O imunoensaio eletroqueiluminescence (ECLIA) é uma nova abordagem para detecção quantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas e exógenamente aplicadas, que produz medições altamente quantitativas, precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio sobre uma ampla gama de trabalho. Aqui, o protocolo para o MeCP2-ECLIA em um formato de 96 poços é descrito.
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Artigo de método
Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ECLIA é um método versátil que é capaz de quantificar quantidades de proteínas endógenas e recombinantes em um formato de 96 poços. Para demonstrar a eficiência do ECLIA, este ensaio foi utilizado para analisar os níveis intrínsecos de MeCP2 no tecido cerebral do camundongo e a captação de TAT-MeCP2 em fibroblastos dérmicos humanos. O MeCP2-ECLIA produz medidas altamente precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio. Em resumo, desenvolvemos um método quantitativo para a avaliação de variantes proteicas MeCP2 que podem ser utilizadas em telas de alto throughput.
Introdução
O imunoensaio eletroqueiluminescência (ECLIA) baseia-se em um processo que utiliza rótulos projetados para emitir luminescência quando estimulados eletroquimicamente. É uma técnica amplamente aplicável para a detecção quantitativa de analitos biológicos na indústria básica e na pesquisa acadêmica, na indústria alimentícia, bem como nos diagnósticos clínicos1. Comumente, uma placa descartável de 96 poços com eletrodos de tinta de carbono é usada. Estes eletrodos agem como um portador de fase sólida para o imunoensaio. Um anticorpo secundário é conjugado a um rótulo eletroquímico e quando a eletricidade é aplicada ao sistema, a emissão de luz da ....
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Protocolo
A aprovação para aquisição de biópsias de pele para fins de pesquisa foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Infantil de Westmead, Austrália. O consentimento para experimentos em animais foi obtido do Ministério da Ciência, Pesquisa e Economia da Áustria, realizado de acordo com as normas locais de bem-estar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
NOTA: O princípio do sistema ECLIA é retratado na Figura 1.
1. Seleção de anticorpos
- Avalie a relação sinal-ruído para uma gama de vários anticorpos MeCP2 e identifique a melhor resistência ao sinal e a maior esp....
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Resultados
O princípio do sistema ECLIA é descrito na Figura 1. As curvas padrão para duas variantes MeCP2 são mostradas na Figura 2. A quantificação precisa foi possível em uma ampla gama de concentrações (1-1.800 ng/mL). Na Figura 3,foram analisados os níveis de Lnadameado derivados do cérebro do rato e dos HDFs. A expressão mecp2 em lisatos nucleares cerebrais de camundongos heterozigos, selvagens e camundongos nocauteados foi c.......
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Discussão
Para medir os níveis endógenos de MeCP2, MeCP2 recombinante e TAT-MeCP2, foi desenvolvida uma placa eclia de 96 poços. Foi demonstrado que a perda da função proteica MeCP2 leva à síndrome de TRT6, para a qual o tratamento está atualmente limitado ao gerenciamento de sintomas e fisioterapia. Um caminho promissor para o tratamento é a chamada terapia de reposição de proteínas, onde os níveis de MeCP2 podem ser titulados até a concentração necessária12,
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Somos muito gratos à Dra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,4-Ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reagente de lise hipotônica, tampão de extração |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Detecção de preparação de amostra |
| AB SULFO-TAG rotulado como anti-coelho | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco por Life Technologies | 41966-029 | Preparação de amostra |
| Dulbecco' s PBS (estéril) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Preparação de amostras, solução de lavagem, solução de revestimento |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Tampão de extração Soro |
| bovino fetal | Sigma-Aldrich | F9665 | Preparação de amostras |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Tampão |
| extração Gold Read Buffer T (1x) com surfactante | Meso Scale Diagnóstico | R92TG | MeCP2 Protocolo ECLIA |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Reagente de lise hipotônica, tampão de extração |
| KIMBLE Conjunto de moedor de tecido | Sigma-Aldrich | D8938 | Preparação de amostras |
| Agitador de laboratório, movimento de balanço (baixa velocidade) | GFL | 3014 | MeCP2 Protocolo ECLIA |
| Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl * 6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Reagente de lise hipotônica, Tampão de extração |
| MeCP2 (Humano) Proteína recombinante (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Tratamento celular |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | para selagem de placas |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produzido em camundongo, clone Mec-168, imunoglobulina purificada | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Anticorpo, solução de revestimento |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 Protocolo ECLIA |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicilina-Estreptomicina | gibco da Life Technologies | 15140122 | Preparação de amostras |
| Anti-MeCP2 policlonal, produzido em coelhos | Eurogentec S.A. | cloreto de potássio de | anticorpo |
| (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Reagente de lise hipotônica |
| Primário AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID: AB_10737296 | Camundongo |
| AB primário de anticorpo, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID: AB_1842411 | |
| Camundongo AB primário de anticorpo, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID: AB_262075 | anticorpo |
| , anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID: AB_477235 | Anticorpo |
| Primário AB Coelho, anti-MeCP2 (D4F3) | Tecnologia de Sinalização Celular | 3456S; RRID:AB_2143849 | |
| Coquetel de inibidor de protease de anticorpo (100X) | Reagente de lise hipotônica | Sigma-Aldrich | 8340 |
| secundário AB, coelho, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | AB secundário feito sob encomenda | anticorpo |
| , coelho, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Anticorpo |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Tampão da extração | Sigma-Aldrich | S3014 |
| SULFO-TAG Marcado Anticorpo do Anti-coelho (cabra) | Meso Scale Diagnósticos | W0015528S | Anticorpo |
| TAT-MeCP2 | produção | Tratamento celular | |
| Tripsina EDTA 0,25% (1X) | gibco da Life Technologies | 25200-056 | Tratamento celular |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Solução de lavagem |
Referências
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S.
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Reimpressões e permissões
