Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.
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Artigo de método
Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os testículos de drosophila são um poderoso sistema modelo para estudar processos biológicos, incluindo biologia de células-tronco, arquitetura nuclear, meiose e desenvolvimento de espermatozoides. No entanto, a imunolabelação de todo o teste de Drosophila é frequentemente associada com significativa não uniformidade da coloração devido à penetração de anticorpos. As preparações esmagadas só superam parcialmente o problema, pois diminui a qualidade 3D das análises. Aqui, descrevemos um protocolo de montagem inteira usando NP40 e heptano durante a fixação, juntamente com a imunolabelagem em mídia líquida. Preserva o volume adequado para microscopia confocal juntamente com rotulagem reprodutível e confiável. Mostramos diferentes exemplos de reconstituição 3D de núcleos espermatocitocitos de seções confocal. A reprodutibilidade intra e inter-testes permite quantificação 3D e comparação da fluorescência entre células únicas de diferentes genótipos. Utilizamos diferentes componentes da estrutura de MINT intranuclear (Território Intra Nuclear Contendo Mad1), bem como dois componentes associados ao complexo de poros nucleares para ilustrar este protocolo e suas aplicações nas maiores células dos testis, os espermatozoides S4-S5.
Introdução
Os testículos de drosophila são um modelo valioso para o estudo da arquitetura nuclear. Em células espermatogoniais mitóticas, o volume nuclear é em grande parte ocupado por cromatina. Essas células passam por quatro rodadas de divisão, produzindo um cisto de 16 espermatos primários. Nos dias seguintes, os espermatocitos passam por 6 estágios de desenvolvimento (S1-S6), aumentando consideravelmente em volume, aproximadamente 20vezes 1,2. Eles também mudam sua morfologia nuclear. O contorno do núcleo, revelado pelo lamin Dm0, torna-se irregular e mostra profundas invaginações1,
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Protocolo
1. Coleção de testículos de Drosophila
NOTA: Machos jovens (0-15 h pós-eclosão) são necessários para examinar células germinativas diploides (ou seja, espermatogonia e espermatocitocitos).
- Selecione moscas jovens o máximo possível para minimizar a interferência do desenvolvimento de espermatóides.
- Anesthetize voa por breve exposição ao dióxido de carbono e transferência para uma plataformade moscas 14,15.
- Sob um microscópio dissecando (ampliação de 10x), use fórceps para remover a cabeça.
- Transfira 5 a 10 moscas decapitadas para 100 μL do buff....
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Resultados
O principal obstáculo para a obtenção de uma coloração adequada dos testículos de Drosophila é a penetrabilidade limitada dos anticorpos, que foi parcialmente resolvida por meio de preparações esmagadas, mas ao custo de induzir uma restrição das análises 3D (por exemplo, representação 3D ou medida de colocalização). O procedimento permite rotulagem uniforme e preserva o volume de todas as células do testis. Aqui focamos a ilustração do método na representação 3D dos espermatos S4-S5, pois são as maiores células e, portan.......
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Discussão
Este protocolo fornece um método para o bem sucedido imunolabeling de testículos de Drosophila adultos de montagem inteira. Conforme relatado em outros procedimentos, devem ser utilizados os machos jovens (até encurtamos a idade para menos de 20 horas após a eclosão) para minimizar a presença de espermatozoides em desenvolvimento, o que corre o risco de obstruir os espermatocitos. A dissecção deve ser rápida e a diluição do anticorpo deve ser ajustada para otimizar a relação sinal-ruído21,
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos p. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por anticorpos e A. Debec, os centros de ações bloomington e viena para moscas. Obrigado a C. Jackson por sugestões e discussões estimulantes.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Drosophila strains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Presente de A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, França) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 15 de maio; 124 (Pt 10): 1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | deve ser preparada em H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| Fisherbrand | 11917744 | Ponta de Abertura | |
| Larga Thermo Scientific Tubo Individual de 0,2 mL | Thermo | AB-0620 | |
| Tubos de micro centrífuga de 2 ml | Sigma | T3531-200EA | Tubo de 2ml siliconizado |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Soro de Cabra Normal (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldeído 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldeído (4%) dissolvido em PBS 1X; alíquota por 600 ml; |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, sem cálcio, sem magnésio |
| 0,1% (0,2 ou 0,3%) PBS-T | PBS 1X contendo 0,1% (0,2% ou 0,3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, para biologia molecular, | Sigma | T8787 | |
| Anticorpos | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 presente de J. Johansen, Universidade Estadual de Iowa | ||
| Rato anti-Nup62 | 1/200 presente de H. Ohkura (Universidade de Edimburgo, Reino Unido | ||
| cobaia anti-Ulp1 | Presente de 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidade Erasmus, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | Presente de 1/200 de C. P. Verrijzer, Universidade Erasmus, Rotterdam | ||
| Série conjugada DyLight | Thermo | 1/500 Donkey anti- (cobaia, camundongo, coelho ou rato) como segundos anticorpos |
Referências
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M.
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Reimpressões e permissões
