Summary
Nous présentons un modèle in vitro de maladie vasculaire pour étudier des interactions de sang entier avec l’endothélium patient-dérivé. Ce système permet l’étude des propriétés thrombogéniques des cellules endothéliales primaires dans diverses circonstances. La méthode est particulièrement adaptée pour évaluer la thrombogénicité in situ et la thérapie anticoagulation pendant les différentes phases de la coagulation.
Abstract
La formation de caillots sanguins implique des interactions complexes entre les cellules endothéliales, leur matrice sous-jacente, diverses cellules sanguines et protéines. L’endothélium est la source primaire de plusieurs des principales molécules hémostatiques qui contrôlent l’agrégation plaquettaire, la coagulation et la fibrinolyse. Bien que le mécanisme de la thrombose ait été étudié pendant des décennies, les études in vitro se concentrent principalement sur les situations de dommages vasculaires où la matrice subendothéliale est exposée, ou sur les interactions entre les cellules avec des composants sanguins uniques. Notre méthode permet d’étudier les interactions entre le sang entier et un réseau de cellules vasculaires confluentes intactes.
En utilisant les cellules endothéliales humaines primaires, ce protocole offre l’occasion unique d’étudier l’influence des cellules endothéliales sur la dynamique du thrombus et donne des informations précieuses sur la pathophysiologie de la maladie thrombotique. L’utilisation de canaux de flux microfluidiques sur mesure permet l’application de géométries vasculaires spécifiques à la maladie et de modéliser des changements vasculaires morphologiques spécifiques. Le développement d’un thrombus est enregistré en temps réel et quantitativement caractérisé par l’adhérence plaquettaire et le dépôt de fibrine. L’effet de la fonction endothéliale dans la dynamique altérée du thrombus est déterminé par postanalyse par la coloration d’immunofluorescence de molécules spécifiques.
Les résultats représentatifs décrivent la configuration expérimentale, la collecte de données et l’analyse des données. Selon la question de recherche, les paramètres de chaque section peuvent être ajustés, y compris le type de cellule, les taux de cisaillement, la géométrie des canaux, la pharmacothérapie et les procédures de postanalyse. Le protocole est validé en quantifiant la formation de thrombus sur l’endothélium d’artère pulmonaire des patients présentant la maladie thromboembolique chronique.
Introduction
L’endothélium forme la couche cellulaire interne des vaisseaux sanguins et sépare le sang des tissus environnants. Il a été décrit comme un organe dynamique qui régule activement son micro-environnement et répond aux stimuli externes1. En raison de son contact direct avec le sang qui coule, l’endothélium est essentiel dans le contrôle de l’hémostase et de la thrombose et est la principale source de nombreuses molécules réguleuses majeures qui contrôlent l’agrégation plaquettaire, la coagulation et la fibrinolyse2. Les cellules endothéliales saines et non activées (EC) produisent plusieurs molécules qui neutralisent l’activation plaquettaire et empêchent la coagulation et la formation de thrombus pour maintenir le flux sanguin, comme la prostacycline, la thrombomoduline ou l’inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI)2,3. Ceci empêche l’adhérence des plaquettes, l’agrégation de plaquettes, et la formation de thrombus. Une blessure ou l’activation de la paroi du vaisseau entraîne un phénotype endothélial procoagulant qui initie l’adhérence plaquettaire localisée et la formation de caillots2,4. Lors de l’activation endothéliale, les plaquettes adhèrent au facteur von Willebrand (VWF), une protéine multimérique libérée des EC, ou aux sites de liaison exposés de la matrice subendotherial sous-jacente. Par la suite, les changements moléculaires dans les plaquettes et l’exposition au facteur tissulaire (TF) initient l’activation du système de coagulation, qui induit la formation de thrombus par la polymérisation de fibrine5,6. Ensemble, le caillot qui en résulte fournit la base de la fermeture des plaies par une ré-endothélialisation7. Les perturbations du système de coagulation peuvent entraîner des troubles de la coagulation, tels que la maladie de von Willebrand, l’hémophilie ou la thrombose, qui résultent souvent d’un équilibre pro- et antithrombotique dysrégulé de la voie hémostatique endothéliale2,3.
Le processus d’hémostase se produit dans la circulation artérielle et veineuse. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la thrombose artérielle et veineuse sont fondamentalement différents. Alors que la thrombose artérielle, comme on le voit dans la maladie cardiaque ischémique, est principalement entraînée par la rupture d’une plaque athérosclérotique dans des conditions de stress de cisaillement élevé, thrombose veineuse se développe principalement en l’absence de lésions endothéliales dans un état de stase8,9,10. Un thrombus veineux profond peut embolier et se déplacer vers les artères pulmonaires, où il provoque une embolie pulmonaire. Cela peut entraîner des obstructions vasculaires chroniques conduisant à des capacités fonctionnelles altérées significatives qui pourraient favoriser le développement de maladies pulmonaires choniques, y compris le développement de l’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH est caractérisé par une pression pulmonaire élevée due à des obstructions des artères pulmonaires par le matériel thromboembolique après au moins trois mois de thérapie anticoagulante15. En plus de l’embolie pulmonaire, il est postulé que l’endothélium pulmonaire fournit un environnement prothrombotique dans CTEPH qui facilite la thrombose in situ et les obstructions chroniques des artères pulmonaires, provoquant l’augmentation de la pression artérielle qui peut finalement entraîner une insuffisance cardiaque, si non traitée16,17.
Au cours des dernières années, diverses études ont conduit à l’élaboration d’essais pour examiner la formation de thrombus en mesurant la fonction plaquettaire et la coagulation18. Cependant, la plupart d’entre eux étudient l’interaction du sang entier avec des composants de matrice extracellulaire unique comme les collagènes ou les fibrines, ou la fonction endothéliale en interaction avec des composants sanguins simples, tels que l’interaction endothélial-plaquette ou endothélial-leucocyte19,20,21,22. Ces essais sont le plus souvent effectués avec des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), car ces cellules sont facilement obtenues. Cependant, les gènes hémostatiques sont exprimés différemment à travers l’arbre vasculaire, les types de vaisseaux et les systèmes d’organes23,24, ce qui rend problématique l’utilisation des HUVECs pour représenter les cellules endothéliales impliquées dans la thrombose artérielle ou les embolies pulmonaires23.
En plus de la plasticité des EC, les altérations hémodynamiques spécifiques à la maladie et les changements dans la morphologie vasculaire peuvent favoriser la formation de thrombus à l’endothélium normal25. Des taux de cisaillement plus élevés, en raison de la vasoconstriction locale ou des changements dans la géométrie des vaisseaux, par exemple, peuvent entraîner une formation de thrombus aigu, provoquant une sténose qui accélère l’arrêt du flux sanguin26. L’utilisation de canaux de flux microingéniaires sur mesure permet de concevoir spécifiquement des géométries vasculaires représentatives de la biologie (patho). De cette façon, il est possible d’étudier l’effet des forces biomécaniques locales sur les EC27sains ou malades .
Il existe des thérapies anticoagulation disponibles pour cibler différentes phases et molécules dans la cascade de coagulation, qui présentent toutes des risques et des avantages particuliers qui peuvent être spécifiques à certains troubles. L’approche de la modélisation de la maladie décrite dans cet article est particulièrement adaptée pour tester les effets de diverses thérapies anticoagulantes et antiplaquettaires sur la dynamique du thrombus.
L’objectif est de présenter un modèle de thrombose qui inclut les EC primaires, donnant un modèle polyvalent adapté à l’analyse de diverses formes de thrombose en fonction du type d’EC primaires utilisés. À titre d’illustration, nous avons employé des cellules endothéliales d’artère pulmonaire des patients de CTEPH en interaction avec le sang humain entier contenant tous les composants impliqués dans la formation de thrombus (plaquettes, leucocytes, érythrocytes, protéines de coagulation, et cofacteurs). Cette approche peut être appliquée dans les canaux commerciaux de flux parallèles ou dans les canaux de flux microfluidiques sur mesure avec une conception vasculaire spécifique. En tant que tel, le modèle peut éventuellement être utilisé dans l’étude de la formation et de la résolution du thrombus, pour l’évaluation des réponses inflammatoires dans la modélisation de la maladie, pour la thérapie antiplaquettaire ou anticoagulante, et finalement pour la médecine personnalisée.
Cette étude décrit l’isolement des cellules endothéliales d’artère pulmonaire humaine primaire. Pour l’isolement d’autres types de cellules endothéliales humaines primaires, nous nous référons aux méthodes précédemment publiées, y compris les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires25, cellules endothéliales de veine ombilicale humaine28, et la colonie endothéliale circulante de sang formant des cellules figure 1A29.
Protocol
Cette étude a été approuvée par le Medical Ethical Review Board du VU Medical Center Amsterdam, Pays-Bas (METC VUmc, NL69167.029.19). L’isolement cellulaire primaire et la collecte de sang des sujets humains ont été effectués après que le consentement écrit en connaissance de cause a été obtenu conformément à la Déclaration d’Helsinki.
1. Isolement et culture des cellules endothéliales artérielles pulmonaires primaires (PAEC)
- Milieu complet chaud de cellules endothéliales (cECM) complété par le sérum bovin foetal (FBS), 1% de pénicilline/streptomycine (P/S), 1% de suppléments de croissance cellulaire endothéliale (ECGS) et 1% d’acides aminés non essentiels (NEA), dans un bain d’eau à 37 °C. Stériliser les ciseaux chirurgicaux, les forceps et un scalpel avec soit un stérilisateur thermique de 120 °C ou 70% d’éthanol. Effectuer l’isolement du PAEC dans un coffret de débit laminaire dans des conditions stériles.
- Enrober un plat de culture cellulaire à haute affinité de 60 mm (voir tableau des matériaux)avec 2 mL de fibronectine de 5 μg/mL et incuber à 37 °C pendant au moins 15 min.
- Obtenir le tissu de l’artère pulmonaire (PA) à partir de la chirurgie(p. ex.lobectomy ou endartérectomie pulmonaire), conserver dans un tampon de cordon froid de 4 °C (4 mM de chlorure de potassium, 140 mM de chlorure de sodium, 10 mM HEMPES, 11 mM D-glucose, et 1% P/S, pH = 7,3), et garder sur la glace jusqu’à l’isolement.
- Isoler les cellules endothéliales de l’AP dans les 2 h suivant l’ablation des tissus. Prenez l’AP avec des forceps et le mettre dans une boîte de Pétri de 10 cm pour laver avec PBS. Si l’AP est toujours un anneau, couper l’artère pulmonaire ouverte avec des ciseaux. Soyez très prudent de ne pas toucher la couche la plus intérieure du navire avec les outils, car l’endothélium est facilement endommagé et / ou enlevé.
- Retirer la fibronectine du plat de culture cellulaire et ajouter 4 mL de milieu cECM.
- Prenez le tissu PA avec des forceps et placez-le dans le milieu. Pendant ce temps, gratter soigneusement la couche interne du récipient dans le milieu avec un scalpel. Souvent, des accumulations de lipides peuvent être observées dans la paroi du vaisseau. Essayez d’omettre ceux-ci, car ils auront un impact sur l’excroissance cellulaire.
- Gardez les cellules en culture jusqu’à ce que de petites colonies de cellules endothéliales commencent à apparaître.
- Remplacez le milieu tous les deux jours. Si les fibroblastes contaminent la culture, purifiez-la avec la séparation des cellules d’affinité magnétique pour CD144 avec un kit, conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Utilisez la méthode à deux colonnes pour la purification initiale et la méthode d’une colonne pour chaque purification consécutive. En général, une culture est définie pure lorsque la cytométrie du flux détecte ≤10% des cellules contaminantes.
- Diviser les cellules en ratios de 1:3 à 1:4 jusqu’à ce que des PAEC suffisants soient cultivés pour une utilisation expérimentale. Lorsque les PAEC sont prêts à être utilisés, continuez à l’étape suivante.
- Après la purification, les cellules endothéliales primaires doivent être caractérisées pour la présence de marqueurs spécifiques à l’EC(p. ex.,VE-cadhérine, CD31, TIE2) et en l’absence de cellules musculaires lisses (α-SMA), de fibroblastes (vimentine) et épithéliales (cytokératine)(figure 1B).
2. Préparation des chambres à débit et des monocouches paec
REMARQUE : Selon l’hypothèse, utiliser soit les chambres de débit disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux et figure 1C Option A, étape 2.1 du protocole) ou une chambre d’écoulement microfluidique sur mesure(figure 1C Option B, étape 2.2 du protocole).
- Ensemencement cellulaire des monocouches endothéliales dans des microslides disponibles dans le commerce
REMARQUE : Les chambres à débit disponibles dans le commerce sont faciles à utiliser et fournissent un modèle de débit laminaire dans tout le canal qui peut être utilisé à des taux de cisaillement élevés. Ces microslides sont conçus pour permettre des pistes parallèles multicanal et fournir un profil de débit précis et reproductible. Parce qu’ils sont optimisés pour la microscopie inversée, il est possible de capturer des images fluorescentes de haute qualité. En outre, différentes dimensions des chambres d’écoulement sont disponibles dans différentes tailles de canaux ou géométries. Les canaux de flux à 6 puits sont préférés pour ce test car ces microslides ont de petites dimensions et permettent des courses multiparallel.- Pour recouvrir un canal d’une lame de flux de 6 puits (largeur de 3,5 mm x 0,4 mm de hauteur x 17 mm de longueur), utilisez 30 μL de gélatine de 0,1 % par canal et incuber à 37 °C pendant au moins 15 min.
- Pour semer un canal, essayez 10 cm2 de PAEC confluent et tournez vers le bas à 300 x g pendant 7 min à température ambiante (RT).
- Suspendre les PAEC dans 600 μL de cECM et de pipette 100 μL (1,5 cm2 ) de suspension cellulaire dans un canal. Cela couvre le microslide par l’action capillaire. S’il va trop lentement, des bulles d’air se formeront. Évitez la formation de bulles d’air en utilisant un peu plus de force lors du pipetage.
REMARQUE : La densité cellulaire influence le phénotype endothélial. Un total de 1,5 cm2 de cellules confluentes par canal est surconfluent, parce que le canal a une surface de 0,6 cm2. Avant de commencer l’expérience, la culture de ces cellules pendant encore 6 jours dans les canaux jusqu’à ce qu’ils atteignent la confluence maximale. - Ajouter 50 μL supplémentaires de cECM au canal pour fournir un milieu suffisant pour l’incubation pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO2. Changez le milieu le lendemain pour laver les cellules non liées.
- Gardez les cellules en culture pendant 6 jours à 37 °C, 5 % de CO2 pour permettre au PAEC de former une monocouche ferme et confluente. Changez le milieu tous les deux jours avec 150 μL de cECM.
- Au jour 7, traiter le PAEC avec 100 μL d’histamine de 1 μM dans ecm et 1 % de FBS sans aucun autre additif pendant 30 min avant l’essai. Le stimulus peut être choisi ad libitum. Par exemple, le TNF-α a été couramment utilisé comme activateur inflammatoire.
- Préparation de chambres à débit microfluidiques sur mesure
REMARQUE : Les chambres d’écoulement sur mesure sont adaptées aux besoins de l’utilisateur, car les dimensions et les géométries peuvent être facilement modifiées en préférences. Par exemple, pour imiter un vaisseau plus pertinent sur le plan physiologique, une sténose peut être introduite (figure 1D). Cette approche permet l’utilisation de très petits volumes sanguins comme on le voit dans les maladies microvasculaires.- Lithographie douce du polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide de plaquettes à motifs
- Combiner l’agent de traitement PDMS et le prépolymère sur un microéquilibre à un rapport de 1:10 et bien mélanger avec un mélangeur de laboratoire à usage général.
- Pour enlever les bulles d’air qui en résultent, dégazer le PDMS dans un dessiccateur pendant environ 1 h.
- Tapisser une boîte de Pétri en verre de papier d’aluminium et ajouter quelques gouttelettes d’eau avant de placer la gaufrette dans la boîte de Pétri doublée. La plaquette sert de moule pour le canal sur mesure.
REMARQUE : Les gaufrettes ou les moules sont fournis par les installations de la salle propre. Le photorésiste négatif est modelé sur des plaquettes pour créer des caractéristiques saillantes semblables à des canaux avec les dimensions typiques suivantes : 300 μm de largeur x 270 μm de hauteur x 14 mm de longueur. - Verser le PDMS dégazé sur la gaufrette placée dans une boîte de Pétri en verre.
- Degas le PDMS versé sur la plaquette dans un desiccateur pendant 15 minutes supplémentaires pour enlever toutes les bulles qui pourraient s’être formées pendant le moulage.
- Retirez la boîte de Pétri contenant le moule et le PDMS du desiccateur et placez-la dans un four à 60 °C pendant un minimum de 4 h pour relier le PDMS.
- Préparation du PDMS croisé pour la liaison aux lames de verre
- Retirez le moule et le PDMS croisés du four et passez à un hotte à flux croisé pour la manipulation sans poussière du PDMS.
- Retirez tout PDMS du fond du moule à l’aide d’un scalpel et retirez la dalle supérieure du PDMS croisé du moule.
- Tapissez la dalle PDMS à motifs exposés de ruban adhésif pour empêcher les particules de poussière d’entrer en contact avec les canaux PDMS.
- Couper les copeaux PDMS à la taille et poinçonner les entrées et les sorties de 1 mm de diamètre à l’aide d’un poinçon de biopsie.
- Stérilisation et collage des canaux microfluidiques PDMS et des lames de verre
- Nettoyer les lames de microscopie en verre en rinçant soigneusement avec de l’éthanol, suivi d’un rinçage à l’alcool isopropyle. Après chaque rinçage, séchez soigneusement les lames à l’aide d’un pistolet à azote.
REMARQUE : Alternativement, les feuillets de couverture peuvent être utilisés si l’analyse est effectuée à l’aide d’un microscope confocal. - Ouvrez la chambre plasma et chargez les lames de microscopie nettoyées et les puces microfluidiques sans le ruban de protection.
- Fermez la chambre, purgez avec de l’azote pendant 1 min et remplissez la chambre d’air filtré jusqu’à ce qu’une pression de 500 mtorr soit atteinte.
- Exposez les lames de verre et les puces PDMS au plasma pendant 40 s en utilisant une puissance de 50 W et une fréquence de 5 kHz.
- Après l’exposition au plasma, attachez immédiatement les lames de verre et les copeaux microfluidiques. Conservez les appareils dans des boîtes de Pétri stériles.
- Nettoyer les lames de microscopie en verre en rinçant soigneusement avec de l’éthanol, suivi d’un rinçage à l’alcool isopropyle. Après chaque rinçage, séchez soigneusement les lames à l’aide d’un pistolet à azote.
- Lithographie douce du polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide de plaquettes à motifs
- Ensemencement cellulaire des monocouches endothéliales dans les canaux microfluidiques
- Enrober le microcanal sur mesure en pipeting 10 μL de 0,1 mg/mL collagène type I ou 0,1% de gélatine par canal et incuber à 37 °C pendant 30 min.
- Pour semer quatre microcanaux, trypsinize 25 cm2 de PAEC confluent et tourner vers le bas à 300 x g pendant 7 min à RT.
REMARQUE : Seul un faible pourcentage de cellules adhèreront à la surface. Par conséquent, il est nécessaire d’utiliser un excès de cellules pour atteindre un monocouche confluent. - Suspendre les PAEC dans 20 μL de cECM et utiliser 5 μL de suspension cellulaire pour chaque canal. En raison des petites dimensions du canal, les forces capillaires rempliront le microslide et empêcheront la formation de bulles d’air.
- Changez de milieu après 3 à 4 h pour laver les cellules non liées.
- Gardez les cellules en culture pendant 6 jours pour permettre au PAEC de former une monocouche ferme et confluente. En raison du petit volume, changez le milieu chaque jour avec 150 μL de cECM. Laisser la pointe de la pipette remplie de milieu dans l’entrée et mettre une pointe vide dans la sortie. Cela servira de réservoir fournissant suffisamment de nutriments et de facteurs de croissance aux cellules et empêchera la lame de se dessécher.
- Le jour 7, tacher les noyaux dans les cellules vivantes avec Hoechst (1:5,000 en cECM) et incuber pendant un maximum de 10 min à 37 °C et 5% DE CO2.
- Laver soigneusement 3x avec cECM et traiter avec 1 histamine μM dans ECM + 1% FBS pendant 30 min avant l’essai. Le stimulus peut être choisi ad libitum. Par exemple, le TNF-α a été couramment utilisé comme activateur inflammatoire.
- Utilisez des connecteurs en acier inoxydable incliné de 1,27 mm de diamètre 90° pour raccorder la sortie des puces PDMS aux tubes.
3. Préparation du sang entier humain
- Prélever du sang veineux sur des sujets dans un anticoagulant de citrate de sodium de 0,109 M. Cela peut être de sujets sains ou malades qui ne reçoivent pas de traitement anticoagulation. Inversez délicatement les tubes pour mélanger. La quantité totale de sang requise pour une expérience dépend principalement du débit choisi. Avec un débit de 25 mL/h, dans des diapositives de 6 puits ibidi, un volume total de 2 mL avec un peu d’excès pour remplir les cuves et le canal d’écoulement est suffisant.
- Transférer le sang dans un tube de 50 ml et ajouter calcéin AM (1:10,000) pour étiqueter fluorescent les cellules sanguines et Alexa488-fibrinogène (15 μg/mL) à conjugaison de fibrinogène autologue. Laissez le sang incuber à 37 °C pendant 15 min pour permettre une absorption complète.
- Diluer le sang 1:1 avec un tampon de recalcification (154 mM de chlorure de sodium, 10,8 mM de trisodium citrate, 2,5 mM de chlorure de calcium et 2 mM de chlorure de magnésium) immédiatement avant le début de l’expérience.
NOTE: Hemodilution avec un maximum de 50% n’a pas influencé le temps de réaction decoagulation 30. En outre, le sang humain peut contenir des virus et d’autres agents. Travailler avec des échantillons de sang, par conséquent, comporte un risque d’infection. Il est fortement recommandé d’utiliser des mesures de sécurité appropriées et de traiter le matériel avec soin.
4. Assemblage du système d’écoulement
- Avant de connecter le tube, rincer les tubes d’écoulement à l’aide d’une seringue de 20 mL remplie d’un tampon de lavage (acide citrique de 36 mM, 103 mM de chlorure de sodium, 5 mM de chlorure de potassium, 5 mM EDTA et 0,35 % wt/vol de sérum bovin [BSA], pH = 6,5) pour prévenir la coagulation du sang dans les tubes.
- Utilisez une nouvelle seringue pour remplir les tubes d’écoulement avec un tampon HEPES (132 mM de chlorure de sodium, 20 mM HEPES, 6 mM de chlorure de potassium, 1 mM de chlorure de magnésium, 1% BSA, et 5,5 mM D-glucose, pH = 7,4) et le connecter soigneusement avec un connecteur Luer en forme de coude à la microslide remplie d’EC en milieu. Tout en attachant les connecteurs aux microcanaux, essayez d’empêcher la formation de bulles d’air dans la diapositive. Les bulles endommageront l’endothélium et influenceront les résultats de votre expérience. Retirez complètement la mémoire tampon de lavage et ne laissez pas la mémoire tampon entrer en contact avec les cellules, car cela inhibera la coagulation.
- Configurer le système de flux comme indiqué dans la figure 1E. Prenez 2 mL de tampon de lavage dans une seringue de 20 mL et rincez-la pour éviter la coagulation lorsque le sang pénètre dans la seringue. Insérez la seringue vide dans la pompe à seringues et connectez le tube de sortie avec un connecteur Luer femelle à cette seringue. Mettre le tube d’entrée dans un récipient contenant le sang humain préparé.
- Allumez la pompe à seringues et calculez le débit. Les profils d’écoulement suivent un motif parabolique en hauteur. En supposant que le sang agit comme un liquide newtonien, utilisez la formule suivante pour calculer le débit.
(Équation 1)
Où
τ = stress de cisaillement
η = viscosité dynamique
Q = débit volumétrique
h = hauteur du canal
w = largeur du canal
REMARQUE : Pour le flux artériel pulmonaire avec du sang dans les microslides commerciaux à 6 canaux de dimensions rectangulaires de 0,4 mm de hauteur et de 3,5 mm de largeur, un débit volumétrique de 25 mL/h a été utilisé pendant 5 min. En raison des différences dans les dimensions des canaux de flux sur mesure, ces dynamiques changeront également. Ajuster les variables pour vous assurer que le stress de cisaillement est égal. - Définissez le diamètre de la seringue de 20 mL à 19,05 mm et définissez le programme de retrait. Tirer le sang à travers le canal recouvert de cellules par l’application d’une pression négative garantira des taux de cisaillement constants et des dommages minimes à la couche cellulaire.
(Équation 1)
5. Mise en place du microscope pour l’acquisition d’images
- Utilisez un objectif 20x et placez le microslide sur la scène du microscope fluorescent de contraste de phase inversée. Démarrez le logiciel de microscope pour déplacer la scène dans la direction Z pour se concentrer sur la monocouche cellulaire.
- Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) au début, au milieu et à la fin de chaque canal de flux. Le début et l’extrémité doivent être à au moins 3 mm de l’entrée et de la sortie du chenal. Réglez les filtres fluorescents bleus, verts et rouges avec une puissance laser et une intensité lumineuse qui montre un fond minimal.
6. Perfusion de sang entier sur les PAEC
- Une fois que tout est connecté comme dans la figure 1E et que le microscope est prêt à être enregistré, poussez Start pour enregistrer une vidéo. Appuyez Sur Démarrer sur la pompe à seringues pour perfuser le sang sur l’endothélium.
- Dès que le sang commence à couler sur l’endothélium, acquérir des images avec les canaux actifs présélectionnés et les positions de retour sur investissement tous les 15 s pendant 5 min.
- Après 5 min de perfusion, terminer l’enregistrement et arrêter la pompe à seringues. Démonter la chambre d’écoulement et enlever très soigneusement le tube. Souvent, une bulle d’air se forme si cela se fait avec trop de force. Essayez d’éviter cela, car cela va rincer l’endothélium.
7. Fixation et post-analyse
REMARQUE : Pour exclure l’adhérence faussement positive de plaquette par dommages endothéliales dus à l’expérience de perfusion, il est nécessaire de caractériser les cellules endothéliales pour leur formation d’écart et monocouche. Cela peut être fait par la coloration régulière d’immunofluorescence pour ve-cadhérine.
- Après perfusion et démontage du tube, laver le canal microfluidique avec HEPES. Pipette HEPES dans le canal afin qu’il pousse le sang à la sortie. Retirer l’excédent avec une autre pipette.
- En option, lavez le canal avec pbs++ (avec 0,5 mM de chlorure de magnésium et 0,9 mM de chlorure de calcium) pour prévenir les précipitations de supernatant de protéines. Cela réduit l’arrière-plan. Cependant, une étape de lavage supplémentaire peut changer le comportement cellulaire et la morphologie qui pourraient influencer l’imagerie post-analyse.
- Retirer le HEPES et fixer l’endothélium avec des plaquettes adhérentes et la fibrine déposée en pipeting 37 °C réchauffé 4% paraformaldéhyde (PFA) dans le canal et incuber pendant 15 min à RT.
REMARQUE : Soyez très prudent lors de la fixation de la microfluidique sur mesure car ces canaux sont encore plus petits, ce qui provoque des forces de cisaillement plus élevées dans le canal à chaque étape de manipulation. - Retirez la PFA du canal et lavez 3x avec PBS. Les microslides sont maintenant prêts pour un protocole de coloration standard pour caractériser les marqueurs de cellules endothéliales tels que VE-cadhérine, CD31, P-selectin ou intégrines, CD42b pour les plaquettes adhérentes, ou CD45 pour les leucocytes.
- Après la coloration, prenez au moins cinq images avec un microscope confocal régulier pour caractériser la colocalisation.
8. Analyse d’image
- Ouvrez une image d’analyse de flux contenant soit des plaquettes fluorescentes ou de la fibrine fluorescente dans ImageJ. Faites glisser l’image de choix sur ImageJ.
- L’image est prise en couleur RGB. Pour l’analyse, une image 8 bits est préférée, alors transformez l’image en 8 bits : Image | Type | 8 bits.
- Pour minimiser l’arrière-plan, soustrayez avec un paraboloïde coulissant, où une boule de roulement calcule et soustrait localement les pixels d’arrière-plan de l’image d’origine : Processus | Soustrayez l’arrière-plan | Rayon de balle roulante = 50 pixels | Paraboloide coulissante.
REMARQUE : La taille de l’image est définie en pixels. Toutefois, pour mesurer la zone, il est nécessaire de fixer l’échelle. Lorsque les images sont prises avec un objectif 20x avec une ouverture numérique de 0,45, le microscope a une échelle de 2 pixels par μm. La plupart du temps, les informations nécessaires pour définir l’échelle sont stockées dans les métadonnées de l’image et peuvent être automatiquement utilisées par ImageJ : Analyser | Définir l’échelle. - Fixez un seuil pour définir les plaquettes adhérentes ou la fibrine déposée. Utilisez la méthode Triangle et le seuil s’ajustera automatiquement : Image | Ajuster | Seuil.
- Analyser la zone couverte par les plaquettes ou la fibrine avec la commande Analyser les particules. Définir la taille à 2-Infinity, car la taille minimale d’une plaquette est de 2 μm : Analyser | Analyser les particules.
- Les résultats fourniront la superficie totale en μm2,avec la taille moyenne des agrégats en μm2 et le pourcentage de surface couverte.
Representative Results
Les résultats représentatifs peuvent être divisés en trois parties, chacune représentant les étapes respectives de la configuration expérimentale, de la collecte de données et de l’analyse des données. Selon la question de recherche, les paramètres de chaque étape peuvent être modifiés. Les données présentées sont appliquées pour étudier l’influence de l’endothélium sur la formation de thrombus.
Configuration expérimentale
Il est bien établi que les cellules endothéliales sont très hétérogènes dans la structure et la fonction, selon l’emplacement et le temps, pendant la santé et la maladie23. Diverses sources de cellules endothéliales peuvent être utilisées pour étudier l’interaction endothélial-sang, qui dans ce cas étaient disponibles dans le commerce HUVECs et PAEC (Figure 1A). Les HUVEC ont été les plus couramment utilisés dans les modèles de laboratoire, tandis que les PAEC sont des cellules isolées dérivées par le patient des artères pulmonaires. En outre, il existe des protocoles bien établis pour isoler les cellules endothéliales microvasculaires (MVEC) de la circulation pulmonaire ou des cellules de formation de colonie endothéliales circulantes dans le sang (ECFC)25,28,29.
Après l’isolement, les cellules endothéliales ont été caractérisées par ve-cadhérine, CD31, et tie2 coloration pour confirmer un phénotype endothélial. La caractérisation de la présence d’αSMA et de cytokératine a indiqué l’absence d’un phénotype de fibroblaste ou épithéliale(figure 1B). Après avoir obtenu une population très pure de CE, les cellules de passage 3–5 ont été utilisées pour semer soit un microslide commercial ou des canaux de flux microfluidiques sur mesure (figure 1C). Bien que les microslides disponibles dans le commerce soient principalement des chambres à débit parallèle, ou des canaux en forme de Y avec des paramètres spécifiquement définis en hauteur ou en angle de bifurcation, l’utilisation de diapositives microfluidiques permet d’adapter les paramètres expérimentaux à la géométrie in vivo des vaisseaux et à la dynamique du flux sanguin31. Cependant, les tailles microfluidiques sur mesure sont plus petites et ont tendance à limiter la propagation cellulaire et induire plus de mort cellulaire32,33. L’utilisation d’un surplus de cellules compense le fait que seul un faible pourcentage de cellules adhérera. Ceci a été observé quand une sténose a été introduite, où les cellules endothéliales ont montré un phénotype plus allongé comparé à un canal microfluidique parallèle (figure 1D). Les chambres commerciales ont une plus grande surface à laquelle les cellules peuvent se lier. Cela nécessite moins de numéros de cellules pour l’ensemencement.
Pour étudier l’interaction cellules-sang endothéliales, le sang entier a été perfusé sur un monocouche endothélial. Le sang citrated a été recueilli le jour de l’expérience et immédiatement avant que la perfusion ne soit recalcifiée. Les cellules ont été stimulées avec de l’histamine pour induire la libération de VWF et l’adhérence plaquettaire 30 min avant la perfusion (Figure 1E)34,35. En raison des petites dimensions, les canaux microfluidiques sur mesure ont permis l’utilisation de plus petits volumes sanguins.
Collecte de données
Pour étudier la formation de thrombus sur les PAEC, les cellules sanguines fluorescentes calcéine AM-Rouge et la fibrine conjuguée Alexa488 ont été perfusées pendant 5 min à 2,5 dyne/cm2 (figure 2A–C). Les cellules sanguines adhérentes et la fibrine déposée ont été quantifiées. Les images ont été acquises tous les 30 s et quantifiées avec ImageJ. Il était important de soustraire l’arrière-plan pour éliminer l’autofluorescence des plaquettes nonadhérées. L’algorithme triangle pour le seuil a été utilisé pour définir l’arrière-plan minimal. Il a permis la mesure des petits agrégats de plaquettes (Figure 2D).
On s’attendait à ce que, dans des conditions non simulées, il n’y ait pas de liaison des plaquettes et de la fibrine à l’endothélium. Pour favoriser la libération de VWF et la liaison de plaquette, les PAEC ont été stimulés avec l’histamine, qui a eu comme conséquence une augmentation immédiate de l’adhérence de plaquette atteignant un plateau après 2.5 min. À cette époque, les plaquettes ont commencé à sécréter des facteurs d’autocrine qui ont induit l’agrégation de plaquette et le clivage de fibrinogène en fibrin. Fibrin a été déposé après 3 min et a formé un agrégat stable avec des plaquettes après 4 min (Figure 2E).
Pour déterminer si cet effet pouvait être inhibé par un anticoagulant oral direct (DOAC), le sang a été traité avec 10 nM dabigatran. Dabigatran a été ajouté à la dilution du sang, où il inhibe le facteur IIa dans la voie de coagulation, et a empêché le clivage du fibrinogène pour former des fibres de fibrine. Lorsque le sang traité au dabigatran a été perfusé sur les PAEC stimulés, la formation de caillots pourrait être directement inhibée principalement en retardant le dépôt de fibrine (figure 2F).
Analyse des données
Pour étudier l’influence de diverses sources endothéliales sur la formation de thrombus, les changements cellulaires sur la perfusion de sang de 5 min ont été analysés. L’endothélium a été fixé et les plaquettes adhérentes ont été étiquetées avec CD42b avant l’imagerie sous un microscope confocal. Ceci a fourni une analyse détaillée pour la colocalisation des plaquettes et de la fibrine qui pourrait indiquer des facteurs dysfonctionnels de coagulation dans le sang. L’influence de l’EC dans la formation de caillot a été déterminée par la coloration immunofluorescente standard. Les contacts endothelials de cellules-cellules ont été maintenus, comme confirmé par la coloration de VE-cadhérine, indiquant que les caillots sanguins se sont formés au-dessus de la monocouche endothéliale plutôt que sur la matrice sous-jacente entre les lacunes endothéliales (Figure 3). En outre, l’utilisation de différentes sources cellulaires a entraîné différentes modèles de formation de thrombi sur l’endothélium. Les HUVECs sont des cellules endothéliales veineuses et ont montré l’adhérence plaquettaire limitée et le dépôt de fibrine, tandis que le PAEC primaire malade des patients de CTEPH a montré l’adhérence plaquettaire abondante et plus de dépôt de fibrine sur la stimulation d’histamine comparée au PAEC sain. Ceci suggère que l’endothélium des patients de CTEPH montrent une plus grande réactivité à la vasoactivation qui a commet des résultats dans la formation accrue de thrombus.
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du protocole. (A) Diverses sources et différents types de cellules endothéliales ont été isolés et cultivés pour une utilisation dans un canal de flux microfluidique pour des expériences de perfusion. Images de champ lumineux représentatives de différents types de cellules endothéliales. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Les cellules isolées ont été caractérisées par une coloration immunofluorescente pour confirmer un phénotype endothélial. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Les cellules peuvent être ensemencées soit dans des lames d’écoulement commerciale ou dans un canal microfluidique sur mesure. (D) Représentant des images lumineuses de HUVEC cultivées dans différentes géométries de canaux. Barre d’échelle = 50 μm. (E) Configuration expérimentale des expériences de perfusion sanguine. Le sang citrated a été recueilli, dilué avec le tampon salin, et perfusé sur les cellules endothéliales avec une pompe de seringue. La veine pulmonaire et ombilicale de ce chiffre ont été modifiées à partir de Servier Medical Art, sous licence en vertu d’une licence Creative Common Attribution 3.0 Générique. http://smart.servier.com/ Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Acquisition et quantification d’images de la formation de thrombus. (A) Imagerie en time-lapse représentative des plaquettes étiquetées Calcein AM-Red et déposées par Alexa488-conjuguée fibrine à 1, 3 et 5 min après perfusion sanguine entière sur des PAEC non simulés (B) et sur l’histamine stimulé PAECs. (C) Images représentatives en time-lapse de l’adhérence plaquettaire et du dépôt de fibrine à 1, 3 et 5 min de perfusion avec du sang entier incubé avec du dabigatran perfusé sur des PAEC stimulés par l’histamine. Barre d’échelle = 50 μm. (D) Vue d’ensemble schématique de la quantification de l’image dans ImageJ. (E) Quantification de l’adhérence plaquettaire et du dépôt de fibrine pour chaque 30 s sur un endothélium stimulé non stimulé et histamine. (F) Quantification de l’effet du dabigatran sur la formation de thrombus quantifiée par adhérence plaquettaire et dépôt de fibrine. Les données sont représentées comme moyennes ± SD, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images confocales représentatives d’expériences de flux pour caractériser la formation de thrombus dans l’adhérence plaquettaire et le dépôt de fibrine sur les cellules endothéliales. Les contacts endothéliaux de cellule-cellule ont été caractérisés par VE-cadhérine et mesurés dans les PAEC de commande, les PAEC de CTEPH patients-dérivés, et HUVEC. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
La coagulation est le résultat de l’interaction complexe et temporellement contrôlée entre l’endothélium et les composants sanguins. Cet essai in vitro présente une méthode pour étudier les propriétés thrombogéniques des cellules endothéliales en temps réel. Divers types de cellules endothéliales humaines primaires peuvent être utilisés, facilitant la thrombose in situ d’une manière spécifique à un organe et au patient. Dans cette étude, nous avons illustré l’utilisation de ce protocole comparant les propriétés thrombogéniques des PAECs isolés des donneurs sains par rapport aux patients de CTEPH. La formation de thrombus vivant a été étudiée par perfusion de sang entier de sujets sains au-dessus de l’endothélium histamine-activé, tandis que l’effet d’un DOAC a été testé en tant qu’agent antithrombotique.
Outre l’utilisation de microcanaux disponibles dans le commerce, comme le montrent les résultats représentatifs, l’introduction des canaux microfluidiques sur mesure permet l’étude de l’influence des changements de géométrie vasculaire sur la formation de thrombus. Par exemple, le débit diminue à un point de branche ou la sténose entraîne une augmentation du stress de cisaillement et plus d’activation plaquettaire36. Toutefois, une limitation importante de ces canaux microfluidiques sur mesure est l’exigence d’un nombre élevé de cellules pour former une monocouche stable de CE telle que décrite à l’étape 2.3.2. Cela peut présenter un facteur limitant lorsque les cellules dérivées du patient sont rares. Les points forts des microslides disponibles dans le commerce sont que les surfaces sont modifiées pour la culture cellulaire et les zones de croissance sont plus grandes, permettant ainsi aux EC de former une monocouche confluente et stable. D’autre part, une plus grande surface se traduira par un plus grand lumen. Selon l’équation 1, cela nécessite des volumes sanguins plus élevés pour atteindre des débits similaires à ceux de la microfluidique sur mesure.
Une amélioration de ce protocole pourrait être d’étudier la perte réelle des CE ou des changements dans l’intégrité des barrières. Les dommages ces dans ce protocole ne sont mesurés qu’à la fin de l’expérience. Pour le suivi en direct, les EC peuvent être étiquetés avec mCherry VE-cadherin, par exemple37. Toutefois, comme cela aurait besoin d’un protocole hautement optimisé avec une transfection efficace du virus, electric Cell-substrat Impedance Sensing (ECICS) pourrait être utilisé comme une alternative à l’étude de l’intégrité endothéliale et la fonction de barrière38. La perfusion sur les canaux de débit spéciaux ECIS permet la surveillance longitudinale de l’intégrité endothéliale de barrière sous le débit. Ces caractéristiques ECIS spécifiques permettent des mesures parallèles des propriétés de barrière endothéliale et de la formation de thrombus. D’autres moyens de mesures parallèles des barrières CE, en particulier dans les tableaux sur mesure, comprennent l’utilisation de dextrans fluorescents dans le perfusate, qui diffusent hors du lumen, selon les propriétés de la barrière CE.
Une limitation du protocole décrit est que les EC sont retirés du corps humain et cultivés sur le plastique de culture de tissu, qui est un substrat rigide et artificiel. Les cellules s’adaptent à leur environnement biophysique. Cela pourrait éventuellement affecter la réponse endothéliale à l’activation plaquettaire, car il existe une association entre l’activation plaquettaire et la rigidité de la paroi39. Malgré ces adaptations aux plastiques de culture, les cellules conservent des caractéristiques spécifiques à la maladie qui peuvent être identifiées en comparaison directe avec les EC dérivés de donneurs sains comme indiqué avec le contrôle, CTEPH-PAEC, et HUVEC qui ont exercé différents modèles d’adhérence plaquettaire et de dépôt de fibrine après 5 min de perfusion sanguine.
Contrairement à d’autres protocoles, ce système utilise du sang entier tandis que d’autres étudient l’interaction EC avec un seul composant sanguin comme les plaquettes et les leucocytes19,20,21. Il y a eu des modèles microfluidiques plus avancés développés qui permettent l’étude de la fonction endothéliale dans un modèle vasculaire avec une géométrie ronde de navire et une matrice extracellulaire douce. Cependant, ceux-ci sont optimisés avec des HUVECs40,41,42. La nouveauté du protocole décrit est l’utilisation d’EC primaires combinées avec le sang entier apportant la modélisation de la thrombose in situ un pas de plus vers les conditions in vivo. Après avoir optimisé le protocole pour l’utilisation des EC dérivés du patient et le sang dérivé du patient optimise davantage la modélisation des maladies in vitro,permettant l’évaluation de la formation personnalisée de thrombus et le traitement médicamenteux.
Le protocole décrit peut être appliqué pour étudier l’effet des thérapies anticoagulation sur les cellules dérivées du patient. Alors que nous avons utilisé le dabigatran pour inhiber la formation de thrombus, il est possible d’utiliser d’autres anticoagulants, tels que le rivaroxaban, qui inhibe directement le facteur Xa dans la cascade de coagulation. Les inhibiteurs de la plaquette directe comme le clopidogrel ou l’aspirine peuvent également être étudiés, car ceux-ci agissent sur la phase primaire de l’hémostase où les plaquettes se lient aux EC. En fin de compte, les capacités thrombogéniques des EC spécifiques au patient en interaction avec le propre sang du patient peuvent être utilisées pour prédire l’effet personnel de la thérapie anticoagulation sur le patient individuel. En outre, un knockdown de protéines spécifiques peut fournir des informations fonctionnelles supplémentaires.
Il y a quelques étapes dans le protocole décrit qui sont critiques pour une expérience réussie de perfusion. Tout d’abord, lors de l’isolement des cellules primaires, il est nécessaire d’obtenir une culture EC très pure. Deuxièmement, il est important que les CE forment une monocouche confluente stable. Si ce n’est pas le cas, un léger changement dans le stress de cisaillement peut causer des dommages endothéliales et l’activation de la cascade de coagulation, ou les plaquettes peuvent commencer à se lier à la membrane du sous-sol, ce qui fournira de faux résultats positifs. Troisièmement, il est essentiel de prévenir les bulles d’air, car celles-ci peuvent endommager l’endothélium et ainsi influencer les résultats.
Après la recalcification du sang citré avec du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium, il est important de commencer immédiatement l’expérience de perfusion. Le recalcification induit une réponse rapide dans l’activation de plaquette et la formation de thrombus, ayant pour résultat la coagulation rapide dans l’échantillon.
En conclusion, nous décrivons un protocole très polyvalent pour étudier les interactions de cellules entières de sang-endothélial pendant la thrombose.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Jan Voorberg du Département des protéines plasmatiques, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Pays-Bas, pour sa contribution dans ce manuscrit. Ces travaux ont été soutenus par la Dutch CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-2011] décernée au Phaedra et au consortium Reconnect ainsi qu’à la subvention Impulse 2018 accordée au consortium Phaedra IMPACT. Ces subventions comprennent un financement collectif de la Fondation néerlandaise du cœur, de la Fédération néerlandaise des centres médicaux universitaires, de l’Organisation néerlandaise pour la recherche et le développement en santé et de l’Académie royale des sciences des Pays-Bas. En outre, ces travaux ont été financés par le Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de subventions avancées « VESCEL » (numéro de subvention : 669768). XDM est financé par une subvention de recherche de l’Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) au VU University Medical Center d’Amsterdam, aux Pays-Bas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL syringe | BD | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 100244 | |
| Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 2478269 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 106448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
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