Uma abordagem benchtop para a abertura da barreira cerebral de sangue específica do local usando ultrassom focado em um modelo de rato

Apesar das muitas descobertas na neurociência básica, o número de tratamentos emergentes para distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos permanece relativamente limitado^1,2. Uma compreensão mais profunda dos genes, moléculas e circuitos celulares envolvidos em distúrbios neurológicos tem sugerido tratamentos promissores irrealizáveis em humanos com técnicas atuais³. Tratamentos eficazes são muitas vezes limitados pela necessidade de ser penetrável cerebral e específico do local^4,5,6,7,8. No entanto, os métodos existentes de entrega de medicamentos localizados para regiões cerebrais específicas (por exemplo, entrega via injeção ou cânula) são invasivos e requerem uma abertura a ser feita no crânio⁹. A invasividade desta cirurgia impede o uso rotineiro do parto localizado no cérebro humano. Além disso, os danos teciduais e as respostas inflamatórias resultantes são confundimentos onipresentes para estudos básicos e pré-clínicos que dependem da injeção intracerebral¹⁰. A capacidade de fornecer agentes não invasivamente através da barreira cerebral sanguínea (BBB) e direcioná-los para regiões cerebrais específicas pode ter um tremendo impacto nos tratamentos para distúrbios neurológicos, ao mesmo tempo em que fornece uma poderosa ferramenta investigativa para pesquisas pré-clínicas.

Um método de transporte direcionado através do BBB com dano mínimo de tecido é o ultrassom focado transcranário (ME) juntamente com microbolhas para abrir o BBB^{11,12,13,14,15,16}. A abertura do FUS BBB ganhou atenção recente para o tratamento de distúrbios neurodegenerativas, derrame e glioma, localizando terapêuticas para atingir regiões cerebrais como fatores neurotróficos^17,18,19, terapias genéticas^20,21,22, anticorpos²³, neurotransmissores²⁴, e nanopartículas^{25,26,27,28,29}. Com sua ampla gama de aplicações e sua natureza não invasiva^30,31, a abertura do FUS BBB é uma alternativa ideal para injeções intracranianas estereotaxas rotineiras. Além disso, devido ao seu uso atual em humanos^30,32, investigações pré-clínicas usando essa técnica podem ser consideradas altamente translacionais. No entanto, a abertura do FUS BBB ainda não foi uma técnica amplamente estabelecida em ciência básica e pesquisa pré-científica devido à falta de acessibilidade. Por isso, fornecemos um protocolo detalhado para uma abordagem de bancada para a abertura do FUS BBB como ponto de partida para laboratórios interessados em estabelecer essa técnica.

Estes estudos foram conduzidos com um transdutor de ultrassom específico de ar apoiado por ar de alta potência ou um transdutor de imersão ultrassônica de baixa potência. Os transdutores foram conduzidos por um amplificador de energia RF projetado para cargas reativas e um gerador de função de bancada padrão. Os detalhes para esses itens podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) da UAB.

1. Configuração focada do equipamento de condução de ultrassom

1. Utilize 50 cabos BNC coaxiais Ohm para conectar (1) a entrada do transdutor de ultrassom à saída do amplificador RF e (2) a entrada do amplificador RF à saída do gerador de função.
2. Ajuste o modo gerador de função para uma rajada sinusoide uma vez por segundo com um ciclo de 1% de serviço.
   1. Para o transdutor de imersão de baixa potência de 1 MHz úmido com uma distância focal de 0,8 polegadas usada com um amplificador RF de 50 dB, defina as configurações iniciais para: onda seno de 1 MHz, pico de 1 V ao pico, ciclo de 10k, intervalo de 1 s (ou período).
   2. Para o ar apoiado, transdutor de alta potência de 1,1 MHz, defina as configurações iniciais para: onda seno de 1,1 MHz, pico de 50 mV ao pico, ciclos de 11k, intervalo de 1 s.
      NOTA: Não opere os transdutores a menos que estejam submersos. Não coloque uma mão ou outra parte do corpo no foco do ultrassom ou toque na face do transdutor enquanto estiver em funcionamento.

2. Configuração focada no bancada de ultrassom

1. Imprima em 3D o quadro estereotício e o porta-quadros estereotáticos.
2. Conecte o transdutor ao posicionador XYZ usando um grampo segurando um tubo de PVC(Figura 1a). Aperte o grampo no deslizamento do eixo X e bloqueie com uma porca de asa.
   1. Se usar o transdutor de ultrassom de alta potência, conecte-o ao tubo de PVC usando um par de ímãs combinados. Certifique-se de que um ímã tem um orifício e o outro tem uma saliência correspondente. Tampe a parte inferior do tubo de PVC e conecte um dos ímãs a ele usando epóxi (ver Figura 1b).
   2. Conecte o segundo ímã ao centro superior do transdutor de ultrassom de alta potência usando epóxi. Certifique-se de que está no centro do transdutor (Figura 1c).
3. Se usar o transdutor de ultrassom de alta potência, faça um ponteiro para anular o posicionador XYZ. A ponta deste ponteiro indica a localização no espaço do centro do foco do transdutor quando o transdutor de ultrassom estiver ligado ao posicionador XYZ. Faça um ponteiro de uma agulha de 18 G cortada para ser o comprimento da distância focal do transdutor mais a espessura do transdutor(Figura 1d).
   1. Aplique epóxi em um terceiro ímã (este ímã também emparelha com o ímã da tampa de PVC) e conecte-o à parte superior do ponteiro. Em seguida, o ponteiro poderá ser anexado ao ímã no tubo de PVC para nulidade XYZ(Figura 1d).
4. Se usar o transdutor de imersão de baixa potência, imprima em 3D o arquivo para o ponteiro e o clipe de montagem.
   1. Conecte o transdutor de imersão de baixa potência ao tubo de PVC, cortando o clipe de montagem no tubo de PVC e inserindo o transdutor no anel(Figura 1f).
5. Faça um banho de água colando peças cortadas da folha de acrílico que poderão descansar em cima da cabeça do animal acima do quadro estereotático(Figura 1e).
   1. Corte uma abertura no fundo do banho que é do tamanho da cabeça do animal. Cubra o buraco no banho de água com uma fita de poliimida.
      NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a água não vaze ao redor da fita de poliimida, pois pode molhar a pele do rato e causar hipotermia.
6. Faça uma ressonância magnética fiducial preenchendo uma esfera de plástico ou vidro de 4 mm de diâmetro com um fluido visível de ressonância magnética (por exemplo, óleo de vitamina E) e selá-lo. Coloque-o no suporte fiducial de ressonância magnética no lado direito do quadro estereotítico impresso em 3D(Figura 2a).
7. Fixar firmemente o suporte de quadro impresso em 3D ao posicionador XYZ em um bom local para posicionamento animal. Deslize a guia na extremidade rostral do suporte do quadro para o canal correspondente no trilho do eixo Y e fixando com parafusos definidos(Figura 1h, setas vermelhas).
8. Para dirigir o posicionador XYZ, instale o conversor USB para serial em um computador seguindo as instruções do fabricante e conecte o conversor. Instale o ambiente de tempo de execução e o software do controlador do motor no PC.
   1. Certifique-se de que a porta serial adequada seja selecionada no software selecionando o CONVERSOR USB para serial no controle de dropdown de seleção da porta no painel frontal do software do controlador. Conecte o USB ao conversor serial à caixa do controlador do motor do estepe usando um cabo crossover serial de 9 pinos (por exemplo, cabo de modem nulo RS232).
   2. Execute o software do controlador para testar que os motores do stepper podem ser acionados sob controle de software. Esta etapa pode exigir a assistência do suporte local de TI.

3. Procedimento de segmentação intracraniana

NOTA: Ratos machos Sprague Dawley pesando 250-350 g foram usados para esses experimentos. Os animais tinham livre acesso à água e à comida de rato, e eram mantidos em um ciclo claro: escuro de 12:12 h.

1. Coloque o animal sob anestesia (3% isoflurane com oxigênio) e verifique se há falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do dedo. Em seguida, insira o cateter conforme descrito abaixo.
   1. Aqueça a cauda com uma lâmpada para fazer é mais fácil de acertar a veia. Tenha cuidado para não superaquecer o animal ou queimar a cauda.
   2. Uma vez que o animal esteja dormindo (não responde a uma pitada de dedo do dedo do dedo), insira o cateter da veia da cauda de 24 G que será usado para entregar microbolhas, corante azul Evans (EBD), contraste de ressonância magnética gadobutrol se usar ressonância magnética, e o agente experimental de interesse. Uma vez que a veia é atingida, o sangue encherá a bainha, lentamente removerá a agulha interna enquanto empurra a bainha mais para dentro da veia.
      NOTA: Veja um guia como Stuart e Schroeder³³ se fizerem as injeções da veia da cauda do rato pela primeira vez.
   3. Se não houver fluxo sanguíneo, mova lentamente a bainha do cateter para fora da veia para testar que a agulha pode ter cutucado através da veia. Se o sangue fluir quando o cateter é puxado para trás ligeiramente, então primeiro poke atravessou a veia e a colocação do cateter precisará ser reiniciada em outro local na cauda que é rostral para o local anterior.
2. Encha o plugue do cateter com soro fisiológico e enrosque o cateter plugue na extremidade da porta do cateter assim que a porta estiver cheia de sangue. Enrole cuidadosamente a fita de laboratório ao redor do cateter e da cauda para mantê-lo no lugar. Comece com uma pequena peça na parte superior e trabalhe na direção caudal, deixando a extremidade do plugue do cateter exposta.
3. Conecte a linha de anestesia no conector da anestesia no quadro estereotaxico(Figura 2a)e fixe a cabeça dos animais na moldura, colocando a boca na barra de mordida e guiando as barras de ouvido em ambos os canais auditivos, em seguida, aperte os parafusos do conjunto. Certifique-se de que a cabeça dos animais está segura e nivelada.
4. Mova o animal para o leito de ressonância magnética e conecte a linha de anestesia ao cone do nariz. Neste protocolo foi utilizada uma ressonância magnética animal de 9,4 T.
5. Coletar imagens coronárias e axiais de peso T2 que capturam todo o cérebro, bem como o fiduciário de ressonância magnética(Figura 2b) para medições coordenadas. Forneça ao físico ou técnico de ressonância magnética local as seguintes informações para que eles possam construir o protocolo de ressonância magnética.
   1. Para imagens coronais (Figura 2b superior), utilize os seguintes parâmetros: número de imagens: 27, largura: 62,2 mm, altura: 62,2 mm, profundidade: 37,97 mm, tamanho Voxel: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm³.
   2. Para imagens axiais(Figura 2b inferior), utilize os seguintes parâmetros: número de imagens: 13, Largura: 61,47 mm, Altura: 53,81 mm, Profundidade: 16,7 mm, tamanho Voxel: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm³.
      NOTA: Não é necessário ter esses parâmetros exatos, desde que o coronal em resolução do plano esteja perto de 0,25 mm e as imagens cubram todo o cérebro e fiduciário.
6. Colete medições coordenadas das imagens acima registrando a distância do fiducial de ressonância magnética até a região cerebral que será alvo de FUS.
   1. No scanner, nas imagens coronais coletadas na etapa 3.5, encontram-se a imagem em que o fiducial é o maior, indicando o centro do fiduciário. Regisso o ponto de distância do topo do fiduciário até a região do cérebro de interesse em mm (o software de ressonância magnética terá uma ferramenta de medição de escala ou ponto, consulte a tecnologia ou físico local de ressonância magnética sobre como fazer isso) tanto na direção medial/lateral quanto na direção ventral dorsal(Figura 2b, topo).
   2. No scanner, nas imagens axiais coletadas na etapa 3.5, encontre a imagem que mostra a parte superior do fiduciário e meça a distância do centro do fiducial até a região cerebral alvo tanto na direção dorsal/ventral quanto na direção medial/lateral(Figura 2b, inferior).
   3. Compare as duas medidas medial/lateral e se forem diferentes use a média. Estas medidas coordenadas serão usadas mais tarde na etapa 4.3 para guiar o ponto focal do FUS para a região cerebral alvo com o posicionador XYZ.
7. Colete imagens de ressonância magnética. Compare essas imagens com as imagens coletadas após a abertura do FUS BBB (Figura 4). Imagens ponderadas com T1 serão usadas posteriormente para visualizar a abertura do BBB, imagens ponderadas com T2 serão posteriormente usadas para garantir que nenhum dano tecidual tenha ocorrido após o tratamento de FUS³⁴.
   1. Para imagens axiais ponderadas em T1, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidade: 3,0 mm, tamanho do voxel: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm³, número de imagens: 13.
   2. Para imagens axiais ponderadas por T2, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 51,2 mm, profundidade: 2,6 mm, tamanho do voxel: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm³, número de imagens: 13.
   3. Para imagens coronais ponderadas t1, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 30 mm, profundidade: 27 mm, tamanho do voxel: 0,16 x 0,16 x 1 mm³, número de imagens: 27.
   4. Para imagens coronais ponderadas t2, utilize os seguintes parâmetros: largura: 30 mm, altura: 30 mm, profundidade: 27 mm, tamanho do voxel: 0,12 x 0,12 x 1 mm³, número de imagens: 27.
      NOTA: Como na etapa 3.5, esses parâmetros de imagem não precisam ser exatamente os mesmos listados. Essas imagens têm um FOV menor e resolução maior do que as coletadas na etapa 3.5.
8. Mantendo o animal na estrutura estereotaxa, transporte rapidamente o animal do leito de ressonância magnética até a configuração do FUS do topo do banco. Certifique-se de que o animal permaneça dormindo para a transferência sob o efeito da anestesia.
9. Para tempos de transferência mais longos, use uma caixa para transferência que seja grande o suficiente para caber no animal e no quadro. Com o plugue de anestesia ainda ligado, coloque o animal e o quadro dentro da caixa e deixe o excesso de isoflurane encher a caixa por alguns minutos. Desligue a linha de anestesia e transfira rapidamente.

4. Procedimento de ultrassom focado

1. Ao chegar à configuração do banco fus, conecte imediatamente a linha de anestesia no cone do nariz e continue a correr 1,5-3% de isoflurano com oxigênio. Faça isso o mais rápido possível para evitar que o animal acorde.
2. Deslize o quadro para o suporte da armação e encaixe-o firmemente. Use cortadores para raspar a cabeça do animal. Escove o excesso de cabelo e aplique creme de removedor de cabelo no couro cabeludo. Deixe descansar por 3 minutos e limpe com água e gaze.
3. Se a ressonância magnética não estiver disponível para segmentação, use um quadro estereotático padrão (não impresso em 3D) para anular a posição do ponteiro para bregma tocando na ponta do ponteiro para bregma (uma incisão do couro cabeludo será necessária para isso) e anulando o software ou gravando as coordenadas. Mova a carruagem XYZ em 50 mm clicando no botão up 50 no software e trocando o ponteiro pelo transdutor. Com base em um atlas cerebral de rato como descrito anteriormente³⁵, mova-se para as coordenadas cerebrais desejadas usando os botões de pisação no software. Se usar este método em vez de ressonância magnética, pule para a seção 4.6.
4. Se utilizar orientação de ressonância magnética, conecte o ponteiro e mova o ponteiro para a localização do fiducial de ressonância magnética(Figura 1d,g). Posicione o ponteiro na parte superior e central do fiducial de ressonância magnética (é fornecido um pequeno orifício na parte superior do suporte fiducial para apontar). Clique no botão de posição nula que é o ponto a partir do qual todas as distâncias na imagem de ressonância magnética foram calculadas.
5. Remova o ponteiro e mova o posicionador para as coordenadas medial/lateral e as coordenadas rostral/caudal. Levante o posicionador pressionando o botão até 50 para permitir a colocação do banho de água e do gel de ultrassom. Se a parte superior da viagem do eixo Z for atingida, o local de anulação será invalidado. A coordenada dorsal/ventral será definida após a adição do transdutor.
6. Aplique gel de ultrassom no couro cabeludo do animal e coloque o banho de água sobre o animal com a janela de fita poliimida pressionada sobre o gel. Certifique-se de que não há bolhas de ar no gel de ultrassom.
7. Encha o banho de água com água desgaseada.
8. Se usar o transdutor de alta potência, baixe o posicionador para que o ímã fique logo acima da água. Conecte o transdutor ao posicionador baixando cuidadosamente o transdutor na água em um ângulo para evitar que bolhas de ar fiquem presas sob o rosto e conectem os ímãs.
9. Se usar o transdutor de imersão de baixa potência, baixe o posicionador na água logo acima do clipe do transdutor. Em seguida, corte o transdutor no lugar, baixando-o lentamente na água em um ângulo para evitar que bolhas de ar fiquem presas sob o rosto.
   NOTA: Um banho transparente é útil ao olhar sob a face do transdutor para bolhas.
10. Abaixe o posicionador para a coordenada dorsal/ventral.
11. Ligue o amplificador de energia RF.
12. Injete 1 mL/kg de corante azul Evans (EBD) colocando a ponta da agulha no plugue do cateter e injetando. Deixe circular por 5 minutos.
13. Ative os microbolhas sacudindo-os violentamente com o agitador de bolhas.
    1. Prepare 5x a dose de 30 μL/kg de microbolhas (bolha conc. 1,2 x 10¹⁰/mL) em 0,2 mL de soro fisiológico para explicar os 2 tratamentos de FUS e a tubulação no conjunto de infusão alado 18 G. Por exemplo, se o rato pesa 200 g, então encha a seringa contendo ponta de agulha de 18 G com 30 μL de microbolhas em 1 mL de soro fisiológico.
       NOTA: Certifique-se de usar pontas de agulha de 18 G para até pegar e injetar com o conjunto de infusão alado.
    2. Inverta a seringa várias vezes para obter uma distribuição uniforme de microbolhas. Em seguida, anexe e encha o conjunto de infusão alado. Posicione a seringa na bomba de infusão e ajuste a bomba de infusão para entregar 0,2 mL a uma taxa de 6 mL/h. Isso fornecerá uma infusão lenta dos microbolhas sobre a exposição de FUS de 2 minutos.
    3. Insira a agulha alada no plugue do cateter.
14. Primeiro, execute a bomba de infusão, espere 3 s e inicie o tratamento de FUS pressionando o botão de habilitação de saída no gerador de função (rotulado "nogerador de função na Tabela de Materiais). Repita essas duas vezes por região com 5 minutos entre elas para permitir que as microbolhas se limpem.
    1. Pressione o botão on novamente no gerador de função para parar o tratamento de FUS quando a bomba de infusão parar em 2 min.
    2. Espere 5 min para as microbolhas limparem. Em seguida, inicie a infusão e o segundo tratamento de FUS.
    3. Imediatamente após o segundo tratamento de FUS, injete contraste de gadobutrol (se estiver usando ressonância magnética) e o agente de interesse, por exemplo, partículas virais. O volume total entregue de todos os agentes não deve exceder 5 mL/kg.
       NOTA: O tempo de entrega (por exemplo, antes ou depois da abertura do FUS BBB) do agente de interesse pode diferir dependendo do agente utilizado.
15. Desligue o amplificador de energia RF e transporte imediatamente o animal de volta para a ressonância magnética.

5. Confirmação de ressonância magnética da abertura do BBB

1. Se a ressonância magnética não estiver disponível, pule para a seção 6 e use a expressão EBD para confirmação da abertura do BBB.
2. Coloque o animal de volta no leito de ressonância magnética exatamente no mesmo local que na etapa 3.7 e conecte a linha de anestesia.
3. Colete os postes de ressonância magnética com os mesmos parâmetros de imagem utilizados na etapa 3.7 para visualizar o aprimoramento da ressonância magnética gadobutrol na região de abertura do BBB (Figura 3b,e).

6. Perfusão e coleta de tecidos

1. Perfunda o animal com formalina fria de 4% até que o sangue se esclae completamente.
2. Remova o cérebro e coloque em 4% de formalina ou PFA a 4 °C durante a noite. Em seguida, coloque o cérebro em 30% de solução de sacarose até que o cérebro afunde (cerca de 2-3 dias). Finalmente, o flash congele em nitrogênio líquido ou em gelo seco e armazene a -80°C até que se cryosectioning.
3. Congele o cérebro em OUTUBRO e faça criosections.
4. Corrigir e cobrir seções de deslizamento para microscopia de fluorescência. A excitação do EBD atinge picos de excitação de 470 e 540 nm e picos de emissões a 680 nm. Tampar com meio de montagem DAPI para visualizar morfologia celular global.

Aqui, demonstramos que o ultrassom focado com microbolhas pode induzir abertura de BBB localizada utilizando os parâmetros especificados acima com o transdutor de imersão de baixa potência(Figura 3) e o transdutor FUS(Figura 4). Primeiro, em experimentos iniciais, o transdutor de imersão de baixa potência foi direcionado para um hemisfério cerebral anterior(Figura 3b) ou medial(Figura 3a). Os animais foram então sacrificados 2 horas depois com perfusão (Figura 3a) ou sem perfusão(Figura 3b) e 10 μm de seções cerebrais congeladas foram coletadas. A abertura do FUS BBB ficou evidente pela autofluorescência EBD (excitação: 470 e 540 nm, emissão: 680 nm) no hemisfério alvo (setas brancas Figura 3a a e 3b).

Achamos melhor perfumar os animais para visualização clara da abertura do BBB com autofluorescência EBD. No entanto, a abertura do BBB ainda pode ser visualizada sem limpar os vasos sanguíneos (Figura 3b). Captação celular e liberação de EBD após a abertura do BBB começa logo após a abertura do BBB e aumenta mais de 24 horas37. Para avaliação da abertura do BBB com autofluorescência EBD, é melhor sacrificar o animal entre 15 minutos e 3 horas de abertura do BBB. Embora, em última análise, o tempo de sacrifício dependerá do agente que foi entregue. Por exemplo, em um estudo AAV, 3 semanas após a abertura do BBB e entrega de AAV(Figura 5c) podem ser apropriadas.

Em experimentos posteriores, o transdutor fus foi direcionado tanto para o hipocampo (Figura 4a-c) ou para o córtex cingulado anterior (ACC) (Figura 4 d-f) e, além do EBD, o agente de contraste de ressonância magnética gadobutrol (0,1 mL/kg) foi iv injetado para verificar a abertura direcionada do BBB in vivo. Figura 4b,e mostrar contraste aprimorado de ressonância magnética onde o contraste de gadobutrol entrou no tecido 1 hora após a abertura do BBB e injeção de agente de contraste. Essa mudança de contraste é evidente quando comparada com os prescans de ressonância magnética tomados antes do procedimento de FUS(Figura 4a,d). Os animais foram então sacrificados por perfusão 1,5 horas após a abertura do BBB e 10 μm criosections foram coletados. A autofluorescência EBD é evidente em regiões alvo de FUS indicando ainda mais a localização da abertura do BBB (Figura 4c,f). Esta figura destaca como o contraste da ressonância magnética pode às vezes ser difícil de ver (como na diferença entre a Figura 4b e a Figura 4e); portanto, é útil confirmar a abertura do BBB com visualização de autofluorescência EBD como no micrografo de fluorescência na Figura 4f.

Para avaliar se essa técnica poderia ser usada para a entrega genética direcionada AAV9-hsyn-GFP e contraste gadobutrol foram injetados IV (titer: 1,32 x 1014 GC/mL, 0,05 mL/kg) imediatamente após a abertura do BBB no hipocampo. O animal foi então MR imaged 30 minutos após a abertura do BBB e sacrificado 3 semanas depois por perfusão. Foram coletadas 10 crioseções de μm para imagem fluorescente da expressão GFP. A abertura do BBB ficou evidente pelo contraste de gadobutrol no hipocampo alvo (Figura 5a,b). Além disso, a entrega de genes foi confirmada pela expressão GFP no hipocampo alvo evidente pela fluorescência verde (Figura 5c). Observe que neste momento o EBD foi eliminado e só é evidente nos ventrículos(Figura 5c).

Figura 1: Configuração do bancada de FUS. (a) Configuração de FUS, incluindo o posicionador XYZ, um tubo de PVC de 30 mm de diâmetro para fixação do transdutor, o quadro estereotaxic impresso em 3D e a bomba de infusão. (b) A extremidade do tubo de PVC é tampada, e um ímã é anexado a ele com epóxi. (c) Outro ímã correspondente é anexado ao centro superior do transdutor de alta potência com epóxi. (d) Além disso, outro ímã correspondente é anexado ao ponteiro para anular o posicionador na parte superior e central do fiducial de ressonância magnética. (e) O ponteiro é eventualmente substituído pelo transdutor de alta potência e um banho de água é acoplado à cabeça do animal com gel de ultrassom. fO transdutor de imersão de baixa potência pode ser anexado ao tubo de PVC com o clipe transdutor impresso em 3D. (g) Para o posicionamento, o transdutor é substituído pelo ponteiro impresso em 3D e o posicionador é nulo na parte superior e central do fiduciário de ressonância magnética. (h) O porta-quadros impresso em 3D estacionário permite que o animal seja devolvido à mesma posição após a ressonância magnética se forem necessários vários tratamentos de FUS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quadro estereotaxico com fiducial de ressonância magnética para coordenadas guiadas por ressonância magnética. (a) Os animais são posicionados pela primeira vez em um quadro estereutário impresso em 3D equipado com um fiducial de ressonância magnética. (b) O quadro é então colocado dentro do leito de ressonância magnética e a distância do círculo fiduciário (pontilhado) para a região cerebral alvo é medida utilizando-se tanto imagens coronais para as medidas dorsais/ventral (D/V) quanto imagens axiais para as medidas rostral/caudal (R/C), a medição medial/lateral (M/L) pode ser coletada de ambos os eixos. Os animais são mantidos na estrutura e transferidos para a estação FUS onde um ponteiro é usado para anular o posicionador XYZ na localização do fiduciário. O ponteiro é então substituído pelo transdutor e que pode então ser movido com base nas coordenadas coletadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O corante azul evans (EBD) confirma que fus BBB abre com e sem perfusão. (a) Micrografia de uma seção cerebral de 10 μm 2 horas após a abertura do FUS BBB com o transdutor de imersão de baixa potência direcionado ao hemisfério esquerdo medial. Esta é uma imagem representativa de um animal que foi perfundido com 4% de formalina tamponada antes da coleta de tecidos. A abertura do BBB é evidente pela autofluorescência vermelha EBD (seta). (b) Micrografia de uma seção cerebral de 10 μm 2 horas após a abertura do FUS BBB direcionada para o hemisfério esquerdo anterior. Esta é uma imagem representativa de um animal que não foi perfundido antes da coleta de tecidos, portanto, eBD permanece nos vasos sanguíneos. A abertura do BBB é evidente onde o EBD vazou dos vasos sanguíneos (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Abertura do FUS BBB confirmada com contraste de Ressonância Magnética Gadobutrol e expressão EBD. MR imagens antes (a e d) e depois(b e e) abertura BBB. o aprimoramento do contraste gadobutrol confirma a localização da abertura do BBB in vivo (b e e, setas). (c) Seção cerebral de 10 μm mostrando mais confirmação da abertura do BBB com autofluorescência EBD (vermelha) no hipocampo (mancha nuclear DAPI azul). Barra de escala; 500 μm. (f) Micrografo de uma seção cerebral de 10 μm após a abertura do BBB no córtex cingulado anterior evidente pela autofluorescência vermelha EBD (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Entrega localizada de AAV9-hsyn-GFP para o hipocampo via abertura DO FUS BBB. Confirmação de ressonância magnética de abertura do BBB com agente de contraste de ressonância magnética, contraste de ressonância magnética (setas) em imagens coronais (a) e axial (b)ponderadas T1. (c) confirmação histológica da expressão GFP no hipocampo alvo de FUS (verde) 3 semanas após a abertura do FUS BBB e injeção AAV9-hsyn-GFP IV. Azul indica mancha nuclear DAPI para morfologia celular global. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.