação intracelular (IC) a cada poço para fixar as células. Certifique-se de que as células estão totalmente resuspendidas na solução.
  11. Incubar 30-60 min em RT. Proteja contra a luz.
  12. Centrifugar as amostras a 400 x g em RT por 5 min. Descarte o supernaspeso.
  13. Adicione 200 μL de 1x tampão de permeabilização a cada poço e centrifugar as amostras a 400 x g em RT por 5 min. Descarte o supernaspeso.
  14. Resuspenha a pelota em volume residual e ajuste o volume para cerca de 100 μL com 1x tampão de permeabilização.
  15. Adicione anticorpos anti-mouse IL-17A (1:200) e anticorpos anti-mouse IFN-g (1:200) para detecção de antígenos intracelulares às células.
  16. Incubar por pelo menos 30 min a 4 °C. Proteja-se contra a luz.
  17. Adicione 100 μL de 1x tampão de permeabilização a cada poço e centrifugar as amostras a 400 x g em RT por 5 min. Descarte o supernaspeso.
  18. Resuspend as células manchadas em 100 μL de tampão de coloração de citometria de fluxo.
  19. Analisar por citometria de fluxo.
    NOTA: As configurações de laser e compensação no citômetro de fluxo são ajustadas, as amostras são colocadas no citômetro, e todos os eventos são registrados de acordo com as recomendações do fabricante.

6. Análise de dados

  1. Singlets de portão usando FSC-A vs. FSC-H e SSC-A vs. SSC-H.
  2. Células vivas do portal usando FSC-A e SSC-A com base no tamanho.
  3. Em seguida, identifique os leucócitos, excluindo os monócitos, gating em células CD45+ CD11b-
  4. Em seguida, identifique os linfócitos CD4 T gating em células CD3+CD4+.
  5. Por fim, identifique os subconjuntos Th1 e Th17 por gating em células IFN-γ+ e células IL-17+ separadamente, e determine as populações positivas e negativas usando controles isótipos e FMO.

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Resultados

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Após a imunização de camundongos C57BL/6, todos os camundongos foram pesados, examinados e classificados diariamente para sinais neurológicos. O curso clínico representativo da EAE deve resultar em uma curva da doença como apresentado na Figura 2A e uma mudança de peso corporal no camundongo como apresentado na Figura 2B. Os camundongos C57BL/6 imunizados com MOG35-55 geralmente começaram a desenvolver sintomas da doença por volta do dia 10-12 e atingiram o pico...

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Discussão

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Este estudo apresenta um protocolo para induzir e monitorar a EAE usando MOG35-55 em camundongos C57BL/6, que são considerados um modelo animal experimental neuroimunológico típico de MS. EAE pode ser induzido variando as cepas de camundongos ou o tipo de proteína usada para indução de acordo com a finalidade do estudo. Por exemplo, o uso de peptídeos PLP139-151 em camundongos SJL pode induzir um curso de doença EAE que é especialmente adequado para avaliar efeitos terapêuticos em recaídas15. O pr...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31570921 a ZJ, 81571533 para LS), Comissão Municipal de Saúde de Xangai e Planejamento Familiar (201540206 a ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 para ZJ).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2eBioscience56-0454-82
Anti-Mouse CD16 / CD32 Fc blockBioLegend101302
APC anti-mouse IFN-geBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
Dounce homogeneizadorWheaton353107542
Coquetel de Estimulação Celular eBioscience (mais inibidores de transporte de proteínas) (500X)eBioscience00-4975-03
eBioscience Fixação Intracelular & Conjunto de Buffer de PermeabilizaçãoeBioscience88-8824-00
FITC anti-mouse CD3BioLegend100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl AnticorpoBioLegend400605
Adjuvante Completo de Freund (CFA)Sigma-AldrichF5881
Mouse IgG2a kappa Controle de Isotipo (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscienceeBioscience56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 RaDifco Laboratories231141
PE anti-camundongo IL-17AeBioscience12-7177-81
PE / Cy7 anti-mouse CD4BioLegend100422
PE / Cy7 Rato IgG2b, κ Isotipo Ctrl AnticorpoBioLegend400617
PercollGE17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-rato CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 Rato IgG2b, κ Isotipo Ctrl AnticorpoBioLegend400631
toxina coqueluche (PTX)Sigma-AldrichP-2980
Rato IgG1 kappa Controle de isotipo (eBRG1), APC, eBioscienceeBioscience17-4301-82
Rato IgG2a kappa Controle de isotipo (eBR2a), PE, eBioscienceeBioscience12-4321-80
Rato MOG35– 55 peptídeosBiosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

Referências

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Citometria de FluxoIsolamento CelularCentrifuga o em Gradiente de DensidadeColora o com AnticorposAn lise de Citocinas IntracelularesMOG 35 55Camundongos C57BL 6

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