Method Article

Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron

DOI:

10.3791/61081

⸱

June 12th, 2020

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

In This Article

Summary

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Utilizamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter espécimes de osso cortical de tamanho uniforme para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método é minimamente destrutivo, eficiente, resulta em espécimes cilíndricos que minimizam artefatos de imagem de formas de amostra irregulares e melhora a visualização e análise microarquitetural.

Abstract

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O osso é um tecido dinâmico e mecanicamente ativo que muda de estrutura ao longo da vida humana. Os produtos do processo de remodelação óssea foram estudados substancialmente utilizando técnicas bidimensionais tradicionais. Os recentes avanços na tecnologia de imagem de raios-X por meio da tomografia microcomputante de desktop (μCT) e da tomografia microcomputante de radiação síncrotron (SRμCT) permitiram a aquisição de varreduras tridimensionais de alta resolução (3D) de um campo de visão maior (FOV) do que outras técnicas de imagem 3D (por exemplo, SEM) fornecendo uma imagem mais completa de estruturas microscópicas dentro do osso cortical humano. A amostra deve ser centrada com precisão dentro do FOV, no entanto, para limitar o aparecimento de artefatos de raia conhecidos por impactar a análise de dados. Estudos anteriores relataram a aquisição de blocos ósseos retilineares de forma irregular que resultam em artefatos de imagem devido a bordas irregulares ou truncação de imagem. Aplicamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método de coring é eficiente e minimamente destrutivo para o tecido. Ele cria amostras cilíndricas uniformes que diminuem artefatos de imagem por natureza de ser isométrico durante a rotação e fornecendo um comprimento de caminho uniforme para raios-X durante a varredura. O processamento de imagens de dados tomográficos de raios-X de amostras cored e de forma irregular confirma o potencial da técnica para melhorar a visualização e análise da microarquitetura óssea cortical. Um objetivo deste protocolo é fornecer um método confiável e repetível para a extração de núcleos ósseos corticais que são adaptáveis para vários tipos de experimentos de imagem óssea de alta resolução. Um objetivo abrangente do trabalho é criar uma aquisição padronizada de ossos cortical para SRμCT que seja acessível, consistente e simples. Esse procedimento pode ser adaptado ainda por pesquisadores de áreas relacionadas que comumente avaliam materiais compostos duros, como na antropologia biológica, geociências ou ciências materiais.

Introduction

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Com os recentes avanços na tecnologia de imagem, agora é viável adquirir dados de imagem de raios-X com resolução muito alta. Os sistemas de microcC (μCT) da área de trabalho são o padrão atual para imagens de osso cancelado devido à sua natureza não destrutiva1. Quando as características microestruturais de imagem do osso cortical, no entanto, o uso de μCT tem sido mais limitado. Devido a restrições de resolução, os sistemas de desktop não podem atingir a resolução necessária para a imagem de recursos microestruturais menores que os poros corticais, como a lacuna de osteociato. Para esta aplicação, o SRμCT é ideal devido à maior resolução dess....

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Protocol

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Todos os espécimes foram provenientes de doadores cadavéricos embalsamados na Universidade de Toledo, Faculdade de Medicina e Ciências da Vida e na Universidade Médica do Nordeste de Ohio (NEOMED), com o consentimento informado do próprio doador ou dos parentes mais próximos do doador. O Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Akron para a Proteção dos Sujeitos Humanos (IRB) considerou esses espécimes isentos de revisão completa do IRB, pois não foram adquiridos de indivíduos vivos. Informações demográficas, incluindo idade, sexo e causa da morte estavam disponíveis para todos os doadores. Os indivíduos selecionados não apresentaram condições de afetação ....

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Results

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O método descrito de amostragem do núcleo mostrou-se altamente eficaz e eficiente. Os espécimes de coring usando este protocolo permitiram a aquisição de amostras de >300 consistentemente dimensionadas para experimentos na linha de feixe CLS BMIT-BM2, com um FOV de ~2 mm a 1,49 μm de tamanho voxel. Para validar a consistência do diâmetro do núcleo, foram realizadas três medidas ao longo do comprimento (superior, médio, inferior) de um subconjunto de núcleos femorais anteriores humanos (n

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Discussion

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Não houve nenhum protocolo abrangente e padronizado para a aquisição de amostras de núcleo ósseo cortical uniforme e cilíndrico para imagens SRμCT de alta resolução com configurações fov limitadas. O protocolo aqui detalhado preenche esse vazio fornecendo um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para imagens SRμCT e a visualização e extração precisa subsequente de dados microarquiteturais. Mostramos que nosso protocolo fornece um método mais padronizado e confiável .......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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A pesquisa descrita neste artigo foi realizada na instalação do BMIT na Canadian Light Source, que é apoiada pela Fundação canadense para Inovação, Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá, universidade de Saskatchewan, governo de Saskatchewan, Diversificação Econômica Ocidental do Canadá, Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Os autores gostariam de agradecer aos cientistas de linha de luz canadenses na Canadian Light Source, particularmente Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov e Ning Zu pela assistência na configuração e solução de problemas dos sistemas de microscópio SkyScan SRμCT e feixe ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Carboneto de corte de imersão de 1-1/8" para compósitosWarrior6181228.6mm plunge
70% EtanolFisher ScientificBP82015003.8 Litros
Pinça de ponta rombaFisher Scientific10-300
Tubos de centrífugaThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxyTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Baixe e instale no https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Kit de ferramentas odontológicasAmazon787269885110
Lâmina de serra de wafering de diamante para material compósitoBuehler# 11-4247
Drill PressJet Mill / Drill350017Modelo: JMD-15, as furadeiras de bancada são substratos adequados, mas normalmente não possuem uma mesa de máquina traduzível para posicionar amostras abaixo da haste da broca
Pinça de ponta finaFisher Scientific22-327379
Grampos de fixação para mesa de máquina XY para fresa/brocaMSC Industrial Supply#04804571
Lâminas de microscópio de vidroTed Pella26005lâminas de 75x50mm, 1mm de espessura
Mandril de vidroBuehler#112488Grande o suficiente para acomodar slides de vidro de 75x50mm
Placa quente capaz de atingir 140 ° CThermoScientificHP88850105
IncubadoraNAPCOModelo 4200
Isocut FluidBuehler111193032Lubrificante; Broca
diamante de joalheiroOtto Frei#119.050Broca de haste oca de diâmetro interno de 2mm
NReconBruker microCTv.1.6.10.2Baixe e instale em https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Serra oscilanteHarbor Freight62866
Pratos de vidro seguros para fornoPyrex1117715Recipiente de armazenamento de alimentos de vidro
Serra de precisão de baixa velocidade (Isomet 1000)Buehler111280160
Amazon25181
Latas de alumínio rasasAmazonB01MRWLD0R~ 8 cm de diâmetro
Copos de amostraAmazon616784425436 885334344729
Tergazyme detergenteAlconox1304-1caixa de 1,8 kg
Limpador ultrassônicoMTI CorporationKJ201508006
de de 30mL Lâminas de barbear

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al.

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Cortical Bone ProcurementSynchrotron Micro CTBone Core SamplingImage Processing GuideSectioning and CoringHigh Throughput AnalysisBone Specimen PreparationMicro CT Artifact ReductionCylindrical Bone SamplesBone Microarchitecture Analysis

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