Os astrócitos ladrilho o córtex cerebral uniformemente, tornando a análise de sua morfologia complexa desafiadora a nível celular. O protocolo aqui fornecido usa rotulagem multicolorida baseada na eletroporação uterónica para destacar os astrócitos corticais e analisar seu volume e morfologia com um pipeline de análise de imagem fácil de usar.
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Artigo de método
Em Utero Eletroporation de Marcadores de Cor Multiaddressable (MAGIC) para Individualizar Astrócitos de Ratos Cortical
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os astrócitos protoplasmáticos (ARP) localizados no córtex cerebral do rato são fortemente justtaposed, formando uma matriz tridimensional aparentemente contínua em estágios adultos. Até agora, nenhuma estratégia de imunossuagem pode desopara-los e segmentar sua morfologia em animais maduros e ao longo da corticogênese. A PrA cortical é originária de progenitores localizados no pálio dorsal e pode ser facilmente direcionada usando na eletroporação uterótica de vetores integrativos. Um protocolo é apresentado aqui para rotular essas células com a estratégia de marcadores de cor multiadaturar genomas (MAGIC), que conta com transposição piggyBac/Tol2 e recombinaçãocre/lox para expressar estochasticamente proteínas fluorescentes distintas (azul, ciano, amarelo e vermelho) dirigidas a compartimentos subcelulares específicos. Esta estratégia de mapeamento de destino multicolorido permite marcar em locais progenitores cortical próximos com combinações de marcadores de cor antes do início da gliogênese e rastrear seus descendentes, incluindo astrócitos, de estágios embrionários a adultos no nível celular individual. A rotulagem semi-esparsa obtida pelo ajuste da concentração de vetores eletroporados e contrastes de cores fornecidos pelos Marcadores de Cores Multiadutáveis (Marcadores MÁGICOs ou MM) permitem individualizar os astrócitos e destacar seu território e morfologia complexa, apesar de seu denso arranjo anatômico. Apresentado aqui está um fluxo de trabalho experimental abrangente, incluindo os detalhes do procedimento de eletroporação, aquisição de pilhas de imagens multicanais por microscopia confocal e segmentação tridimensional assistida por computador que permitirá ao experimentador avaliar o volume e a morfologia individuais da RPA. Em resumo, a eletroporação de Marcadores MÁGICOs fornece um método conveniente para rotular individualmente numerosos astrócitos e ter acesso às suas características anatômicas em diferentes estágios de desenvolvimento. Esta técnica será útil para analisar propriedades morfológicas de astrócito cortical em vários modelos de camundongos sem recorrer a cruzes complexas com linhas de repórter transgênicas.
Introdução
Os astrócitos desempenham inúmeras funções vitais no desenvolvimento cerebral e fisiologia1. Além de seu papel na barreira hemencefálica onde regulam a absorção de nutrientes e o fluxo sanguíneo, eles contribuem ativamente para a formação e função da sinapse, produzindo neuromoduladores que podem alterar a atividade neuronal e o comportamento2. Além disso, a disfunção astrócito contribui para uma variedade de distúrbios neurológicos3. Astrócitos localizados no córtex cerebral exibem uma morfologia elaborada permitindo um contato extensivo com processos neuronais. Esses contatos, essenciais para a ....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais descritos aqui foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais. Os protocolos animais foram aprovados pelo conselho ético de experimentação animal de Charles Darwin (CEEACD/N°5).
1. Preparação de plasmídeos livres de endotoxinas para marcadores MÁGICOS na eletroporação uteral
- Transformação bacteriana
- No gelo, descongele células competentes dh5 alfa armazenadas a -70 °C.
- Aqueça as placas de ágar contendo o antibiótico apropriado (100 μg/mL ampicillin ou 50 μg/mL kanamycin) a 37 °C.
- Adicione 1 μL de 5-50 ng de MAGIC Markers plasmid DNA em 10 μL de células compe....
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Resultados
Eletroporação de marcadores MÁGICOS em progenitores cortical embrionários permite a rotulagem de astrócitos desde estágios iniciais até os estágios finais do desenvolvimento do córtex cerebral(Figura 1). Estes astrócitos foram encontrados em todas as camadas corticais em vários estágios pós-natais (P4, P7, P21) enquanto se dispersavam amplamente em todo o córtex cerebral. Foram avaliadas com imagens confocal adquiridas com um objetivo 20x 0.8 NA (ou superior NA) e montadas como reconstruções.......
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Discussão
No ute eletroporation (IUE) de marcadores MÁGICOS em progenitores corticais(Figura 1) permitiram a rotulagem de astrócitos em todo o córtex cerebral pós-natal em diferentes estágios pós-natais (P4-P7-P21, Figura 2). Curiosamente, o estágio da IUE não é crítico, pois a eletroporação realizada de E13,5 a E15,5 produz padrões de rotulagem semelhantes em relação aos astrócitos cortical14. No entanto, a localização de neurônios piramidais rotu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a S. Fouquet e as instalações de imagem e núcleo animal do Institut de la Vision e Institut des Neurosciences de Montpellier (RM e RAM) pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Estudos de Région Ile-de-France e Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer to S.C, e da Université Paris-Saclay (Iniciativas Doutores Interdisciplinares) a L.A., por meio de financiamento do European Research Council (ERC-SG 336331, PI J. Valette) para E.H., pela Agence Nationale de la Recherche sob contratos ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , por Fondation pour la Recherche M....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1.1 Transformação de bactérias | |||
| Ampicilina | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 células alfa competentes | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC médio | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Placa de Petri estéril- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Banho-maria | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Cultura de plasmídeotubo de cultura de | |||
| 14 ml | Dutscher | 187262 | |
| Erlenmeyer de vidro- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Preparação de DNA de plasmídeo | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparação das soluções | |||
| 26 G x 1/2 agulha | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 agulha | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma | Aldrich F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Seringa de polipropileno descartável, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparação do material cirúrgico | |||
| Adson Fórceps - DeBakey Padrão- 12,5 cm | FST | 11617-12 | |
| Ponta arqueada Fórceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Esterilizador de esferas de vidro Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Micropipeta de vidro 1 mm diâmetro | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Fórceps - Titânio 1 mm Pontas Ligeira Curvatura - 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Fórceps - Titânio 1 mm Pontas Retas - 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Tesoura de Íris - Delicada Reta - 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Fita de laboratório | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjetor | INJECT+MATIC | Sem número de | |
| Olsen-Hegar Porta-agulhas - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Fibra óptica | VWR | 631-1806 | |
| Papel branco revestido de plástico | Distrimed | 700103 | |
| Gel de eléctrodo Signagel | Free-Med | 15-60 | |
| Placa de Petri estéril - 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Esterilizador, esferas secas de vidro, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparação da rata fêmea grávida | |||
| Compressa Alcomed | 1731000 | ||
| Buprecare | Axience | 0,3 mg/ml | |
| Compressa | tRAFFIN | 70189 | |
| Cetamina | Merial | Imalgene 1000 | |
| Gel | ocular tvm lab | Gel de cristal | |
| RjOrl: Camundongos SWISS | Janvier Labs | ||
| Vetadine, solução a 10% | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Almofada de aquecimento | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Eletroporação | |||
| Sutura absorvível Tamanho 4-0 45 cm Sutura 1-Agulha 19 mm Comprimento 3/8 Círculo Reverso | Novosyn | C0068220 | |
| Eletroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Pipetas de transferência estéreis (embaladas individualmente) | Dutscher | 043202S | |
| Pinças com eléctrodos de disco de platina de 3 mm | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Colheita e seccionamento de tecidosplaca de | |||
| 24 poços | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Lamínula | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), sem cálcio, sem magnésio | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Esmalte | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Imagem confocal multicanal | |||
| 20X óleo NA 0.85 | Microscópio | ||
| Carl Zeiss | LSM880 | ||
| Olympus | FV1000 | ||
| Plano Apocromático 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Segmentação de volume territorial de astrócitos | |||
| IMARIS 8.3 e versões posteriores | Bitplane | ||
| 7. Rastreamento de arborização de astrócitos< / strong > | |||
| suíte de software de análise assistida por visualização 3D (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus / Allen Institute for Brain Science |
Referências
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit acti....
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Reimpressões e permissões
