As sintetizações lanthipeptide catalisam reações multistep durante a biossíntese de produtos naturais de peptídeos. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho contínuo, de baixo para cima, de espectrometria de massa de troca de hidrogênio -deutério (HDX-MS) que pode ser empregado para estudar a dinâmica conformacional das sintetizações de lanthipeptídeo, bem como outras enzimas semelhantes envolvidas na biossíntese de produtos naturais peptídeos.
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Artigo de método
Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) é um método poderoso para a caracterização biofísica de alterações conformacionais enzimáticos e interações entre enzimas enzimistas. Entre seus muitos benefícios, o HDX-MS consome apenas pequenas quantidades de material, pode ser realizado em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem enzimada/substrato, e pode fornecer informações espacialmente resolvidas sobre a dinâmica conformacional enzimático– mesmo para grandes enzimas e complexos multiproteínas. O método é iniciado pela diluição da enzima de interesse em tampão preparado em D2O. Isso desencadeia a troca de protium em peptídeos (N-H) com deutério (N-D). Nos pontos de tempo de troca desejados, as alíquotas de reação são saciadas, a enzima é proteolisada em peptídeos, os peptídeos são separados por cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC), e a mudança na massa de cada peptídeo (devido à troca de hidrogênio por deutério) é registrada pela MS. A quantidade de absorção de deutério por cada peptídeo depende fortemente do ambiente local de ligação de hidrogênio desse peptídeo. Peptídeos presentes em regiões muito dinâmicas do deutério de troca de enzimas muito rapidamente, enquanto peptídeos derivados de regiões bem ordenadas passam por troca muito mais lentamente. Desta forma, a taxa HDX relata a dinâmica conformacional da enzima local. Perturbações aos níveis de absorção de deutério na presença de diferentes ligantes podem então ser usadas para mapear sites de ligação de ligantes, identificar redes alusicais e entender o papel da dinâmica conformacional na função enzimática. Aqui, ilustramos como usamos o HDX-MS para entender melhor a biossíntese de um tipo de peptídeos naturais chamados lanthipeptides. Lanthipeptídeos são peptídeos geneticamente codificados que são modificados pós-translacionalmente por enzimas grandes, multifuncionais e conformacionalmente dinâmicas que são difíceis de estudar com abordagens tradicionais de biologia estrutural. O HDX-MS fornece uma plataforma ideal e adaptável para investigar as propriedades mecanicistas desses tipos de enzimas.
Introdução
Proteínas são moléculas estruturalmente dinâmicas que amostram diferentes conformações em escalas de tempo que vão desde vibração de ligação em escala femtosegundo até rearranjos de domínios proteicos inteiros que podem ocorrer ao longo de muitos segundos1. Estas flutuações conformais são frequentemente aspectos críticos da função enzima/proteína. Por exemplo, alterações conformais induzidas pela ligação de ligasão são muitas vezes criticamente importantes para a modulação da função enzimática, seja organizando resíduos ativos do local necessários para a catálise, definindo locais de ligação de substrato em mecanismos cinéticos sequenciais, pro....
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Protocolo
1. Preparação de reagentes deuterados e soluções de estoque de enzimas
- Prepare os reagentes necessários para as reações HDX (incluindo quaisquer buffers, sais, substratos, ligantes, etc.) como soluções de estoque concentradas de 100-200x em D2O (99,9% fração de átomo D). Prepare pelo menos 50 mL de solução de estoque tampão.
NOTA: Para caracterização do HalM2, foram preparadas as seguintes soluções: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2 carboxyethyl)fospfina (TCEP), ATP de 750 mM (em tampão HEPES), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 e 500 mM AMPP. - Congele e liofilize as soluções de estoque para o ressecamento.
- Ressulimação ....
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Resultados
É necessário avaliar a qualidade da digestão proteolítica e a reprodutibilidade do fluxo de trabalho para cada conjunto de injeções amostrais. Assim, antes de realizar ensaios HDX-MS, é essencial estabelecer condições efetivas para a proteólise da proteína de interesse, para a separação de peptídeos utilizando cromatografia líquida de fase inversa e mobilidade de íons de fase de gás, e para a detecção de peptídeos utilizando EM. Para isso, as amostras de referência para a proteína de interesse (coletada na ausência de de.......
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Discussão
O fluxo de trabalho HDX-MS apresentado neste protocolo fornece uma plataforma notavelmente robusta para mapear a distribuição espacial de elementos estruturalmente dinâmicos em proteínas e para investigar como essas dinâmicas mudam em resposta à perturbação (ligação de ligante, mutagênese enzimática, etc.). O HDX-MS possui várias vantagens distintas sobre outras abordagens de biologia estrutural que são comumente usadas para investigar a dinâmica conformacional. Mais notavelmente, apenas pequenas quantidades de proteína .......
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Divulgações
Não temos nada para revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá, pela Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, pela Canadian Foundation for Innovation e pela McGill University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| [glu-1]-fibrinopeptídeo B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0,5 mL Amicon Ultracel 10k dispositivo de filtração centrífuga (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrila | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| ácido fórmico | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidina-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cloreto de magnésio | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Cloreto | de potássioBioBasic | PB0440 | |
| de T012500 | cloridrato de TCEP | ||
| Nome do Material/Equipamento | Empresa | Número de catálogo< | strong>Comentários/Descrição |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | versão 1.08 | |
| DynamX | Waters | versão 3.0 | |
| MassLynx | Waters | versão 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) | Waters | versão 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrö dinger | versão 2.2.2 | |
| Nome do Material/ Equipamento | Empresa | Número de Catálogo | Comentários/Descrição |
| Instrumento e equipamento | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 Coluna analítica | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pré-coluna | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
| HDX Manager | Eletrodo | ||
| Thermo Fisher | 13-620-291 | ||
| Waters Enzymate BEH coluna ou solução de pepsina | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Águas |
Referências
- Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Bi....
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Reimpressões e permissões
