Avaliação do estresse oxidativo em amostras biológicas usando o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico

Resumo

O objetivo do ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico é avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas medindo a produção de produtos de peroxidação lipídica, principalmente malondialdeído, utilizando espectrofotometria de comprimento de onda visível a 532 nm. O método descrito aqui pode ser aplicado ao soro humano, lises celulares e lipoproteínas de baixa densidade.

Resumo

Apesar de sua limitada especificidade analítica e robustez, o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido amplamente utilizado como uma métrica genérica de peroxidação lipídica em fluidos biológicos. É frequentemente considerado um bom indicador dos níveis de estresse oxidativo dentro de uma amostra biológica, desde que a amostra tenha sido adequadamente manuseada e armazenada. O ensaio envolve a reação de produtos lipídicos de peroxidação, principalmente malondialdeído (MDA), com ácido tiobarbitúrico (TBA), o que leva à formação de adutos MDA-TBA2 chamados TBARS. O TBARS produz uma cor vermelho-rosa que pode ser medida espectrofotometricamente a 532 nm. O ensaio TBARS é realizado em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C. O MDA puro é instável, mas essas condições permitem a liberação de MDA de MDA bis (acetal de dimetila), que é usado como padrão analítico neste método. O ensaio TBARS é um método simples que pode ser concluído em cerca de 2 h. A preparação dos reagentes de ensaios são descritas em detalhes aqui. Pesquisadores conscientes do orçamento podem usar esses reagentes para experimentos múltiplos a um custo baixo em vez de comprar um kit de ensaio TBARS caro que só permite a construção de uma única curva padrão (e, portanto, só pode ser usado para um experimento). A aplicabilidade deste ensaio TBARS é mostrada em soro humano, lipoproteínas de baixa densidade e lises celulares. O ensaio é consistente e reprodutível, e os limites de detecção de 1,1 μM podem ser alcançados. Recomendações para o uso e interpretação do ensaio espectrofotométrico TBARS são fornecidas.

Introdução

A peroxidação lipídica é um processo no qual radicais livres, como espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio, atacam ligações duplas carbono-carbono em lipídios, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio a partir de um carbono e inserção de uma molécula de oxigênio. Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo, radicais lipídicos e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxynonenal como produtos secundários ^{predominantes1}.

O MDA tem sido amplamente utilizado em pesquisas biomédicas como um marcador de peroxidação lipídica devi....

Protocolo

Os espécimes de soro humano foram obtidos de voluntários consentidos sob aprovação do IRB e de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinque. Os espécimes foram codificados e desidentifilados antes da transferência para o laboratório analítico.

1. Preparação da amostra

1. Lises celulares HepG2
   1. Semente cerca de 10 x ¹⁰⁶ células HepG2 por frasco em 16 frascos T75 com 14 mL de mídia EMEM complementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) e células de cultivo por 2 dias.
   2. Prepare o buffer RIPA: em um tubo de 50 mL, adicione 1,5 mL de 5 M NaCl, 2,5 mL de 1 M Tris-HCl (pH = 7),....

Resultados

Em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C, o malondialdeído (MDA) bis (acetal de dimetila) produz ^MDA23. Os congêneres químicos relacionados com mDA e intimamente relacionados reagem com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para produzir compostos chamados substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dão uma cor vermelho-rosa e têm uma absorção _λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando-se o MDA bis (dimet.......

Discussão

Apesar de suas limitações1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e falta de adequação para comparação entre laboratórios, o ensaio do TBARS é um dos .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x PBS estéril pH 7.4 1 L	VWR, PA	--262	reagente de lise celular
50 mL tubo de centrífuga autônomo	Corning, NY	CLS430897	Material geral
Placa de 96 poços, Não tratada, transparente, com tampa, Não estéril	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Para medir a absorbância
Amicon Ultra-0.5 Dispositivo de filtro de rotação centrífuga de 100 kD	Fisher Scientific, NH	UFC510024	Tampas de purificação de LDL
para tubos de vidro	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	para ensaio TBARS
Cloreto de cobre II	SIGMA, MO	222011-250G	para induzir a oxidação
Tubos de cultura, descartáveis, com acabamento com tampa de rosca, vidro borossilicato (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	para ensaio TBARS
Meio essencial mínimo de águia (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	Mídia celular HepG2
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL	eppendorf, NY	22363204	Material geral
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	Material geral
Fetal Bovine Serum US Source Omega	Scientific, CA	FB-11	para cultura de células
Ácido acético glacial	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagente
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	reagente de lise celular
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvente
HepG2 Células	ATCC, VA	HB-8065	Protótipo de matriz biológica
Ácido clorídrico (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	reagente
de lise celularLegenda Micro 17 Centrífuga	Thermo Scientific, MA	75002431	Material geral
Lipoproteína de baixa densidade, plasma humano	Atenas Research & Tecnologia, GA	12-16-120412	Protótipo de matriz biológica
Barras de agitação magnéticas, Octógono 6-Sortimento	VWR, PA	58948-025	Material geral
Malondialdeído bis (dimetilacetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS
Espectrofotômetro de microplacas Multiskan Go padrão	Fisher Scientific, NH	51119200	Para medir a absorbância
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	reagente de lise celular
Cloreto	de sódio SIGMA, MO	S7653-1KG	reagente de lise celular
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS Reagente
hidróxido de sódio	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS Reagente
SpeedVac Concentrador	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	para concentrando lisados celulares
T-75 Frasco, Cultura de Tecidos Tratados, 250 mL, com tampa de filtro	USA Scientific, FL	658175	cultura de células
Ácido tiobarbitúrico	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagente
TRIS base	Fluka, GA	93362	reagente de lise celular
Tripsina (1x)	VWR, PA	16777-166	Para separar células HepG2

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