Summary
Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.
Abstract
A formação de coágulos sanguíneos envolve interações complexas entre células endoteliais, sua matriz subjacente, várias células sanguíneas e proteínas. O endotélio é a fonte primária de muitas das principais moléculas hemostáticas que controlam a agregação plaquetária, coagulação e fibrinólise. Embora o mecanismo da trombose seja investigado há décadas, estudos in vitro se concentram principalmente em situações de dano vascular onde a matriz subendotelial é exposta, ou em interações entre células com componentes sanguíneos únicos. Nosso método permite estudar interações entre sangue inteiro e uma rede de células vasculares intactas e confluentes.
Ao utilizar células endoteliais humanas primárias, este protocolo oferece a oportunidade única de estudar a influência das células endoteliais na dinâmica do trombo e dá insights valiosos sobre a fisiopatologia da doença trombótica. O uso de canais de fluxo microfluido personalizados permite a aplicação de geometrias vasculares específicas da doença e modelam alterações vasculares morfológicas específicas. O desenvolvimento de um trombo é registrado em tempo real e quantitativamente caracterizado pela adesão plaqueta e deposição de fibrina. O efeito da função endotelial na dinâmica alterada do trombo é determinado pela pós-análise através da coloração da imunofluorescência de moléculas específicas.
Os resultados representativos descrevem a configuração experimental, coleta de dados e análise de dados. Dependendo da questão da pesquisa, os parâmetros para cada seção podem ser ajustados, incluindo tipo de célula, taxas de tesoura, geometria do canal, terapia medicamentosa e procedimentos pós-análise. O protocolo é validado pela quantificação da formação de trombos no endotélio da artéria pulmonar de pacientes com doença tromboembólica crônica.
Introduction
O endotélio forma a camada celular interna dos vasos sanguíneos e separa o sangue do tecido circundante. Tem sido descrito como um órgão dinâmico que regula ativamente seu microambientso e responde a estímulos externos1. Devido ao seu contato direto com o sangue fluindo, o endotélio é fundamental no controle da hemostasia e da trombose e é a fonte primária de muitas das principais moléculas regulatórias que controlam a agregação plaquetária, coagulação e fibrinolise2. As células endoteliais saudáveis e não ativadas (CE) produzem várias moléculas que neutralizam a ativação plaquetária e impedem a coagulação e a formação de trombogramas para manter o fluxo sanguíneo, como prostacyclina, trombomodulina ou inibidor da via do fator tecidual (TFPI)2,,3. Isso impede a adesão de plaquetas, agregação de plaquetas e formação de trombos. Lesão ou ativação da parede do vaso resulta em um fenótipo endotelial procoagulante que inicia a adesão localizada de plaquetas e formação de coágulos2,4. Após a ativação endotelial, as plaquetas aderem ao von Willebrand Factor (VWF), uma proteína multimérica liberada das CES, ou a locais de ligação expostos da matriz subendotelial subjacente. Posteriormente, alterações moleculares nas plaquetas e exposição ao fator tecidual (TF) iniciam a ativação do sistema de coagulação, que induz a formação de trombos por polimerização fibrina5,,6. Em conjunto, o coágulo resultante fornece a base para o fechamento da ferida por reeterelialização7. Perturbações do sistema de coagulação podem resultar em distúrbios hemorrágicos, como doença de von Willebrand, hemofilia ou trombose, que muitas vezes resultam de um equilíbrio disregulado pró e antitombótico da via hemostática endotelial2,3.
O processo de hemostasia ocorre tanto na circulação arterial quanto venosa. No entanto, os mecanismos subjacentes à trombose arterial e venosa são fundamentalmente diferentes. Enquanto a trombose arterial, como visto na doença isquêmica do coração, é principalmente impulsionada pela ruptura de uma placa aterosclerótica em condições de alto estresse de tesoura, a trombose venosa desenvolve-se principalmente na ausência de lesão endotelial em condição de estase8,,9,10. Um trombo venoso profundo pode embolizar e viajar em direção às artérias pulmonares, onde causa uma embolia pulmonar. Isso pode resultar em obstruções vasculares crônicas que levam a capacidades funcionais significativas e prejudicadas que podem fomentar o desenvolvimento de doenças pulmonares chônicas, incluindo o desenvolvimento de hipertensão pulmonar tromboembólica crônica (CTEPH)11,,12,,13,14. CTEPH é caracterizado por pressão pulmonar elevada devido a obstruções das artérias pulmonares por material tromboembólico após pelo menos três meses de terapia anticoagulação15. Além da embolia pulmonar, é postulado que o endotélio pulmonar fornece um ambiente protombótico em CTEPH que facilita a trombose in situ e obstruções crônicas das artérias pulmonares, causando o aumento da pressão arterial que, em última análise, pode resultar em insuficiência cardíaca, se não tratada16,,17.
Ao longo dos últimos anos, vários estudos levaram ao desenvolvimento de ensaios para examinar a formação de trombos medindo a função plaqueta e a coagulação18. No entanto, a maioria deles estuda a interação do sangue inteiro com componentes de matriz extracelular única, como collagens ou fibrinas, ou função endotelial em interação com componentes sanguíneos únicos, como interação endotelial-plaqueta ou interação endotelial-leucócito19,20,,21,22. Esses ensaios são mais comumente realizados com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), pois essas células são facilmente obtidas. No entanto, os genes hemostáticos são expressos diferencialmente em toda a árvore vascular, tipos de vasos e sistemas de órgãos23,24, o que torna o uso de HUVECs para representar células endoteliais envolvidas em trombose arterial ou embolias pulmonares problemáticas23.
Além da plasticidade ce, alterações hemodinâmicas específicas da doença e alterações na morfologia vascular podem promover a formação de trombos no endotélionormal 25. Taxas mais elevadas de cisalhamento, devido à vasoconstrição local ou alterações na geometria do vaso, por exemplo, podem resultar em formação aguda de trombos, causando uma estenose que acelera a cessação do fluxo sanguíneo26. O uso de canais de fluxo microengenharia personalizados permite projetar especificamente geometrias vasculares representativas da (patho)biologia). Dessa forma, é possível estudar o efeito das forças biomecânicas locais na EC27saudável ou doente .
Existem terapias anticoagulação disponíveis para atingir diferentes fases e moléculas na cascata de coagulação, que todos representam riscos e benefícios particulares que podem ser específicos para certos transtornos. A abordagem da modelagem da doença descrita neste artigo é especialmente adequada para testar os efeitos de várias terapias anticoagulação e antiplaquetária na dinâmica do trombo.
O objetivo é apresentar um modelo de trombose que inclua ces primárias, produzindo um modelo versátil adequado para a análise de várias formas de trombose dependendo do tipo de CE primário utilizado. Como ilustração, utilizamos células endoteliais da artéria pulmonar de pacientes com CTEPH em interação com todo o sangue humano contendo todos os componentes envolvidos na formação de trombos (plaquetas, leucócitos, eritrócitos, proteínas coagulantes e cofatores). Essa abordagem pode ser aplicada em canais de fluxo paralelos comerciais ou em canais de fluxo microfluido personalizados com um desenho vascular específico. Como tal, o modelo pode eventualmente ser utilizado no estudo da formação e resolução de trombos, para a avaliação de respostas inflamatórias na modelagem de doenças, para terapia antiplaquetária ou anticoagulação e, finalmente, para medicina personalizada.
Este estudo descreve o isolamento das células endoteliais da artéria pulmonar humana primária. Para o isolamento de outros tipos primários de células endoteliais humanas, referimos-se a métodos publicados anteriormente, incluindo células endoteliais microvasculares pulmonares25, células endoteliais veia umbilical humana28, e colônia endotelial que circula sangue formando células Figura 1A29.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Ética Médica institucional do VU Medical Center Amsterdam, Holanda (METC VUmc, NL69167.029.19). O isolamento celular primário e a coleta de sangue de indivíduos humanos foram realizados após o consentimento por escrito informado ser obtido de acordo com a Declaração de Helsinque.
1. Isolamento e cultura das células endoteliais pulmonares primárias (PAEC)
- O meio de célula endotelial completa quente (cECM) complementado com 5% de soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1% suplementos de crescimento celular endotelial (ECGS) e 1% aminoácidos não essenciais (NEAA), em banho-maria a 37 °C. Esterilizar tesoura cirúrgica, fórceps e um bisturi com um esterilizador térmico de 120 °C ou 70% de etanol. Realize o isolamento do PAEC em um gabinete de fluxo laminar em condições estéreis.
- Cubra uma célula de alta afinidade de ligação de 60 mm de cultura celular (ver Tabela de Materiais) com 2 mL de fibronectina de 5 μg/mL e incubar a 37 °C por pelo menos 15 min.
- Obter tecido de artéria pulmonar (PA) a partir da cirurgia (por exemplo,lobectomia ou endarterectomia pulmonar), armazenar em 4 °C tampão de cabo frio (4 mM cloreto de potássio, cloreto de sódio de 140 mM, 10 mM HEPES, 11 mM D-glicose, e 1% P/S, pH = 7,3), e manter no gelo até o isolamento.
- Isole as células endoteliais da AF dentro de 2 h após a remoção do tecido. Pegue o PA com fórceps e coloque-o em uma placa de Petri de 10 cm para lavar com PBS. Se o pa ainda é um anel, corte a artéria pulmonar aberta com uma tesoura. Tenha muito cuidado para não tocar na camada mais interna do vaso com as ferramentas, pois o endotélio é facilmente danificado e/ou removido.
- Remova a fibronectina do prato de cultura celular e adicione 4 mL de meio cECM.
- Pegue o tecido pa com fórceps e coloque-o no meio. Enquanto isso, raspe cuidadosamente a camada interna do vaso no meio com um bisturi. Muitas vezes, acúmulos lipíduos podem ser vistos na parede do vaso. Tente omitir isso, pois eles vão impactar o crescimento celular.
- Mantenha as células na cultura até que pequenas colônias de células endoteliais comecem a aparecer.
- Substitua o meio dia não. Se os fibroblastos contaminarem a cultura, purifique-a com separação celular de afinidade magnética para CD144 com um kit, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Use o método de duas colunas para a purificação inicial e o método de uma coluna para cada purificação consecutiva. Geralmente, uma cultura é definida pura quando a citometria de fluxo detecta ≤10% contaminando células.
- Células divididas em proporções de 1:3 a 1:4 até que paecs suficientes sejam cultivados para uso experimental. Quando os PAECs estiverem prontos para uso, continue com o próximo passo.
- Após a purificação, as células endoteliais primárias precisam ser caracterizadas para a presença de marcadores específicos da CE(por exemplo,VE-cadherin, CD31, TIE2) e para a ausência de células musculares lisas (α-SMA), fibroblasto (vimentina) e marcadores epiteliais (citokeratina)(Figura 1B).
2. Preparação de câmaras de fluxo e monocamadas PAEC
NOTA: Dependendo da hipótese, utilize as câmaras de fluxo comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais e Figura 1C Opção A,etapa 2.1 do protocolo) ou uma câmara de fluxo microfluidic personalizada(Figura 1C Opção B, etapa 2.2 do protocolo).
- Semeadura celular de monocamadas endotelial em microslídeos disponíveis comercialmente
NOTA: As câmaras de fluxo disponíveis comercialmente são fáceis de usar e fornecem um padrão de fluxo laminar em todo o canal que pode ser usado a altas taxas de cisalhamento. Esses microslides são projetados para permitir corridas paralelas multicanais e fornecer um perfil de fluxo preciso e reprodutível. Por serem otimizados para microscopia invertida, é possível capturar imagens fluorescentes de alta qualidade. Além disso, várias dimensões das câmaras de fluxo estão disponíveis em diferentes tamanhos de canais ou geometrias. Os canais de fluxo de 6 poços são preferidos para este ensaio porque esses microslides têm pequenas dimensões e permitem corridas multiparalhais.- Para revestir um canal de um slide de fluxo de 6 poços (largura de 3,5 mm x 0,4 mm de altura x 17 mm de comprimento) use 30 μL de gelatina de 0,1% por canal e incubar a 37 °C por pelo menos 15 min.
- Para uma semente de um canal, experimente 10 cm2 de PAECs confluentes e gire a 300 x g por 7 min em temperatura ambiente (RT).
- Suspender PAECs em 600 μL de cECM e pipeta 100 μL (1,5 cm2 ) de suspensão celular em um canal. Isso cobre o microslídeo através da ação capilar. Se estiver indo muito devagar, bolhas de ar se formarão. Evite a formação de bolhas de ar usando um pouco mais de força ao pipetar.
NOTA: A densidade celular influencia o fenótipo endotelial. Um total de 1,5 cm2 de células confluentes por canal é superconfluente, pois o canal tem uma superfície de 0,6 cm2. Antes de iniciar o experimento, cultue essas células por mais 6 dias dentro dos canais até atingirem a máxima confluência. - Adicione um adicional de 50 μL de cECM ao canal para fornecer meio suficiente para incubação durante a noite a 37 °C, 5% de CO2. Mude o meio no dia seguinte para lavar células desvinculadas.
- Mantenha as células na cultura por 6 dias a 37 °C, 5% de CO2 para permitir que o PAEC forme uma monocamada firme e confluente. Troque o meio a cada dois dias com 150 μL de cECM.
- No dia 7, trate o PAEC com 100 μL de histamina de 1 μM em ECM e 1% FBS sem quaisquer outros aditivos por 30 minutos antes do ensaio. O estímulo pode ser escolhido ad libitum. Por exemplo, o TNF-α tem sido comumente usado como um ativador inflamatório.
- Preparação de câmaras de fluxo microfluídicas personalizadas
NOTA: As câmaras de fluxo personalizadas são adaptadas às necessidades do usuário porque as dimensões e geometrias podem ser facilmente alteradas para preferência. Por exemplo, para imitar um vaso mais fisiologicamente relevante, uma estenose pode ser introduzida(Figura 1D). Esta abordagem permite o uso de volumes sanguíneos muito pequenos, como visto em doenças microvasculares.- Litografia macia de polidimtilsiloxano (PDMS) usando wafers padronizados
- Combine agente de cura PDMS e prepolymer em um microequilípmo a uma proporção de 1:10 e misture completamente com um misturador de laboratório de propósito geral.
- Para remover as bolhas de ar resultantes, desgas o PDMS em um dessecador por aproximadamente 1 h.
- Forra uma placa de vidro Petri com papel alumínio e adicione algumas gotas de água antes de colocar o wafer na placa de Petri forrada. O wafer serve como molde para o canal personalizado.
NOTA: Os wafers ou moldes são fornecidos pelas instalações da sala limpa. O fotoresist negativo é padronizado em wafers para criar características semelhantes a canais salientes com as seguintes dimensões típicas: largura de 300 μm x 270 μm de altura x 14 mm de comprimento. - Despeje o PDMS desgaseado no wafer colocado em uma placa de vidro Petri.
- Degas o PDMS derramou no wafer em um desiccator por mais 15 minutos para remover quaisquer bolhas que possam ter se formado durante a fundição.
- Retire a placa de Petri contendo o molde e o PDMS do dessecanteador e coloque-a em um forno de 60 °C por um mínimo de 4h para cruzar o PDMS.
- Preparação de PDMS interseto para ligação a lâminas de vidro
- Remova o e o PDMS transversal do forno e mova-se para um capô de fluxo cruzado para o manuseio sem poeira do PDMS.
- Remova qualquer PDMS da parte inferior do molde usando um bisturi e remova a laje superior do PDMS transversal do molde.
- Fore a laje PDMS padronizada exposta com fita adesiva para evitar que quaisquer partículas de poeira entrem em contato com os canais PDMS.
- Corte os chips PDMS para tamanho e soco entradas de 1 mm de diâmetro e tomadas usando um soco de biópsia.
- Esterilização e ligação de canais microfluidos PDMS e lâminas de vidro
- Lâminas de microscopia de vidro limpos enxaguando completamente com etanol seguido de uma lavagem de álcool isopropílico. Após cada lavagem, seque completamente as lâminas com uma arma de nitrogênio.
NOTA: Alternativamente, os deslizamentos de cobertura podem ser usados se a análise for realizada usando um microscópio confocal. - Abra a câmara de plasma e carregue os slides de microscopia limpos e chips microfluídicos sem a fita protetora.
- Feche a câmara, purgue com nitrogênio por 1 min, e encha a câmara com ar filtrado até que uma pressão de 500 mTorr seja alcançada.
- Exponha os slides de vidro e os chips PDMS ao plasma por 40 s usando uma potência de 50 W e uma frequência de 5 kHz.
- Após a exposição ao plasma, una-se imediatamente as lâminas de vidro e chips microfluidos. Armazene os dispositivos em pratos estéreis de Petri.
- Lâminas de microscopia de vidro limpos enxaguando completamente com etanol seguido de uma lavagem de álcool isopropílico. Após cada lavagem, seque completamente as lâminas com uma arma de nitrogênio.
- Litografia macia de polidimtilsiloxano (PDMS) usando wafers padronizados
- Semeadura celular de monocamadas endotelial em canais microfluidos
- Cubra o microcanal personalizado por pipetação de 10 μL de 0,1 mg/mL de colágeno Tipo I ou 0,1% de gelatina por canal e incubar a 37 °C por 30 min.
- Para semear quatro microcanais, trippsinize 25 cm2 de PAECs confluentes e gire a 300 x g por 7 min no RT.
NOTA: Apenas uma pequena porcentagem de células aderirá à superfície. Portanto, é necessário usar um excesso de células para alcançar uma monocamada confluente. - Suspenda paecs em 20 μL de cECM e use 5 μL de suspensão celular para cada canal. Devido às pequenas dimensões do canal, as forças capilares preencherão o microslídeo e evitarão a formação de bolhas de ar.
- Mude o meio após 3-4 h para lavar células sem saída.
- Mantenha as células na cultura por 6 dias para permitir que o PAEC forme uma monocamada firme e confluente. Por causa do pequeno volume, troque o meio todos os dias com 150 μL de cECM. Deixe a ponta da pipeta cheia de meio na entrada e coloque uma ponta vazia na tomada. Isso servirá como um reservatório que fornece nutrientes suficientes e fatores de crescimento para as células e evitará que o slide seque.
- No dia 7, colori a mancha dos núcleos nas células vivas com Hoechst (1:5.000 em cECM) e incubar por uma máxima de 10 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Lave cuidadosamente 3x com cECM e trate com histamina de 1 μM em ECM + 1% FBS por 30 minutos antes do ensaio. O estímulo pode ser escolhido ad libitum. Por exemplo, o TNF-α tem sido comumente usado como um ativador inflamatório.
- Use conectores de aço inoxidável de 1,27 mm de diâmetro 90° angulares para conectar a saída dos chips PDMS à tubulação.
3. Preparação de sangue humano inteiro
- Retire sangue venoso de indivíduos em 0,109 M de citrato de sódio anticoagulante. Isso pode ser de indivíduos saudáveis ou doentes que não recebem tratamento anticoagululação. Inverta suavemente os tubos para misturar. A quantidade total de sangue necessária para um experimento depende principalmente da taxa de fluxo selecionada. Com uma vazão de 25 mL/h, em slides ibidi 6-well, um volume total de 2 mL com um pouco de excesso para encher banheiras e canal de fluxo é suficiente.
- Transfira o sangue para um tubo de 50 mL e adicione Calcein AM (1:10.000) para rotular fluorescentemente células sanguíneas e Alexa488-fibrinogen (15 μg/mL) para conjugar fibrinogen autólogo. Deixe o sangue incubar a 37 °C por 15 minutos para permitir a absorção completa.
- Diluir o sangue 1:1 com tampão de recalcificação (cloreto de sódio de 154 mM, citrato de trissódico de 10,8 mM, cloreto de cálcio de 2,5 mM e cloreto de magnésio de 2 mM) imediatamente antes do início do experimento.
NOTA: A hemodiluição com no máximo 50% não influenciou o tempo de reação de coagulação30. Além disso, o sangue humano pode conter vírus e outros agentes. Trabalhar com amostras de sangue, portanto, traz um risco de infecção. Recomenda-se a utilização de medidas de segurança adequadas e para manusear o material com cuidado.
4. Montagem do sistema de fluxo
- Antes de conectar a tubulação, enxágüe os tubos de fluxo com uma seringa de 20 mL preenchida com tampão de lavagem (ácido cítrico de 36 mM, cloreto de sódio de 103 mM, cloreto de potássio de 5 mM, 5 mM EDTA e 0,35% wt/vol bovine serum albumina [BSA], pH = 6,5) para evitar a coagulação do sangue nos tubos.
- Use uma nova seringa para encher os tubos de fluxo com tampão HEPES (cloreto de sódio de 132 mM, HEPES de 20 mM, cloreto de potássio de 6 mM, cloreto de magnésio de 1 mM, 1% BSA e 5,5 mM D-glicose, pH = 7,4) e conecte-o cuidadosamente com um conector Luer em forma de cotovelo ao microslídeo preenchido com EC em médio. Ao anexar os conectores aos microcanais, tente evitar a formação de quaisquer bolhas de ar no slide. Bolhas danificarão o endotélio e influenciarão os resultados do seu experimento. Remova completamente o tampão de lavagem e não deixe que o buffer entre em contato com as células, pois isso inibirá a coagulação.
- Configure o sistema de fluxo conforme mostrado na Figura 1E. Tome 2 mL de tampão de lavagem em uma seringa de 20 mL e enxágue para evitar coagulação quando o sangue entra na seringa. Insira a seringa vazia na bomba de seringa e conecte o tubo de saída com um conector Luer feminino a esta seringa. Coloque o tubo de entrada em um recipiente contendo o sangue humano preparado.
- Ligue a bomba de seringa e calcule a taxa de fluxo. Os perfis de fluxo seguem um padrão parabólico em altura. Assumindo que o sangue age como um fluido newtoniano, use a seguinte fórmula para calcular a taxa de fluxo.
(Equação 1)
Onde
τ = estresse de tesoura
η = viscosidade dinâmica
Q = taxa de fluxo volumoso
h = altura do canal
w = largura do canal
NOTA: Para o fluxo arterial pulmonar com sangue nos microslídeos comerciais de 6 canais com dimensões retangulares com altura retangular de 0,4 mm e largura de 3,5 mm, foi utilizada uma taxa de fluxo volumoso de 25 mL/h para 5 min. Devido às diferenças nas dimensões dos canais de fluxo personalizados, essas dinâmicas também mudarão. Ajuste as variáveis para garantir que o estresse da tesoura seja igual. - Defina o diâmetro da seringa de 20 mL até 19,05 mm e ajuste o programa para retirar. Puxar o sangue através do canal revestido de células por aplicação de uma pressão negativa garantirá taxas constantes de tesoura e danos mínimos à camada celular.
(Equação 1)
5. Configuração do microscópio para aquisição de imagens
- Use um objetivo de 20x e coloque o microslídeo no estágio do microscópio fluorescente de contraste de fase invertida. Inicie o software de microscópio para mover o estágio na direção Z para se concentrar na monocamada celular.
- Selecione uma região de interesse (ROI) no início, meio e fim de cada canal de fluxo. O início e o fim devem estar a pelo menos 3 mm de distância da entrada e saída do canal. Coloque os filtros fluorescentes azuis, verdes e vermelhos com uma potência laser e intensidade de luz que mostra o mínimo de fundo.
6. Perfusão de sangue inteiro sobre PAECs
- Depois que tudo estiver conectado como na Figura 1E e o microscópio estiver pronto para gravação, empurre Start para gravar um vídeo. Empurre Comece a bomba de seringa para perfumar o sangue sobre o endotélio.
- Assim que o sangue começar a fluir sobre o endotélio, adquira imagens com os canais ativos pré-selecionados e posições de ROI a cada 15 s por 5 minutos.
- Após 5 minutos de perfusão, termine a gravação e pare a bomba de seringa. Desmonte a câmara de fluxo e remova cuidadosamente o tubo. Muitas vezes, uma bolha de ar se formará se isso for feito com muita força. Tente evitar isso, porque isso vai afastar o endotélio.
7. Fixação e pós-análise
NOTA: Para excluir a adesão de plaquetas falsas positivas por dano endotelial devido ao experimento de perfusão, é necessário caracterizar as células endoteliais para sua formação de lacunas e monocamadas. Isso pode ser feito por uma coloração regular de imunofluorescência para ve-cadherin.
- Após a perfusão e desmontagem da tubulação, lave o canal microfluido com HEPES. Pipeta HEPES para dentro do canal para que ele empurre o sangue para a tomada. Remova o excesso com outra pipeta.
- Opcionalmente, lave o canal com PBS++ (com cloreto de magnésio de 0,5 mM e cloreto de cálcio de 0,9 mM) para evitar a precipitação de supernanato proteico. Isso reduz o histórico. No entanto, uma etapa extra de lavagem pode mudar o comportamento celular e a morfologia que podem influenciar a imagem pós-análise.
- Retire o HEPES e fixe o endotélio com plaquetas aderidas e deposite fibrina por tubulação de 37 °C aquecida 4% de paraformaldeído (PFA) no canal e incubar por 15 min na RT.
NOTA: Tenha cuidado extra ao fixar os microfluidos feitos sob medida, pois esses canais são ainda menores, o que causa maiores forças de corte no canal durante cada etapa de manuseio. - Retire o PFA do canal e lave 3x com PBS. Os microslides estão agora prontos para um protocolo padrão de coloração para caracterizar marcadores celulares endoteliais como VE-cadherin, CD31, P-selectin ou integrins, CD42b para plaquetas aderentes ou CD45 para leucócitos.
- Após a coloração, tire pelo menos cinco imagens com um microscópio confocal regular para caracterizar a colocalização.
8. Análise de imagem
- Abra uma imagem de ensaio de fluxo contendo plaquetas fluorescentes ou fibrina fluorescente no ImageJ. Arraste imagem de escolha para ImageJ.
- A imagem é tirada na cor RGB. Para análise, uma imagem de 8 bits é preferida, então transforme a imagem em 8 bits: Imagem | Tipo | 8 bits.
- Para minimizar o fundo, subtraia com um paraboloide deslizante, onde uma bola rolante calcula e subtrai pixels de fundo da imagem original: Process | Fundo subtraído | Raio da Bola Rolando = 50 pixels | Paraboloide deslizante.
NOTA: O tamanho da imagem é definido em pixels. No entanto, para medir a área, é necessário definir a escala. Quando as imagens são tiradas com um objetivo de 20x com uma abertura numérica de 0,45, o microscópio tem uma escala de 2 pixels por μm. Na maioria das vezes, as informações necessárias para definir a escala são armazenadas nos metadados da imagem e podem ser usadas automaticamente pelo ImageJ: Analyze | Escala definida. - Defina um limiar para definir plaquetas aderidas ou fibrina depositada. Use o método Triângulo e o limiar será ajustado automaticamente: Imagem | Ajuste | Limiar.
- Analise a área coberta pelas plaquetas ou fibrina com o comando Analisar partículas. Tamanho do conjunto em 2-Infinity, como o tamanho mínimo de uma plaqueta é de 2 μm: Analisar | Analisar partículas.
- Os resultados fornecerão a área total em μm2,com tamanho médio dos agregados em μm2 e o percentual de área coberta.
Representative Results
Os resultados representativos podem ser divididos em três partes, cada uma representando as respectivas etapas de configuração experimental, coleta de dados e análise de dados. Dependendo da questão da pesquisa, os parâmetros para cada etapa podem ser alterados. Os dados apresentados são aplicados para estudar a influência do endotélio na formação de trombos.
Configuração experimental
Está bem estabelecido que as células endoteliais são altamente heterogêneas em estrutura e função, dependendo da localização e do tempo, durante a saúde e a doença23. Várias fontes de células endoteliais podem ser usadas para estudar a interação endotelial-sangue, que neste caso estavam disponíveis comercialmente HUVECs e PAECs(Figura 1A). Os HUVECs têm sido os mais comumente utilizados em modelos de laboratório, enquanto os PAECs são células isoladas derivadas do paciente das artérias pulmonares. Além disso, existem protocolos bem estabelecidos disponíveis para isolar as células endoteliais microvasculares (MVEC) da circulação pulmonar ou da colônia endotelial que circula sangue (ECFC)25,,28,,29.
Após o isolamento, as células endoteliais foram caracterizadas pela mancha VE-cadherin, CD31 e TIE2 para confirmar um fenótipo endotelial. Caracterização para a presença de αSMA e citokeratina indicou a ausência de um fenótipo fibroblasto ou epitelial(Figura 1B). Após a obtenção de uma população altamente pura de CEs, as células de passagem 3-5 foram utilizadas para semear um microslídeo comercial ou canais de fluxo microfluido personalizados(Figura 1C). Embora os microslides disponíveis comercialmente sejam principalmente câmaras de fluxo paralelas, ou canais em forma de Y com parâmetros especificamente definidos em ângulo de altura ou bifurcação, o uso de lâminas microfluidas torna possível adaptar os parâmetros experimentais à geometria do vaso in vivo e à dinâmica do fluxo sanguíneo31. No entanto, os tamanhos microfluidos feitos sob medida são menores e tendem a limitar a propagação celular e induzir mais morte celular32,33. O uso de um excedente de células compensa o fato de que apenas uma pequena porcentagem de células vai aderir. Isso foi observado quando uma estenose foi introduzida, onde as células endoteliais apresentaram um fenótipo mais alongado em comparação com um canal microfluido paralelo(Figura 1D). As câmaras de fluxo comercial têm uma área de superfície maior a que as células podem se ligar. Isso requer menos números de células para semeadura.
Para estudar a interação endotelial célula-sangue, o sangue inteiro foi perfundido sobre uma monocamada endotelial. O sangue citrated foi coletado no dia do experimento e imediatamente antes da perfusão recalcificada. As células foram estimuladas com histamina para induzir a liberação de VWF e a adesão plaqueta 30 minutos antes da perfusão(Figura 1E)34,35. Devido às pequenas dimensões, os canais microfluidos personalizados permitiram o uso de volumes sanguíneos menores.
Coleta de dados
Para investigar a formação de trombos em PAECs, calcein AM-Red fluorescentemente rotulado glóbulos e fibrina conjugada Alexa488 foram perfundidas por 5 min a 2,5 dyne/cm2 (Figura 2A–C). As células sanguíneas aderentes e a fibrina depositada foram quantificadas. As imagens foram adquiridas a cada 30 e quantificadas com ImageJ. Era importante subtrair o fundo para eliminar a autofluorescência de plaquetas não aadeadas. O algoritmo triângulo para limiar foi usado para definir o mínimo de fundo. Permitiu a medição de pequenos agregados de plaquetas(Figura 2D).
Espera-se que, em condições não estimuladas, não houvesse ligação de plaquetas e fibrina ao endotélio. Para promover a liberação de VWF e a ligação de plaquetas, os PAECs foram estimulados com histamina, o que resultou em um aumento imediato da adesão de plaquetas atingindo um patamar após 2,5 min. Nessa época, as plaquetas começaram a segregar fatores autocrinos que induziram a agregação de plaquetas e o decote fibrinogênio em fibrina. A fibrina foi depositada após 3 min e formou um agregado estável com plaquetas após 4 min (Figura 2E).
Para investigar se esse efeito poderia ser inibido por um anticoagulante oral direto (DOAC), o sangue foi tratado com dabigatran 10 nM. Dabigatran foi adicionado à diluição sanguínea, onde inibe o Fator IIa na via de coagulação, e impediu que o decote de fibrinogênio formasse fibras de fibrina. Quando o sangue tratado com dabigatran foi perfundido sobre PAECs estimulados, a formação de coágulos poderia ser diretamente inibida principalmente por retardar a deposição de fibrina(Figura 2F).
Análise de dados
Para estudar a influência de várias fontes endoteliais na formação de trombos, foram analisadas as alterações celulares após 5 min de perfusão sanguínea. O endotélio foi fixado e as plaquetas aderentes foram rotuladas com CD42b antes da imagem sob um microscópio confocal. Isso forneceu uma análise detalhada para colocalização de plaquetas e fibrina que poderia indicar fatores de coagulação disfuncional no sangue. A influência da CE na formação de coágulos foi determinada pela coloração imunofluorescente padrão. Os contatos entre células celulares endoteliais foram mantidos, conforme confirmado pela coloração VE-cadherin, indicando que os coágulos sanguíneos se formaram em cima da monocamada endotelial em vez da matriz subjacente entre as lacunas endoteliais(Figura 3). Além disso, o uso de diferentes fontes celulares resultou em diferentes padrões de trombo se formando no endotélio. Os HUVECs são células endoteliais venosas e apresentaram adesão limitada de plaquetas e deposição fibrina, enquanto os pacientes do CTEPH apresentaram adesão de plaquetas abundantes e mais deposição fibrina sobre a estimulação de histamina em comparação com o PAEC saudável. Isso sugere que o endotélio dos pacientes com CTEPH mostra maior capacidade de resposta à vasoativação que resulta em aumento da formação de trombos.
Figura 1: Visão geral do protocolo. (A) Várias fontes e diferentes tipos de células endoteliais foram isoladas e cultivadas para uso em um canal de fluxo microfluido para experimentos de perfusão. Imagens representativas de brightfield de diferentes tipos de células endoteliais. Barra de escala = 50 μm. (B) As células isoladas foram caracterizadas pela coloração imunofluorescente para confirmar um fenótipo endotelial. Barra de escala = 50 μm. (C) As células podem ser semeadas em slides de fluxo comercial ou canal microfluido personalizado. (D) Imagens de campo brilhante representativas do HUVEC cultivadas em diferentes geometrias de canal. Barra de escala = 50 μm. (E) Configuração experimental de experimentos de perfusão sanguínea. O sangue citrated foi coletado, diluído com tampão salino, e perfundido sobre células endoteliais com uma bomba de seringa. A veia pulmonar e umbilical nesta figura foram modificadas a partir da Arte Médica Servier, licenciada sob uma Licença Genérica De Atribuição Comum Criativa 3.0. http://smart.servier.com/ Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Aquisição de imagem e quantificação da formação de trombos. (A) Imagem de lapso de tempo representativo de plaquetas rotuladas calcein AM-Red e fibrina conjugada alexa488 depositada em 1, 3 e 5 min após perfusão de sangue total sobre PAECs não estimulados(B)e sobre PAECs estimulados por histamina. (C) Imagens representativas de lapso de tempo de adesão plaqueta e depoimento de fibrina em 1, 3, e 5 min de perfusão com sangue inteiro incubado com dabigatran perfused sobre PAECs estimulados por histamina. Barra de escala = 50 μm. (D) Visão geral esquemática da quantificação da imagem no ImageJ. (E) Quantificação da adesão plaquetária e deposição de fibrina para cada 30 s em um endotélio não estimulado e histamina estimulada. (F) Quantificação do efeito de dabigatran na formação de trombos quantificado por adesão plaqueta e deposição de fibrina. Os dados são representados como média ± SD, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens confocalas representativas de experimentos de fluxo para caracterizar a formação de trombos na adesão plaquetária e deposição de fibrina em células endoteliais. Os contatos celulares endoteliais foram caracterizados por VE-cadherin e medidos em PAECs de controle, PAECs CTEPH derivados do paciente e HUVEC. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A coagulação é resultado da interação complexa e temporalmente controlada entre o endotélio e os componentes sanguíneos. Este ensaio in vitro apresenta um método para investigar propriedades trombogênicas das células endoteliais em tempo real. Vários tipos de células endoteliais humanas primárias podem ser usadas, facilitando a trombose in situ de forma específica do órgão e do paciente. Neste estudo, ilustramos o uso deste protocolo comparando propriedades trombogênicas de PAECs isolados de doadores saudáveis versus pacientes com CTEPH. A formação de trombos vivos foi estudada por perfusão de sangue inteiro de indivíduos saudáveis sobre endotélio ativado por histamina, enquanto o efeito de um DOAC foi testado como um agente antitrombótico.
Além do uso de microcanais disponíveis comercialmente, como mostrado nos resultados representativos, a introdução dos canais microfluidos personalizados permite o estudo da influência das mudanças de geometria vascular na formação de trombos. Por exemplo, a diminuição do fluxo em um ponto de ramificação ou estenose resulta em um aumento do estresse de cisalhamento e mais ativação plaquetária36. No entanto, uma limitação significativa desses canais microfluidos personalizados é a exigência de números de células elevadas para formar uma monocamada estável de CEs, conforme descrito na etapa 2.3.2. Isso pode apresentar um fator limitante quando as células derivadas do paciente são escassas. Os pontos fortes dos microslides disponíveis comercialmente são que as áreas superficiais são modificadas para a cultura celular e as áreas de crescimento são maiores, permitindo assim que os CES formem uma monocamada confluente e estável. Por outro lado, uma área de superfície maior resultará em um lúmen maior. De acordo com a Equação 1,isso requer maiores volumes sanguíneos para atingir taxas de fluxo semelhantes às dos microfluidos feitos sob medida.
Uma melhoria nesse protocolo pode ser investigar a perda de CE ao vivo ou mudanças na integridade da barreira. Os danos ce neste protocolo só são medidos no final do experimento. Para rastreamento ao vivo, os CES podem ser marcados com mCherry VE-cadherin, por exemplo37. No entanto, como isso precisaria de um protocolo altamente otimizado com transfecção eficiente do vírus, o Sensor de Impedância de Células Elétricas (ECIS) poderia ser usado como alternativa para estudar a integridade endotelial e a função de barreira38. A perfusão sobre canais especiais de fluxo ECIS permite o monitoramento longitudinal da integridade da barreira endotelial sob fluxo. Essas características específicas do ECIS permitem medições paralelas de propriedades de barreira endotelial e formação de trombos. Formas alternativas para medidas paralelas de barreira de CE, especialmente nas matrizes personalizadas incluem o uso de dextrans fluorescentes no perfusato, que difundem fora do lúmen, dependendo das propriedades da barreira CE.
Uma limitação do protocolo descrito é que as CES são removidas do corpo humano e cultivadas no plástico da cultura tecidual, que é um substrato rígido e artificial. As células se adaptam ao seu ambiente biofísico. Isso poderia possivelmente afetar a resposta endotelial à ativação da plaqueta, pois há associação entre ativação plaquetária e rigidez da parede39. Apesar dessas adaptações aos plásticos culturais, as células mantêm características específicas da doença que podem ser identificadas em comparação direta com os CEs derivados de doadores saudáveis, como mostrado com o controle, CTEPH-PAEC e HUVEC que exerciam diferentes padrões de adesão plaquetária e deposição fibrina após 5 minutos de perfusão sanguínea.
Em contraste com outros protocolos, este sistema utiliza sangue inteiro enquanto outros estudam a interação da CE com um único componente sanguíneo, como plaquetas e leucócitos19,,20,,21. Foram desenvolvidos modelos microfluidos mais avançados que permitem o estudo da função endotelial em um modelo vascular com geometria de vaso redondo e matriz extracelular macia. No entanto, estes são otimizados com HUVECs40,41,42. A novidade do protocolo descrito é o uso de CEs primários combinados com sangue inteiro trazendo a modelagem da trombose in situ um passo mais perto das condições in vivo. Ter otimizado o protocolo para o uso de CEs derivados do paciente e do sangue derivado do paciente otimiza ainda mais a modelagem da doença in vitro,permitindo a avaliação da formação personalizada de trombos e tratamento medicamentoso.
O protocolo descrito pode ser aplicado para estudar o efeito de terapias anticoagulação em células derivadas do paciente. Enquanto usamos dabigatran para inibir a formação de trombos, é possível usar outros anticoagulantes, como o rivaroxaban, que inibe diretamente o fator Xa na cascata de coagulação. Inibidores de plaquetas diretas como clopidogrel ou aspirina também podem ser estudados, pois estes agem na fase primária da hemostase onde plaquetas se ligam às CE. Em última análise, as capacidades trombogênicas das CEs específicas do paciente em interação com o próprio sangue do paciente podem ser usadas para prever o efeito pessoal da terapia anticoagulação no paciente individual. Além disso, um knockdown de proteínas específicas pode fornecer informações funcionais adicionais.
Existem algumas etapas no protocolo descrito que são fundamentais para um experimento de perfusão bem sucedido. Primeiro, durante o isolamento das células primárias, é necessário obter uma cultura ce altamente pura. Em segundo lugar, é importante que as CEs formem uma monocamada confluente estável. Se este não for o caso, uma pequena mudança no estresse da tesoura pode causar danos endoteliais e ativação da cascata de coagulação, ou plaquetas podem começar a se ligar à membrana do porão, o que fornecerá resultados falsos positivos. Em terceiro lugar, é essencial prevenir bolhas de ar, pois elas podem danificar o endotélio e, assim, influenciar os resultados.
Após a recalcificação do sangue citrado com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, é importante iniciar imediatamente o experimento de perfusão. A recalcificação induz uma resposta rápida na ativação plaquetária e na formação de trombos, resultando em coagulação rápida na amostra.
Em conclusão, descrevemos um protocolo altamente versátil para estudar interações células endoteliais sanguíneas inteiras durante a trombose.
Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a Jan Voorberg, do Departamento de Proteínas Plasmáticas, Sanquin Research e Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Holanda, por sua contribuição neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Aliança CardioVascular Holandesa (DCVA) [2012-08, 2014-11] concedida ao Consórcio Phaedra e ao Reconecte, bem como a concessão do Impulso 2018 concedida ao consórcio Phaedra IMPACT. Essas bolsas incluem financiamento coletivo da Dutch Heart Foundation, Federação Holandesa de Centros Médicos Universitários, Organização Holandesa para Pesquisa e Desenvolvimento em Saúde e Academia Real de Ciências dos Países Baixos. Além disso, este trabalho foi financiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa no âmbito do programa Advanced Grant 'VESCEL' (Número de subvenção: 669768). O XDM é financiado por uma bolsa de pesquisa do Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) no VU University Medical Center, em Amsterdã, nos Países Baixos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL syringe | BD | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 100244 | |
| Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 2478269 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 106448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
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