Avaliação Biventricular da Função Cardíaca e Alças Pressão-Volume por Cateterismo Fechado de Tórax em Camundongos

Resumo

Apresentamos um protocolo para avaliar a função cardíaca biventricular em camundongos por meio da geração de alças pressão-volume (VP) do ventrículo direito e esquerdo no mesmo animal por meio de cateterismo torácico fechado. O foco está no aspecto técnico da cirurgia e na aquisição de dados.

Resumo

A avaliação da função cardíaca é essencial para a realização de pesquisas pré-clínicas cardiovasculares e pulmonar-vasculares. As alças pressão-volume (alças PV) geradas pelo registro da pressão e do volume durante o cateterismo cardíaco são vitais na avaliação da função cardíaca sistólica e diastólica. As funções cardíacas esquerda e direita estão intimamente relacionadas, refletindo-se na interdependência ventricular. Assim, o registro da função biventricular em um mesmo animal é importante para uma avaliação completa da função cardíaca. Nesse protocolo, uma abordagem torácica fechada para cateterismo cardíaco consistente com a forma como o cateterismo é realizado em pacientes é adotada em camundongos. Embora desafiadora, a estratégia de tórax fechado é uma abordagem mais fisiológica, pois a abertura do tórax resulta em grandes mudanças na pré-carga e pós-carga que criam artefatos, principalmente uma queda na pressão arterial sistêmica. Enquanto a ecocardiografia de alta resolução é usada para avaliar roedores, o cateterismo cardíaco é inestimável, particularmente quando se avalia as pressões diastólicas em ambos os ventrículos.

Descreve-se aqui um procedimento para a realização de alças invasivas, fechadas de tórax, sequenciais de pressão-volume do ventrículo esquerdo e direito no mesmo animal. As alças fotovoltaicas são adquiridas utilizando tecnologia de admitância com cateter de pressão-volume de camundongo e aquisição do sistema pressão-volume. O procedimento é descrito, iniciando-se com o esvaziamento cervical, necessário para acessar a veia jugular direita e a artéria carótida direita, até a inserção e posicionamento do cateter e, finalmente, a aquisição dos dados. Em seguida, são discutidos os critérios necessários para garantir a aquisição de malhas fotovoltaicas de alta qualidade. Finalmente, a análise das alças das VVPP dos ventrículos esquerdo e direito e os diferentes parâmetros hemodinâmicos disponíveis para quantificar a função ventricular sistólica e diastólica são brevemente descritos.

Introdução

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a doença cardíaca é a principal causa de morte em homens e mulheres^{no mundo1,2,3}. Muitos estudos se concentram em diagnosticar e melhorar a função cardíaca comprometida⁴. Para essas aplicações, a avaliação da função cardíaca é fundamental de alta qualidade e reprodutibilidade. Dados de alta fidelidade e reprodutibilidade do cateter são necessários para avaliar as respostas etiológicas e terapêuticas. Por exemplo, a avaliação da função cardíaca é essencial para avaliar a eficácia de fármacos e outros tratamentos em modelos pré-clínicos de infarto do^miocárdio5. Enquanto muitos estudos cardiovasculares se concentram na função ventricular esquerda, a função ventricular direita também é um determinante crítico da capacidade funcional e do prognóstico em pacientes com doença^{pulmonar-vascular6,7}. Em pacientes com insuficiência cardíaca avançada, pressões de enchimento persistentemente elevadas do lado direito e do lado esquerdo são preditivas do risco combinado de morte, hospitalização cardiovascular e transplante cardíaco⁸. Na valvopatia aórtica e mitral combinadas, a função miocárdica pré-operatória (refletida em parâmetros como índice cardíaco e fração de ejeção do ventrículo esquerdo) é o principal preditor de sobrevida em longo^prazo9. A função ventricular direita é o principal preditor de morbidade e mortalidade na hipertensão arterial pulmonar^10,11. Assim, a avaliação da função ventricular direita é um componente necessário de um amplo estudo pré-clínico utilizando modelos de hipertensão arterial pulmonar^12,13,14.

As funções ventricular esquerda e direita são frequentemente estudadas de forma independente. Entretanto, como as funções dos ventrículos esquerdo e direito estão intimamente ligadas, o ideal é obter uma avaliação biventricular da função sistólica e diastólica a partir de um único exame¹⁵. Por exemplo, o ventrículo direito compartilha fibras oblíquas do septo interventricular com o ventrículo esquerdo, o que constitui um dos elos mecânicos entre a função contrátil do ventrículo esquerdo e direito^16,17. Esse fenômeno, conhecido como interação ventricular sistólica, permite que a contração ventricular esquerda aumente a contração ventricular direita. Interações ventriculares durante a diástole também são importantes. Durante a diástole, o volume de um ventrículo influencia o volume do ventrículo oposto e, assim, altera a complacência diastólica e a pré-carga^18,19. Em condições patológicas, a função diminuída de um ventrículo ou a carga volêmica prejudicada podem comprometer direta ou indiretamente a função do outro ventrículo²⁰. Como consequência da interação ventricular sistólica, uma diminuição global da função ventricular esquerda pode reduzir o desempenho contrátil do ventrículo direito¹⁵. Em pacientes com insuficiência cardíaca devido à função sistólica do ventrículo esquerdo e aumento da pressão diastólica final, a pressão da artéria pulmonar está elevada, aumentando indiretamente a pós-carga do ventrículo direito^21,22. Por outro lado, o aumento da pressão ventricular direita e a sobrecarga de volume na hipertensão pulmonar grave exercem uma compressão mecânica sobre o coração esquerdo. Esse achatamento em forma de D do ventrículo esquerdo, causado por um desvio para a esquerda no septo interventricular, reduz os volumes do ventrículo esquerdo e prejudica a função sistólica e diastólica 23,24,25,26,27. Assim, a avaliação dos ventrículos esquerdo e direito é essencial para avaliar a função cardíaca global em modelos pré-clínicos de doença humana.

A função cardíaca também pode ser avaliada por ecocardiografia não invasiva, ressonância magnética (RM) e cateterismo invasivo^28,29,30. A ecocardiografia é a modalidade de imagem mais utilizada na pesquisa cardiovascular, por ser relativamente barata e^acessível31. No entanto, a ecocardiografia tem várias limitações técnicas, incluindo a medida indireta da pressão de enchimento e a capacidade limitada de quantificar a função diastólica. Além disso, a qualidade dos dados obtidos pela ecocardiografia é altamente operador-dependente. A RMC é uma adição relativamente nova ao arsenal de imagem pré-clínica que tem grande potencial para avaliação quantitativa da função biventricular. A quantificação com RMC é precisa, pois não faz suposições geométricas da forma ventricular, ao contrário da ecocardiografia³². No entanto, a plataforma de imagem por RM é cara e raramente está disponível. Além disso, o processamento de dados de RM requer suporte qualificado por um físico ou cientista equivalente, o que é escasso em muitos laboratórios pré-clínicos³³. Da mesma forma, o uso da microtomografia computadorizada (MicroCT) em estudos pré-clínicos fornece dados anatômicos quantitativos tridimensionais (3D) de alta resolução que podem ser obtidos de forma não invasiva, permitindo estudos longitudinais34. No entanto, a MicroTC requer a injeção de agentes de contraste, que muitas vezes são caros. A plataforma de imagem MicroCT, como a ressonância magnética, também é cara e também requer um técnico qualificado.

Já o cateterismo é uma técnica invasiva que consiste na introdução de um cateter no ventrículo direito e/ou esquerdo para medir pressão e/ou volume. As ferramentas necessárias para realizar cateterismo cardíaco não são tão caras quanto a ecocardiografia, a TC ou a RM. No entanto, é necessária proficiência técnica substancial para cateterismo e anestesia de pequenos animais. O cateterismo permite avaliações diretas e precisas da função cardíaca²⁸. Nesse protocolo, um cateter PV de admissão é utilizado para avaliar a função cardíaca. Essa tecnologia, baseada nas distintas propriedades de condutância elétrica do sangue e do músculo cardíaco, permite o registro simultâneo de pressão e volume dentro da cavidade cardíaca e a geração de alças fotovoltaicas em tempo real ^5,35. Resumidamente, o cateter é composto por eletrodos de excitação e eletrodos de registro. Os eletrodos de excitação geram um campo elétrico dentro do ventrículo direito ou esquerdo. O eletrodo de gravação interno mede a mudança de tensão, que é proporcional a uma mudança na resistência. O volume ventricular derivado é baseado na lei de Ohm (voltagem = corrente x resistência) a partir da qual a condutância (isto é, o inverso da resistência) é calculada. Nesse cenário, o valor de condutância medido é uma combinação de condutância sanguínea e condutância muscular. No campo elétrico, o sangue é puramente resistivo, enquanto o músculo tem propriedades capacitivas e resistivas. A propriedade capacitiva do músculo causa um atraso de tempo no sinal medido. O rastreamento desse atraso, conhecido como ângulo de "fase", relata a intrusão do tecido cardíaco no campo à medida que o coração se contrai. Essa medida é maior na sístole e menor na diástole. Essa propriedade permite a separação do componente muscular da condutância do sangue e permite uma aproximação próxima dos volumes sistólico e diastólico absolutos. As alças pressão-volume fornecem uma variedade de parâmetros hemodinâmicos que não são prontamente mensuráveis por outros métodos, como o simples cateterismo retrógrado usando cateteres preenchidos com líquido para medir as pressões cardíacas. As alças pressão-volume medem as pressões ventriculares, mas também fornecem dados sobre contratilidade, elastância, potência, energia e eficiência. Além disso, as malhas fotovoltaicas fornecem medições quantitativas robustas³⁶. Assim, a avaliação da função cardíaca por alças PV geradas pelo cateterismo emergiu como padrão-ouro em pesquisas pré-clínicas³⁷. Além disso, técnicas pré-clínicas são relevantes para a doença humana, onde o cateterismo cardíaco, embora com cateteres preenchidos por líquido, é comum. No entanto, o cateterismo cardíaco em roedores requer anestesia impecável e excelente técnica para evitar perda excessiva de sangue, hipoventilação ou alterações na temperatura corporal.

Em pacientes humanos, o cateterismo cardíaco é realizado em configuração torácica fechada e o acesso vascular é feito pela veia jugular ou subclávia para o ventrículo direito e pela artéria radial ou femoral para o ventrículo esquerdo. Devido ao pequeno tamanho dos camundongos, a abordagem do tórax fechado é muitas vezes desafiadora. Assim, estudos realizados em camundongos comumente adotam uma abordagem de tórax aberto. Essa técnica envolve a abertura do tórax, a exposição do coração e a facilitação da inserção do cateter por punção do ápice do ventrículo esquerdo e/ou^direito38. Embora essa abordagem seja tecnicamente menos desafiadora e razoavelmente reprodutível, suas principais limitações incluem hemorragia e outras complicações da inserção apical de cateteres, e uma queda acentuada na pressão intracardíaca resultante da abertura da cavidade torácica à pressão atmosférica. A abertura do tórax em roedor ventilado induz diminuição de 5–10 mm Hg na pressão sistólica do ventrículo esquerdo e de 2–5 mm Hg na pressão ventricular direita³⁹. Dessa forma, desenvolveu-se, portanto, uma abordagem torácica fechada, menos traumática para o coração e que produz medidas fisiologicamente mais relevantes e que são mais facilmente traduzidas para a avaliação clínica da função cardíaca.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes éticas e de biossegurança da Queen's University (ROMEO/TRAQ#6016826). Os procedimentos seguidos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais. Este é um procedimento terminal. Devido à invasividade dos cateterismos direito e esquerdo, os animais devem ser eutanasiados imediatamente após a aquisição dos dados. A eutanásia deve ser realizada de acordo com as diretrizes de estudos em animais da instituição.

1. Preparação e montagem experimental

1. Colocar o cateter em seringa de 10 mL com soro fisiológico/heparina, em temperatura ambiente 30 min antes de iniciar o experimento (Figura 1A).
2. Após 30 min, calibre o cateter (por exemplo, linha de base e sistema de aquisição) de acordo com as recomendações do fabricante. O sistema de aquisição apresenta altos e baixos valores de calibração que são usados para calibrar o sistema de aquisição antes de iniciar um experimento. Produza esses valores e certifique-se de que eles correspondam.
   1. Use o botão "Controle de equilíbrio de pressão", "Grosso +/- " ou "Fino +/-" para configurar o valor de pressão basal em zero.
   2. Execute uma calibração de dois pontos para sinal alto e baixo.
      1. No console de controle, pressione "Configuração do sistema" no "Menu do cateter".
      2. Pressione "Send Calibration Signal" no "System Setting Menu" para enviar o sinal baixo. Certifique-se de que a pressão, o volume, a fase e a magnitude estejam em 0 mm Hg, 0 μL, 0° e 0 μs, respectivamente.
      3. Pressione "Enter" para enviar o sinal alto. Certifique-se de que a pressão, o volume, a fase e a magnitude estejam a 100 mm Hg, 150 μL, 20° e 5.000 μs, respectivamente.
      4. Pressione "Enter" para retornar ao "System Setting Menu".
      5. Pressione "6" para retornar ao "Menu do cateter". Em seguida, pressione "Adquirir dados".
3. Dobrar uma agulha de 30 G a aproximadamente 90° (Figura 1B,C). Esta agulha dobrada será usada para puncionar os vasos jugulares e carotídeos.

2. Anestesia e controle da temperatura corporal

1. Coloque o camundongo (28 g, C57BL/6 neste protocolo) em uma câmara de anestesia contendo gás anestésico (isto é, oxigênio 100%, isoflurano 3–4% para indução).
2. Quando o animal estiver anestesiado, não respondendo ao aperto da pata ou da cauda, coloque o rato em decúbito dorsal sobre a almofada térmica regulada a 37 °C.
3. Conecte o mouse ao respirador através de um cone nasal fornecendo uma mistura de 100% de oxigênio e 2% de isoflurano. Para calcular automaticamente as configurações de ventilação recomendadas, insira o peso do animal no software proprietário do ventilador usando a tela sensível ao toque. Os cálculos usam a seguinte fórmula:
   Volume corrente = 6,2 x massa animal^1,01 (kg),
   Taxa respiratória = 53,5 x massa ^animal-0,26 (kg).
4. Ligue a linha anestésica da câmara de anestesia para o cone nasal.
5. Insira a sonda de feedback de temperatura no reto e a sonda de almofada entre a almofada e a parte de trás do mouse, definindo a temperatura corporal desejada para 37 °C a 37,5 °C. Controle a temperatura do animal na tela do monitor (Figura 2A,B).
6. Colocar fita adesiva nas patas dianteiras e uma pata distal do camundongo na manta de aquecimento com fita cirúrgica, deixando uma pata traseira livre para monitorar a profundidade da anestesia.

3. Acesso ao Sítio Cirúrgico

1. Realizar uma incisão cervical ventral ventral em forma de H de 2 cm do manúbrio até o nível do osso hioide.
   1. Reflita a pele longe dos músculos subjacentes. Se necessário, esses músculos podem ser excisados para melhor visualização.
   2. Mova suavemente a glândula submandibular para o lado.
   3. Dissecar o tecido mole cervical e expor o esternocleidomastoideo e o músculo esterno-hioideo com pinça pelo método de dissecção romba.
   4. Dividir a fáscia ao meio, sobrepondo o esterno-hióideo emparelhado. Permitir que o esterno-hioideo pareado se retraia lateralmente para expor a traqueia. Tenha cuidado para não danificar as artérias carótidas e os nervos vagos, que correm ao lado da traqueia.
2. Passe pinças por baixo da traqueia para elevá-la. Em seguida, passar uma sutura cirúrgica de seda 4.0 por baixo da traqueia e fazer um nó potencial no meio da sutura, que posteriormente será apertado para fixar o tubo endotraqueal (Figura 3A).
3. Usando tesoura, faça um pequeno corte entre os anéis de cartilagem da traqueia abaixo do nível da laringe. Inserir o tubo endotraqueal (Figura 3B).
4. Conecte o tubo de traqueostomia ao respirador e inicie a ventilação com oxigênio a 100% e isoflurano a 2%. Aperte o nó ao redor da traqueia para fixar o tubo endotraqueal e tape a tubulação do respirador na mesa cirúrgica. Certifique-se de que a traqueia não esteja obstruída ou colapsada (Figura 3C).

4. Isolamento da jugular direita e da carótida direita

1. Isolamento da carótida direita
   1. Com dissecção romba, deslocar lateralmente o músculo esterno-hioideo para expor e isolar a artéria carótida direita.
   2. Isolar a artéria carótida do nervo vago por dissecção romba com pinças.
   3. Passar três suturas cirúrgicas (4,0) abaixo da artéria carótida, excluindo-se o nervo vago.
2. Isolamento da veia jugular direita
   1. Deslocar lateralmente a glândula submandibular e parótida para visualização da veia jugular direita. Dissecar e expor a veia jugular direita com fórceps. Disseque cuidadosamente a veia e remova a fáscia circundante.
   2. Passe pinça por baixo da veia jugular.
   3. Passe uma sutura cirúrgica por baixo da veia jugular e, em seguida, amarre-a no lado cranial da veia. Aplicar tração suave sobre esta sutura na direção da cabeça usando uma pinça hemostática.
   4. Passe duas suturas adicionais sob a veia jugular. Puxar suavemente a sutura mais distal no sentido caudal com pinça hemostática. Faça um nó solto e potencial na sutura do meio.
   5. Coloque várias gotas de soro fisiológico aquecido no vaso no local da venotomia antecipada.

5. Procedimentos cirúrgicos para cateterismo de ventrículo direito e ventrículo esquerdo

1. Cateterismo de ventrículo direito (Figura 4 A–D).
   1. Usando o estereomicroscópio, identificar a veia jugular.
   2. Aplique suavemente tração superior na veia. Realizar uma venotomia inserindo uma agulha curva de 30 G entre a sutura craniana e a sutura média. Insira a agulha em um ângulo de 140° em relação à veia para garantir que ela entre de maneira coaxial.
   3. Quando inserida, dilatar a venotomia movendo a agulha. Insira a ponta do cateter na venotomia, embaixo da agulha. Em seguida, amarre suavemente a sutura média, fixando o cateter.
      OBS: Tome extremo cuidado para não amarrar a sutura com muita força, pois o excesso de força pode danificar o cateter.
   4. Solte a sutura caudal e avance o cateter para o ventrículo direito, detectando a onda clássica de pressão do ventrículo direito em um monitor contínuo.
   5. Estabilizar a pressão ventricular direita. Garantir o posicionamento correto do cateter no ventrículo direito para gerar uma alça PV ideal.
      1. Estabilizar a magnitude, que reflete o sangue e o músculo, para gerar laços pressão-magnitude (ou seja, pressão do eixo Y, magnitude do eixo X). Se necessário, gire suavemente a haste do cateter para obter o posicionamento ideal do cateter ao longo do eixo do ventrículo direito.
         NOTA: O valor máximo de fase, que reflete o músculo, deve estar abaixo de 7°.
   6. Quando o sinal de loop de pressão-magnitude estiver ideal, pressione "Enter" no console durante a aquisição para executar uma varredura de linha de base. Certifique-se de que a frequência cardíaca informada na tela do monitor em batimentos por minuto (bpm) esteja em uma faixa fisiológica (ou seja, 400-600 bpm).
   7. Gere os loops fotovoltaicos. Altere "Magnitude" para "Volume" como um parâmetro para o eixo X e mantenha a pressão como o eixo Y. Quando o sinal de loops fotovoltaicos estiver ideal, grave por 30 s.
   8. Pare a gravação. Puxe o cateter e limpe suavemente com gaze. Coloque o cateter em solução de heparina/cloreto de sódio e amarre a sutura caudal para parar o sangramento da veia jugular.
2. Cateterismo do ventrículo esquerdo (Figura 5 A–D).
   1. Elevar suavemente a carótida direita, que foi previamente isolada (5A) por pinça curva deslizante sob a artéria.
   2. Amarrar a sutura anterior, ocluindo a artéria. Em seguida, aplique suavemente a tração direcionada cranialmente usando uma pinça hemostática.
   3. Puxar a sutura mais distal no sentido caudal com pinça hemostática. Faça um nó potencial solto na sutura média.
   4. Coloque várias gotas de soro fisiológico aquecido no vaso no local da arteriotomia prevista. Foco na secção craniana, entre a sutura caudal e média, utilizando o microscópio estereotáxico.
   5. Aplique suavemente tração superior na artéria. Realizar arteriotomia, inserindo uma agulha curva de 30 G entre a sutura craniana e a sutura média. Insira a agulha a 140° em relação à artéria para garantir que ela entre de maneira coaxial.
   6. Insira a ponta do cateter na arteriotomia e, em seguida, aperte a sutura do meio para fixar o cateter. Simultaneamente, solte a sutura distal e avance o cateter para dentro da aorta para iniciar o registro. Certifique-se de que o canal de pressão mostre um traço típico da aorta.
   7. Avançar o cateter retrógrado através da valva aórtica para o ventrículo esquerdo. A entrada no ventrículo esquerdo será evidente a partir da queda brusca e acentuada da pressão diastólica da aorta.
   8. Estabilizar a pressão ventricular esquerda. Garantir o posicionamento correto do cateter no ventrículo esquerdo para gerar uma alça PV ideal.
      1. Estabilizar a magnitude, que reflete o sangue e o músculo, para gerar laços pressão-magnitude (ou seja, pressão do eixo Y, magnitude do eixo X). Se necessário, gire suavemente a haste do cateter para obter o posicionamento ideal do cateter ao longo do eixo do ventrículo esquerdo.
         NOTA: O valor máximo de fase, que reflete o músculo, deve estar abaixo de 7°.
   9. Pare a gravação. Puxe o cateter e coloque-o em solução de heparina/cloreto de sódio. Em seguida, amarre a sutura caudal.
   10. Limpe o cateter com um detergente enzimático (por exemplo, endozime).
       OBS: Após a cirurgia, eutanasiar o animal de acordo com as diretrizes de estudos em animais da instituição. 

6. Análise dos dados

1. Realizar a análise do circuito fotovoltaico de acordo com as recomendações estabelecidas.
   1. Selecione o traço de pressão-volume ideal (idealmente uma gravação completa e estável de 30 s). No software, clique em "Avançar", clique em "Loops" e, em seguida, clique em "Cálculo off-line".
   2. Selecione volume como canal de volume e pressão como canal de pressão.
   3. Para resultados consistentes é necessário um mínimo de 20 loops.

Resultados

O cateter foi colocado em seringa de 10 mL contendo solução salina heparinizada à temperatura ambiente 30 minutos antes do cateterismo (Figura 1A). Uma agulha 30G foi dobrada ~90° (Figura 1B, C) e uma cânula de traqueostomia de 1,45 mm de diâmetro foi preparada (Figura 1C).

A manutenção da temperatura corporal fisiológica é fundamental. O rato foi preso e conectado ao respirador através de um cone nasal. A sonda de feedback foi colocada entre a almofada e a parte posterior do mouse. Uma sonda retal foi inserida para monitorar a temperatura corporal do animal (Figura 2A). A temperatura corporal (37,1 °C) e a temperatura do coxim (40,7 °C) foram monitoradas (Figura 2B).

Fotografias das etapas críticas do procedimento de intubação são exibidas na Figura 3A–C. A intubação bem-sucedida e desobstruída resultou em frequência respiratória regular com pico de pressão estável (Figura 2B).

A Figura 4D mostra as imagens das etapas críticas do cateterismo cardíaco direito, desde o isolamento da veia jugular (Figura 4A–C) até a inserção do cateter na veia jugular. A Figura 5 mostra as etapas críticas do cateterismo cardíaco esquerdo, incluindo o isolamento da artéria carótida direita (Figura 5 A,B) e a inserção do cateter (Figura 5 C,D)

O cateter foi introduzido na veia jugular e avançado para o ventrículo direito. Em seguida, estabilizou-se a pressão ventricular direita e verificou-se o correto posicionamento. Todos os eletrodos do cateter (6 mm de comprimento do eixo) precisavam estar dentro das câmaras do ventrículo direito e não em contato com as paredes do ventrículo. O posicionamento ideal do cateter, conforme esquematicamente representado na Figura 6A , gerou alças PV ótimas (triangulares, regulares). O posicionamento inadequado representado esquematicamente na Figura 6B (isto é, contato com a parede ventricular) resultará em alças PV defeituosas (isto é, alças colapsadas e irregulares).

O cateter foi introduzido na carótida, avançado para a aorta e, em seguida, avançado retrógrado através da valva aórtica para o ventrículo esquerdo. A pressão do ventrículo esquerdo foi estabilizada e o posicionamento direito verificado. Todos os eletrodos do cateter (6 mm de comprimento do eixo) devem estar dentro das câmaras do ventrículo esquerdo e não em contato com as paredes do ventrículo. O posicionamento ideal do cateter, conforme esquematicamente representado na Figura 6C , gerou alças PV ótimas (isto é, retangulares, regulares). O posicionamento inadequado representado esquematicamente na Figura 6D (i.e., contato com a parede ventricular) resultou em alças PV defeituosas (isto é, alças colapsadas, não retangulares e irregulares).

A hemodinâmica representativa gerada pelas alças PV esquerda e direita mostrou frequência cardíaca de 410 bpm, débito cardíaco de 9.107 μL/min e volume sistólico de 24,5 μL. Parâmetros específicos do ventrículo direito mostraram pressão sistólica do ventrículo direito de 21,9 mm Hg, pressão diastólica final do ventrículo direito de 1,049 mm Hg, fração de ejeção de 56,1%, dp/dt max de 1.469 mm Hg/s, dp/dt máx de -1.504 mm Hg/s, volume diastólico final de 38,4 μL, trabalho sistólico de 0,068 mJ, área pressão-volume de 0,089 mJ, pressão arterial pulmonar (Ea) de 0,83 mm Hg/μL e fator Tau de 12,8 ms. Parâmetros específicos do ventrículo esquerdo mostraram pressão sistólica do ventrículo esquerdo de 77,1 mm Hg, pressão diastólica final do ventrículo esquerdo de 2,33 mm Hg, fração de ejeção de 59,1%, dp/dt max de 4.695 mm Hg/s, dp/dt max de -3.553 mm Hg/s, volume diastólico final de 36,9 μL, trabalho sistólico de 0,14 mJ, área pressão-volume de 0,22 mJ, pressão arterial (Ea) de 5,37 mm Hg/μL e fator Tau de 15,1 ms (Tabela 1).

Parâmetros hemodinâmicos
RH (BPM)	410,6 ± 23,3
CO (μL/min)	9107 ± 1016
VS (μL)	24,5 ± 2,3
Função RV
PSVD (mmHg)	21,9 ± 2,15
PDFVE (mmHg)	1.042 ± 0.12
FE (%)	56.1 ± 4.4
dP/dt máx (mmHg/s)	1469 ± 170
dP/dt máx (- mmHg/s)	1504 ± 215
VDF (μL)	38,4 ± 3,7
SW (mJoules)	0,068 ± 0,008
PVA (mJoules)	0,084 ± 0,009
Ea (mmHg/μL)	0,83 ± 0,09
Fator Tau (ms)	12,8 ± 0,8
Função VE
PSVE (mmHg)	77,1 ± 2,4
PDFVE (mmHg)	2,33 ± 0,17
FE (%)	59.1 ± 3.6
dP/dt máx (mmHg/s)	4695 ± 355
dP/dt máx (- mmHg/s)	3553 ± 373
VDF (μL)	36,9 ± 4,8
SW (mJoules)	0,14 ± 0,013
PVA (mJoules)	0,22 ± 0,03
Ea (mmHg/μL)	5,37 ± 0,9
Fator Tau (ms)	15.07 ± 1.7
DC, débito cardíaco; Ea, elastância arterial; VDF, volume diastólico final; FC, frequência cardíaca; PDFVE, volume diastólico final do ventrículo esquerdo; PSVE, pressão sistólica do ventrículo esquerdo; PVA, área de volume de pressão; PDFVD, pressão diastólica final do ventrículo direito; PSVD, pressão sistólica do ventrículo direito; VS, volume sistólico; TS, trabalho de AVC; Fator Tau, Tau Mirsky. N= 6 camundongos. Os valores são expressos ± EPM

Tabela 1: Tabela de parâmetros hemodinâmicos. Parâmetro hemodinâmico do ventrículo esquerdo e direito medido em seis camundongos.

Figura 1: Preparo e montagem experimental. (A) Cateter em seringa de 10 mL de soro fisiológico/heparina, (B), (C) agulha de 30 G dobrada a aproximadamente 90°, (D) cânula de traqueostomia, diâmetro de 1,45 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Anestesia, controle da temperatura corporal . (A) Camundongo com três patas adesivadas, conectado ao respirador através de um cone nasal, com sondas retais e retais inseridas. Observe que a almofada de aquecimento está abaixo da manta cirúrgica. (B) Controle do monitor de temperatura mostrando a temperatura corporal (retal) e do coxim (feedback) e os parâmetros ventilatórios: frequência respiratória (FR ajustada), volume corrente médio (Meas TV), pressão de pico (PeakPress) e ventilação minuto (MinVol). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Procedimento de intubação. (A) A pele foi arrancada e cortada. A glândula submandibular foi suavemente afastada. O esternocleidomastoideo e o músculo esterno-hioideo foram afastados e, em seguida, a pinça foi passada por baixo da traqueia, com dissecção suave e romba. (B) Seda cirúrgica (4,0) foi passada por baixo da traqueia e um pequeno corte foi feito anteriormente entre dois anéis cartilaginosos da traqueia. A traqueostomia foi inserida e amarrada. (C) O tubo de traqueostomia foi conectado ao ventilador e a sutura foi amarrada ao redor da tubulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Cateterismo de ventrículo direito. (A), (B), (C) A veia jugular direita foi isolada e, em seguida, uma sutura cirúrgica foi passada por baixo e amarrada na face cranial da veia. Suave tração foi aplicada sobre essa sutura em direção à cabeça usando uma pinça hemostática. Duas suturas adicionais foram passadas distalmente, abaixo da veia jugular. A sutura mais distal foi trilhada suavemente no sentido caudal com pinça hemostática. Um nó solto e potencial foi feito na sutura do meio. (D) O cateter foi inserido na veia jugular, a sutura média foi amarrada ao cateter. As imagens em (C) e (D) são ampliadas através de um estereomicroscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Cateterismo do ventrículo esquerdo. (A), (B) A carótida direita foi isolada, em seguida, uma sutura cirúrgica foi passada por baixo da veia jugular e amarrada na face cranial da veia. Suave tração foi aplicada sobre essa sutura em direção à cabeça usando uma pinça hemostática. Duas suturas adicionais foram passadas abaixo da artéria carótida. A sutura mais distal foi suavemente trilhada no sentido caudal com pinça hemostática. Um nó solto e potencial na sutura média foi feito. (C) A ponta do cateter foi inserida na artéria carótida e, em seguida, a sutura do meio foi amarrada ao cateter para fixá-lo. (D) O cateter avançou suavemente retrógrado pela carótida em direção à aorta. As imagens em (B), (C), (D) são ampliadas através de um estereomicroscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Representação esquemática do posicionamento do cateter e das alças PV resultantes. (A) Posicionamento ideal do cateter no ventrículo direito. A ponta do cateter fica no meio do ventrículo, isolada das paredes ventriculares. Alças PV representativas resultantes de um posicionamento ideal do cateter no ventrículo direito (isto é, estável, triangular). (B) Posicionamento inadequado do cateter no ventrículo direito. A ponta do cateter está em contato com as paredes ventriculares. Ruído representativo das alças PV resultante de um posicionamento subótimo do cateter no ventrículo direito (isto é, colapsado, irregular). (C) Ótimo posicionamento do cateter no ventrículo esquerdo. A ponta do cateter fica no meio do ventrículo, isolada das paredes ventriculares. Alças PV representativas resultantes do posicionamento ideal do cateter no ventrículo esquerdo (isto é, estável, retangular). (D) Posicionamento inadequado do cateter no ventrículo esquerdo. A ponta do cateter está em contato com as paredes ventriculares. Alças PV representativas resultantes de um posicionamento subótimo do cateter no ventrículo esquerdo (isto é, colapsado, irregular). Um filtro de ruído FIR de 50 Hz foi aplicado para gerar as alças fotovoltaicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A avaliação da função cardíaca é uma etapa crítica para a pesquisa cardiovascular e pulmonar-vascular pré-clínica. Neste trabalho, propusemos um protocolo para avaliação biventricular do tórax fechado da função cardíaca em camundongos. Por meio dessa abordagem, pode-se gerar as alças PV do ventrículo direito e do ventrículo esquerdo no mesmo mouse. Essa abordagem proporciona uma avaliação robusta e completa da função cardíaca, permitindo mensurar a função sistólica e diastólica, bem como o volume sistólico e o débito cardíaco. Ao contrário da abordagem torácica aberta classicamente utilizada para cateterismo com roedores, esta técnica de tórax fechado resulta em fisiologia mais estável e dados fisiologicamente mais relevantes. Embora tecnicamente mais desafiadora e dependente das habilidades do operador para posicionar com sucesso o cateter nos ventrículos direito e esquerdo, a abordagem torácica fechada limita o trauma e a hemorragia associados à cirurgia torácica aberta e reduz as drásticas mudanças de pressão associadas à exposição dos pulmões à pressão atmosférica. A abordagem torácica fechada também emula melhor o procedimento de cateterismo cardíaco realizado em pacientes, o que aumenta a relevância do uso dessa técnica em pesquisas pré-clínicas.

O procedimento cirúrgico é a etapa crítica do protocolo. Mesmo quando se utiliza microscópio cirúrgico para inserção de cateter na veia jugular ou artéria carótida, o que é recomendado, esse procedimento requer prática e habilidade técnica. A dissecção cuidadosa dos vasos livres da fáscia circundante por meio de dissecção suave e romba aumentará o sucesso da canulação e minimizará o risco de hemorragia. Para minimizar a perda sanguínea, é fundamental canular a carótida em etapas sequenciais: 1) introduzir a ponta do cateter na artéria carótida; 2) amarrar suavemente a sutura ao redor da porção da artéria que contém o cateter; 3) liberar a sutura segura, permitindo a movimentação do cateter e mantendo suave tração ascendente para minimizar o sangramento; e 4) avançar o cateter para a aorta. O posicionamento do cateter no ventrículo, determinado pela monitorização da forma de onda em tempo real, é a parte mais desafiadora desse protocolo. Todos os eletrodos do cateter devem estar dentro da cavidade ventricular e nenhum deve estar tocando a parede. Qualquer posicionamento inadequado do cateter resultará em alças fotovoltaicas irregulares e afetará adversamente ou impedirá a aquisição de dados. O reconhecimento da forma de onda pressão-volume característica resultante da presença de todos os eletrodos dentro do ventrículo permite ter confiança na posição adequada do cateter. É fundamental obter uma forma de onda de pressão ventricular estável e alças de pressão-magnitude estáveis antes de mudar para o modo PV e aquisição de volume. O conhecimento adequado da fisiologia e anatomia cardíaca é essencial para o sucesso desse procedimento. A leitura on-line dos traços das VVPP, a partir do átrio, da área da valva tricúspide e do ventrículo direito, mostrará o avanço do cateter e ajudará a obter o posicionamento adequado. É fundamental conhecer a frequência cardíaca normal (400–600 bpm), as formas de onda e as pressões esperadas (por exemplo, pressão sistólica do ventrículo direito, 18–25 mm Hg, pressão diastólica <5 mm Hg; pressão sistólica do ventrículo esquerdo 60–120 mm Hg⁴⁰, pressão diastólica <8 mmHg) em camundongos para permitir que o operador avalie a veracidade dos dados observados.

A qualidade e a reprodutibilidade dos dados dependerão da velocidade do procedimento e da perda sanguínea ou hemorragia. O procedimento desde a anestesia até a conclusão da aquisição de dados leva em média ~30–40 min/mouse. O cateterismo cardíaco direito desde a inserção do cateter até a aquisição dos dados leva de 5 a 10 minutos, o cateterismo cardíaco esquerdo desde a inserção do cateter até a aquisição dos dados leva mais 10 a 15 minutos. Dados de qualidade de publicação são obtidos em ~75% dos casos. A sequência de passos do cateterismo cardíaco deve ser mantida constante entre os animais. Nesse procedimento, os camundongos são intubados primeiro, seguido pelo cateterismo do ventrículo direito e, finalmente, pelo cateterismo do ventrículo esquerdo. A decisão de proceder nessa ordem baseia-se na maior dificuldade e risco de sangramento do cateterismo cardíaco esquerdo em relação ao cateterismo cardíaco direito. Um artefato inespecífico de registro de ruído de 50 Hz pode ser observado. Esse ruído poderia ser diminuído com o uso de um filtro FIR com um ponto de corte alto em 50 Hz e um corte baixo de 0 no software. Para o canal de volume, crie um novo filtro de canal/filtro/FIR. Um filtro de entalhe de 50 Hz também pode ser aplicado durante a aquisição de dados para eliminar o ruído da rede e remover qualquer interferência de radiofrequência.

Quanto mais rápido for feito o cateterismo, melhor será a qualidade dos dados. Com base na experiência anterior, recomenda-se adquirir os dados em até 15 min. O aumento do tempo de cateterismo aumenta o estresse fisiológico sobre o animal e aumenta o risco de arritmia devido à presença do cateter na cavidade. Essas forças podem reduzir o volume sistólico e prejudicar a reprodutibilidade e a interpretabilidade das formas de onda. Além disso, a ponta do cateter é afiada e pode danificar ou puncionar o ventrículo. Isso é particularmente importante para o ventrículo direito, que é ~ 1/3^da espessura do ventrículo esquerdo.

A traqueostomia invasiva e a ventilação mecânica com pressão positiva resultam em respiração estável e controlada dos camundongos e diminuem a variabilidade da aquisição das alças fotovoltaicais. No entanto, a pressão positiva expiratória final (PEEP) é um contraste marcante com a ventilação normal, que é um fenômeno de pressão negativa. Juntas, a ventilação com pressão positiva e a PEEP diminuem o débito cardíaco e reduzem a pressão cardíaca direita. Assim, embora necessária para a aquisição de dados estáveis, a ventilação mecânica, bem como os efeitos cardiodepressivos da anestesia, afetarão as alças das VVPP e devem ser considerados como uma limitação. A interrupção transitória da ventilação mecânica durante o breve registro das alças fotovoltaicas é usada para eliminar essa fonte potencial de artefatos. Note-se que a eficiência da ventilação pode ser confirmada pelo monitoramento capngráfico do dióxido de carbono.

A habilidade técnica requerida para a abordagem de tórax fechado pode ser uma limitação dessa técnica. Da mesma forma, é um desafio obter um posicionamento adequado e estável do cateter no ventrículo. As chances de sucesso aumentam com a experiência do operador e com o tamanho e peso dos ratos. O cateterismo de camundongos abaixo de 20 g é extremamente desafiador. A geometria única da câmara do ventrículo direito pode afetar a medida de volume e deve ser considerada. O anestésico utilizado, a frequência cardíaca, a temperatura e o esforço do animal podem afetar os parâmetros hemodinâmicos e devem ser cuidadosamente relatados e monitorados.

Em conclusão, neste protocolo ambos os cateterismos ventrículos direito e esquerdo são realizados no mesmo camundongo. Dependendo dos objetivos específicos do cientista, o cateterismo ventricular esquerdo ou direito pode ser realizado de forma independente, utilizando a porção relevante do procedimento biventricular. Entretanto, a abordagem apresentada é ótima para avaliação completa da função cardíaca.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de Pressão-Volume ADVantage (ADV500)	Transônico	FY097B
Endozime AW triplo mais	Ruhof	34521
Fibra óptica dupla Gooseneck	Volpi Intralux	# 6000-1
Fórceps	FST	11052-10
Fórceps	FST	11251-20
Esponjas de gaze	Dermacea	441400
Braçadeira hemostática	F.S.T	13003-10
Braçadeira hemostática	F.S.T	13018-14
Heparina sódica	Sandoz	023-3086	100 U/L
Cateter de admissão de alta fidelidade	Cisence; Isofluorano transônico	FTH-1212B-3518
	Baxter	CA2L9108
labScribe v4 software	iworx	LS-30PVL
Agulha (calibre 30)	BD	305106
injeção de cloreto de sódio	Baxter	JB1309M	0,9% (peso / volume)
Microscópio estéreo	Cole-Parmer	OF-48920-10
Sutura cirúrgica	SERAFLEX	ID158000	seda trançada preta, 4.0
Fita cirúrgica	3M, Transpore	SN770
Sistemas de anestesia de um único animal de mesa	Aparelho de Harvard	72-6468
Cânula de traqueotomia Aparelho de Harvard de 1,45 mm de diâmetro		72-1410
Ventilador, almofada de aquecimento de infravermelho distante para camundongos e ratos PhysioSuite	Kent corporação científica	# PS-02