Artigo de método

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

DOI:

10.3791/61124

⸱

14 de agosto de 2020

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 2Department of Biology, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

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A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Resumo

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A identificação de interações proteicas e DNA específicas no genoma é importante para entender a regulação genética. A imunoprecipitação de cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) é amplamente usada para identificar locais de ligação em todo o genoma de proteínas de ligação de DNA. No entanto, o método ChIP-seq é limitado por sua heterogeneidade no comprimento de fragmentos de DNA sonicados e DNA de fundo não específico, resultando em baixa resolução de mapeamento e incerteza em locais de ligação de DNA. Para superar essas limitações, a combinação de ChIP com digestão exonuclease (ChIP-exo) utiliza a digestão exonuclease de 5' a 3' para aparar o DNA imunoprecipitado heterogêneo ao local de ligação cruzada proteína-DNA. O tratamento de exonuclease também elimina dna de fundo não específico. O DNA preparado pela biblioteca e exonuclease pode ser enviado para sequenciamento de alto rendimento. O método ChIP-exo permite uma resolução de mapeamento de par de base próxima com maior sensibilidade à detecção e sinal de fundo reduzido. Um protocolo ChIP-exo otimizado para células mamíferas e sequenciamento de próxima geração é descrito abaixo.

Introdução

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Os locais das interações proteína-DNA fornecem uma visão dos mecanismos de regulação genética. A imunoprecipitação de cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) tem sido usada há uma década para examinar interações genoma-DNA em células vivas1,2. No entanto, o método ChIP-seq é limitado pela heterogeneidade na fragmentação do DNA e contaminação de DNA desvinculada que leva a baixa resolução de mapeamento, falsos positivos, chamadas perdidas e sinal de fundo não específico. A combinação de ChIP com digestão exonuclease (ChIP-exo) melhora o método ChIP-seq, aparando o DNA ChIP aos pontos de cruzamento de DNA proteico, fornecendo resolução próxima do par de base e um sinal de fundo baixo3,4,5. A resolução de mapeamento muito melhorada e o baixo fundo fornecido pelo ChIP-exo permitem que locais precisos e abrangentes de ligação proteína-DNA sejam determinados em todo o genoma. O ChIP-exo é capaz de revelar motivos de ligação de DNA funcionalmente distintos, interações cooperativas entre fatores de transcrição (TF) e múltiplos locais de ligação entre proteínas e DNA em um determinado local de ligação genômica, não detectável por outros métodos de mapeamento genômico3,4,6,7.

ChIP-exo foi inicialmente usado em levedura brotante para examinar a vinculação de DNA específica de sequência de TFs, para estudar a organização precisa do complexo de pré-iniciação da transcrição, e estrutura subnucleosômica de histones individuais através do genoma4,8,9. Desde sua introdução em 20114, o ChIP-exo tem sido utilizado com sucesso em muitos outros organismos, incluindo bactérias, camundongos e células humanas7,10,11,12,13,14,15,16,17. Em 2016, Rhee et al.14 usaram ChIP-exo em neurônios mamíferos pela primeira vez para entender como a expressão genética neuronal foi mantida após a baixa regulação da programação TF Lhx3, que forma um complexo heterodimer com outra programação TF Isl1. Este estudo mostrou que, na ausência de Lhx3, o Isl1 é recrutado para novos intensificadores neuronais ligados pelo Onecut1 TF para manter a expressão genética dos genes efeitos neuronais. Neste estudo, o ChIP-exo revelou como vários TFs reconhecem dinamicamente o tipo celular e elementos regulatórios de DNA específicos do estágio celular de forma combinatória na resolução de mapeamento de quase nucleotídeos. Outros estudos também usaram o método ChIP-exo para entender a interação entre proteínas e DNA em outras linhas celulares de mamíferos. Han et al.7 usaram ChIP-exo para examinar a organização genoma de GATA1 e TAL1 TFs em células eritróides de camundongos usando ChIP-exo. Este estudo descobriu que o TAL1 é diretamente recrutado para o DNA e não indiretamente através de interações proteína-proteína com GATA1 ao longo da diferenciação eritrócrio. Estudos recentes também usaram ChIP-exo para traçar o perfil dos locais de ligação em todo o genoma de CTCF, RNA Polymerase II e histonas para estudar mecanismos epigenômicos e transcricionais nas linhas celulares humanas18,19.

Existem várias versões do protocolo ChIP-exo disponíveis3,5,20. No entanto, esses protocolos ChIP-exo são difíceis de seguir para pesquisas que não estão familiarizados com a preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração. Uma excelente versão do protocolo ChIP-exo foi publicada com instruções fáceis de seguir e um vídeo21,mas continha muitas etapas enzimáticas que requerem uma quantidade significativa de tempo para ser concluída. Aqui relatamos uma nova versão do protocolo ChIP-exo contendo etapas enzimáticas reduzidas e tempos de incubação, e explicações para cada etapa enzimática21. O reparo final e as reações de cauda dA são combinadas em um único passo usando enzima de preparação final. Os tempos de incubação para etapas de ligadura de índice e adaptador universal são reduzidos de 2h para 15 min usando um melhorador de ligadura. A reação de quinase após a etapa de ligadura do adaptador de índice descrita no protocolo ChIP-exo anterior é removida. Em vez disso, um grupo de fosfato é adicionado durante a síntese de DNA oligo a uma das extremidades de 5' do adaptador de índice(Tabela 1), que será usado para a etapa de digestão de exonuclease lambda. Enquanto o protocolo chip-exo anterior usou recJf digestão exonuclease para eliminar contaminantes de DNA de uma única cadeia, este passo de digestão é removido aqui porque não é crítico para a qualidade da biblioteca ChIP-exo. Além disso, para purificar o DNA cruzado reverso após a elução do ChIP, um método de purificação de contas magnéticas é usado em vez do método de extração fenol:clorofórmio:isoamyl álcool (PCIA). Isso reduz o tempo de incubação da extração de DNA. É importante ressaltar que ele remove a maioria dos dimers adaptadores formados durante a ligante do adaptador de índice, o que pode afetar a eficiência do PCR mediado por ligadura.

O protocolo ChIP-exo apresentado aqui é otimizado para a detecção de interações proteicas precisas e DNA em neurônios mamíferos diferenciados das células-tronco embrionárias do camundongo (ES). Brevemente, as células neuronais colhidas e cruzadas são lísedas, para permitir que a cromatina seja exposta à sônica, e depois sônica para que fragmentos de DNA de tamanho adequado sejam obtidos(Figura 1). As contas revestidas de anticorpos são então usadas para imunoprecipitar seletivamente cromatina fragmentada e solúvel à proteína de interesse. Enquanto o DNA imunoprecipitado ainda está nas contas, reparação final, ligadura de adaptadores de sequenciamento, reação de preenchimento e passos de digestão exonuclease lambda de 5' a 3' são realizados. O passo de digestão exonuclease é o que dá ao ChIP-exo sua ultra-alta resolução e alta relação sinal-ruído. Lambda exonuclease apara o DNA imunoprecipitado alguns pares de base (bp) do local de crosslinking, fazendo com que o DNA contaminante seja degradado. O DNA ChIP tratado pela exonuclease é eludido das contas revestidas de anticorpos, os crosslinks de DNA proteico são invertidos e as proteínas são degradadas. O DNA é extraído e desnaturado ao DNA ChIP de um único fio, seguido de ressarem e extensão para fazer DNA de dupla derivação (dsDNA). Em seguida, é realizada a ligadura de um adaptador universal para as extremidades tratadas com exonuclease. O DNA resultante é purificado, então PCR amplificado, gel purificado e submetido ao sequenciamento de próxima geração.

O protocolo ChIP-exo é mais longo que o protocolo ChIP-seq, mas não é muito desafiador tecnicamente. Qualquer DNA ChIP imunoprecipitado com sucesso pode ser submetido a ChIP-exo, com várias etapas enzimáticas adicionais. As notáveis vantagens do ChIP-exo, como resolução de mapeamento ultra-alta, um sinal de fundo reduzido e diminuição de falsos positivos e negativos, em relação a sites de vinculação genômica, superam o custo de tempo.

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Protocolo

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NOTA: A água destilada e desionizada autoclavada (ddH2O) é recomendada para fazer buffers e misturas mestres de reação. As seções 1-4 descrevem a lise celular e a sônica, as seções 5-7 descrevem a imunoprecipitação de cromatina (ChIP), as seções 8-11 descrevem reações enzimáticas em contas, seções 12 e 13 descrevem elução chip e purificação de DNA, e seções 14-19 descrevem a preparação da biblioteca.

1. Células de colheita e crosslinking

  1. Depois de diferenciar as células ES do camundongo em neurônios pós-metóticos, adicione 11% de formaldeído às células colhidas a uma concentração final de 1% (v/v). Células rochosas em uma plataforma de balanço (um roqueiro, agitador ou rotador) por 15 minutos, em temperatura ambiente (RT, 25 °C).
    NOTA: Dependendo da proteína alvo a ser cruzada, menor formaldeído crosslinking (por exemplo, uma concentração final de 0,5%) ou dupla ligação cruzada com glutarate de desuccinimidílico (DSG) pode ser usado.
  2. Adicione 4,5 M de glycina a uma concentração final de 150 mM para parar a reação de crosslinking. Células de rocha em uma plataforma de balanço na RT, por 5 minutos.
  3. Centrifugar as células interligadas em tubos cônicos de 15 mL em RT, por 6 min, a 1.350 x g. Aspire a solução e, em seguida, resuspend células em 5 mL de salina tamponada com fosfato de 1x (PBS).
    NOTA: As pelotas de células cruzadas podem ser armazenadas a -80 °C após o congelamento de flash com nitrogênio líquido.

2. Lise celular

NOTA: As seguintes etapas deste protocolo são para aproximadamente 2 x 107 células neuronais diferenciadas das células ES do mouse. Para quebrar células abertas, serão utilizados tampões de lise contendo vários detergentes. Adicione 50 μL de 1000x completo inibidor de protease (CPI) a 50 mL de tampão pouco antes de usar.

  1. Prepare os buffers de lise 1-3, conforme descrito na Tabela 2.
  2. Descongele as pelotas de células cruzadas no gelo e, em seguida, resuspend completamente pelotas de células em 3 mL de tampão de lise 1 em tubos cônicos de 15 mL. Arrase a 4 °C por 15 min em uma plataforma de balanço. Centrifugar a 1.350 x g por 5 min a 4 °C e aspirar supernanato.
  3. Resuspend completamente células pelotas em 3 mL de tampão de lise 2. Arrase a 4 °C por 10 min em uma plataforma de balanço. Centrifugar a 1.350 x g por 5 min a 4 °C e aspirar supernanato.
  4. Adicione 1 mL de tampão de lise 3 a cada pelota e mantenha no gelo. Imediatamente proceder à sônica.

3. Cromatina sonicante

NOTA: Mantenha amostras no gelo ou a 4 °C durante este procedimento de sonicação para reduzir a reversão do crosslink.

  1. Utilizando uma espátula estéril, adicione contas de sônica(Tabela de Materiais)até a marca de graduação de 0,2 mL em tubos de poliestireno de 15 mL. Lave as contas de sônica por vórtice em 600 μL de 1x PBS até que não sejam visíveis manchas secas. Centrifugar os tubos por 5 s a 30 x g e aspirar 1x PBS.
    NOTA: A sônicação em tubos de poliestireno é mais eficiente do que a sônica em tubos de polipropileno. Se um número menor de células (por exemplo, <106 células) for sônico, use tubos de poliestireno de 1,5 mL sem adicionar contas de sônica.
  2. Resuspenque minuciosamente os lises nucleares em 1 mL de tampão de lise 3 (a partir da etapa 2.4), depois transfira para os tubos de poliestireno de 15 mL contendo contas de sônica. Brevemente vórtice dos tubos de poliestireno.
  3. Para fragmentar o DNA de cromatina transligada, sonicates nucleares a 4 °C para um número otimizado de ciclos, com amplitude de energia a 30 W, e ciclos de sonicização definidos para 30 s on/30 s off.
    NOTA: A otimização da sônica para cada tipo de célula e lote resultará no melhor rendimento chip-exo. Para 2 x 107 células neuronais do camundongo, 20-30 ciclos de sônica nas configurações mencionadas fragmentarão a cromatina na faixa de 100-500 bp.
  4. Após a sônicação ser concluída, transfira todos os tubos supernacidos (lises sônicas), de cada amostra, para tubos de 1,5 mL. Adicione 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-yl)phenoxy]etanol) a cada amostra em uma concentração final de 1%. Misture por pipetação.
  5. Para detritos celulares de pelotas, centrífuga amostras a 13.500 x g por 10 min a 4 °C. Transfira todos os lises sonicadas (supernascentes) de cada amostra para novos tubos de 1,5 mL.
  6. Pegue 30 μL de lise sônica de cada amostra (~3% de lise sônica) e adicione a novos tubos de 1,5 mL para verificar a sônicação. Armazene os lises sonicadas restantes a 4 °C até ficarem prontos para incubação com contas revestidas de anticorpos.

4. Verificando a sônica

  1. Faça 20 mL de tampão 2x proteinase K adicionando 2 mL de 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 mL de 0,5 M EDTA, 10 mL de 10% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) e 6 mL de ddH2O autoclavado. Não adicione o IPC a este buffer. Armazene em tubo de 50 mL na RT.
  2. Para reverter o crosslink proteína-DNA, removendo as proteínas, pegue os 30 μL de cromatina sônica de cada amostra (a partir do passo 3,6), adicione 166 μL de ddH2O autoclaved, 200 μL de tampão K proteinase 2x e 4 μL de 20 mg/mL proteinase K. Brevemente vórtice das amostras, e, em seguida, incubar a 65 °C por 1-3 h a 24 x g.
  3. NOTA: Os lises sonicadas podem ser cruzados reversos a 65 °C durante a noite.
  4. Extrair DNA utilizando PCIA (25:24:1) e método de precipitação de etanol da seguinte forma.
    ATENÇÃO: PCIA é tóxico. Use sob um capô de fumaça com equipamento de proteção individual padrão (EPI).
    1. Adicione 400 μL de PCIA a cada amostra em tubos de 1,5 mL, coloque vórtice à velocidade máxima e amostras de vórtice para 20 s. Centrifugar a 18.400 x g por 6 min no RT. Duas fases serão observadas. Transfira cuidadosamente a camada aquosa superior (fase clara) de cada amostra para novos tubos de 1,5 mL.
    2. Adicione 1 μL de 10 mg/mL RNase A. Incubar amostras a 37 °C por 30 min.
    3. Adicione 1 μL de 20 mg/mL de glicogênio a cada amostra e, em seguida, precipitar com 1 mL de etanol gelado 100% (armazenado em um congelador de -20 °C). Misture brevemente, depois incubar amostras no congelador de -80 °C por 30 minutos a 1 h. Centrífuga amostras a 18.400 x g por 10 min a 4 °C e despeje cuidadosamente 100% etanol.
    4. Lave as pelotas com 500 μL de etanol gelado 70% (armazenado em um congelador de -20 °C). Centrifugar a 18.400 x g por 5 min a 4 °C. Despeje cuidadosamente 70% de etanol.
    5. Incubar amostras em tubos de 1,5 mL a 50 °C até que o etanol restante seja evaporado. Resuspend pelotas de DNA em 15 μL de ddH2O autoclaved ou ddH2O livre de nuclease.
    6. Execute as amostras de DNA extraídas, juntamente com uma escada de DNA, em um gel de 1,5% de agarose a 120-180 V e verifique o tamanho do DNA sonicado.

5. Incubação de anticorpos com contas

NOTA: As seguintes etapas deste protocolo são para aproximadamente 2 x 107 células neuronais diferenciadas das células ES do mouse. Não congele e descongele contas magnéticas em nenhum momento durante o protocolo ChIP-exo, pois as contas podem rachar causando contaminação da amostra ou o desempenho do anticorpo pode ser comprometido.

  1. Após a lise celular e a sônica, prepare as contas magnéticas Protein G(Tabela de Materiais)para ChIP, misture contas magnéticas até homogêneas e adicione 25 μL de contas magnéticas a tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL.
    NOTA: O tipo de contas magnéticas utilizadas dependerá da espécie dos anticorpos.
  2. Lave as contas com 1 mL de solução de bloqueio(Tabela 2),misture bem, depois coloque em um rack magnético por 1 min. Enquanto ainda estiver em um rack magnético, remova o supernascente quando estiver claro.
  3. Adicione 1 mL de solução de bloqueio às contas magnéticas. Tubos de rocha por 10 min a 4 °C em uma plataforma de balanço. Gire brevemente, em seguida, coloque tubos em um rack magnético e remova supernaspeuta.
  4. Repita o passo 5.3 mais duas vezes.
  5. Adicione 500 μL de solução de bloqueio às contas magnéticas. Gire brevemente o anticorpo contra Isl1 (0,04 μg/μL, Tabela de Materiais), em seguida, adicione 4 μg de anticorpo aos tubos de baixa ligação de proteína correspondentes de 2 mL contendo as contas magnéticas na solução de bloqueio.
  6. Repita o passo 5.5 sem anticorpo (ou seja, o controle sem anticorpos para ChIP).
    NOTA: A quantidade de anticorpos a adicionar pode ser determinada empiricamente considerando a qualidade do anticorpo e o número de células utilizadas para ChIP.
  7. Amostras de rocha a 4 °C por 6-24 h em uma plataforma de balanço.

6. Imunoprecipitação de cromatina (ChIP)

  1. Lave as contas revestidas de anticorpos da etapa 5.8 com 1 mL de solução de bloqueio. Coloque amostras em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Remova o supernanato.
  2. Repita o passo 6.1 mais duas vezes.
  3. Resuspend contas revestidas de anticorpos em 50 μL de solução de bloqueio, em seguida, transferir para novos tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL. Para cada amostra de ChIP, adicione lises sonicadas (~1,0 mL da etapa 3.6) às contas revestidas de anticorpos em tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL.
  4. Incubar cada amostra em uma plataforma de balanço durante a noite a 4 °C.

7. Lavagens chip

NOTA: Mantenha amostras no gelo ou a 4 °C para manter a ligação entre proteínas e DNA durante as lavagens chip.

  1. Faça tampão de lavagem de sal alto, tampão de lavagem LiCl e tampão Tris-HCl de 10 mM (pH 7.4) conforme descrito na Tabela 3. Armazene em tubos de 50 mL a 4 °C. Adicione 50 μL de estoque de 1000x iPC a todos os buffers pouco antes de usar.
  2. Gire brevemente amostras em tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL para coletar líquido das tampas, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o supernante cuidadosamente com uma pipeta.
  3. Para as lavagens chip, adicione 1 mL de tampão de lise 3 (a 4 °C) a cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
  4. Adicione 1 mL de tampão de lavagem de sal alto a frio em cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
  5. Adicione 1 mL de tampão de lavagem licl frio a cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
  6. Adicione 1 mL de tampão Tris-HCl frio de 10 mM (pH 7.4) a cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
    NOTA: O buffer Tris-EDTA (pH 8.0) pode ser usado em vez do buffer Tris-HCl (pH 7.4).
  7. Repita as etapas 7.4-7.6 três vezes.
  8. Transfira as contas de amostra com 500 μL de tampão Tris-HCl (pH 7.4) para tubos frescos de 1,5 mL. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.

8. Reparação final e reação de cauda dA em contas

NOTA: A sônica muitas vezes gera dsDNA não contundente. Uma reação de reparação final é necessária para fazer DNA sem corte antes da reação de cauda dA seguida pela etapa de ligadura do adaptador de índice. Para ligação de DNA final pegajoso com DNA adaptador de índice, dATP é adicionado à extremidade de 3' de um fragmento dsDNA bruto pela reação de cauda dA. A mistura de reação de preparação final contém dATP.

  1. Após as lavagens chip, adicione 38 μL de ddH2O autoclaved às contas de amostra em tubos de 1,5 mL para reparo final e reação de cauda dA.
  2. Adicione 5,6 μL de mix de reação de preparação final e 2,4 μL de mistura de enzima de preparação final(Tabela de Materiais) a cada amostra (volume total de reação: 46 μL). Incubar amostras a 20 °C por 30 min.
  3. Lave as contas como descrito nas etapas anteriores de lavagem chip 7.4-7.6.

9. Ligante adaptador de índice em contas

NOTA: O adaptador de índice tem de 6 a 10 bases de sequências de índices com código de barras, específicas de uma determinada amostra usada para multiplexar múltiplas amostras em sequenciamento de alto rendimento. As sequências de DNA do adaptador de índice são descritas na Tabela 1.

  1. Para ligadura adaptadora de índice, adicione 27 μL de tampão Tris-HCl frio de 10 mM (pH 7.4) às contas de amostra. Adicione 2 μL de adaptador de índice de 15 μM, 0,5 μL de melhorador de ligadura e 15 μL de mix mestre ligase(Tabela de Materiais) a cada amostra (volume total de reação: 44,5 μL).
  2. Incubar amostras a 20 °C por 15 min. Lave contas como descrito nas etapas 7.4-7.6.

10. Reação de preenchimento em contas

NOTA: Após a ligadura do adaptador, não há ligação de fosfodiester entre a extremidade de 5' do adaptador e a extremidade de 3' do DNA ChIP. O corte pode ser reparado por uma reação de preenchimento.

  1. Adicione 47 μL de tampão tris-hcl frio de 10 mM (pH 7.4) às contas de amostra.
  2. Faça a mistura de reação de preenchimento(Tabela 4 e Tabela de Materiais) no gelo.
  3. Adicione 11,1 μL de mistura de preenchimento a cada amostra (volume total de reação: 58,1 μL). Incubar amostras a 30 °C por 20 min. Lave contas como descrito nas etapas 7.4-7.6.

11. Digestão exonuclease lambda em contas

  1. Após a reação de preenchimento nas contas, adicione 50 μL de ddH2O autoclaved a frio às contas de amostra.
  2. Para digerir o DNA ChIP na direção de 5' a 3', adicione 6 μL de tampão exonuclease lambda 10x e 2 μL de exonuclease lambda de 5 U/μL(Tabela de Materiais,volume total de reação: 58 μL). Incubar amostras a 37 °C por 30 min. Lave contas como descrito nas etapas 7.4-7.6.

12. Elução e crosslinking reverso

  1. Faça buffer de eluição ChIP conforme descrito na Tabela 5.
    NOTA: Não adicione o IPC ao buffer de eluição ChIP.
  2. Para elute amostras chIP das contas, resuspensar amostras em 75 μL de tampão de elução ChIP e incubar a 65 °C por 15 min a 130 x g.
  3. Adicione 2,5 μL de 20 mg/mL proteinase K(Tabela de Materiais) às amostras. Brevemente vórtice, em seguida, incubar as amostras durante a noite a 65 °C.

13. Extração de DNA

  1. Depois que as amostras incubaram durante a noite a 65 °C, gire brevemente amostras, coloque em um rack magnético por 1 min, em seguida, transfira o supernante de cada amostra para novos tubos de 1,5 mL.
  2. Adicione 1 μL de 10 mg/mL RNase A às amostras. Brevemente vórtice, em seguida, incubar as amostras a 37 °C por 30 min. Adicione ~25 μL de ddH2O autoclaved a volume de até 100 μL.
  3. Purificar o DNA usando contas magnéticas(Tabela de Materiais). DNA eluto com 16 μL de ddH2O autoclaved ou ddH2O sem nuclease.

14. Denaturação, ressarem e primer extensão

  1. Após a elução chip e crosslinking reverso, transfira 16 μL das amostras de DNA extraídas da etapa 13.3 para os tubos PCR.
  2. Faça mistura de desnaturação e relagem de primer(Tabela 6 e Tabela de Materiais) no gelo. Adicione 1,2 μL de mistura de desnaturing e primer a cada amostra (volume total de reação: 17,2 μL). Execute amostras usando o programa descrito na Tabela 6 para desnaturar e renastilizar primers para o DNA modelo.
  3. Faça a mistura de extensão de primer(Tabela 7 e Tabela de Materiais) no gelo.
  4. Uma vez que o programa de desnaturação e primers anneal esteja completo, adicione 3 μL de mix de extensão de primer às amostras (volume total de reação: 20,2 μL). Execute amostras usando o programa para extensão de primer descrita na Tabela 7.
  5. Proceda imediatamente para a reação de rabo-de-dA.

15. reação de cauda dA

NOTA: Para a ligadura de DNA final pegajoso com DNA adaptador universal, o dATP é adicionado à extremidade de 3' de dsDNA sem corte pela reação de cauda dA.

  1. Faça mistura de rabo-dA(Tabela 8 e Tabela de Materiais) no gelo.
  2. Adicione 4,1 μL de mistura de cauda dA a cada amostra (volume total de reação: 24,3 μL). Execute amostras utilizando o programa para dA-tailing(Tabela 8).
  3. Imediatamente proceda à ligadura universal do adaptador.

16. Ligadura universal do adaptador

NOTA: O adaptador universal inclui sequências específicas de sequenciamento de alto rendimento para reconhecimento de amostras de DNA para química de sequenciamento. As sequências universais de DNA do adaptador são descritas na Tabela 1.

  1. Após a reação de cauda dA, faça mistura universal de ligadura adaptador (Tabela 9 e Tabela de Materiais) para ligadura universal de adaptador.
  2. Adicione 21,5 μL a cada amostra (volume total de reação: 45,8 μL) e incuba amostras por 15 min a 20 °C.

17. Limpeza de DNA

  1. Purificar o DNA usando contas magnéticas(Tabela de Materiais). DNA eluto com 21 μL de ddH2O autoclaved ou ddH2O sem nuclease.
  2. Armazene amostras a -20 °C até que estejam prontas para realizar a purificação de PCR (LM-PCR) e pcr mediadas por ligadura.

18. PCR mediado por ligadura

NOTA: As sequências de primer LM-PCR são descritas na Tabela 1.

  1. Após a limpeza do DNA, faça mistura LM-PCR(Tabela 10 e Tabela de Materiais) no gelo.
  2. Adicione 29 μL de mistura LM-PCR a cada amostra (volume total de reação: 50 μL) e execute amostras utilizando o programa para LM-PCR(Tabela 10).
  3. Imediatamente proceder à purificação de gel de DNA amplificado pcr, seguido de purificação de DNA para sequenciamento de alto rendimento.

19. DNA purificação do DNA amplificado LM-PCR

  1. Execute as amostras de DNA amplificadas LM-PCR, juntamente com uma escada de DNA, em um gel de 1,5% de agarose a 120-180 V e extirma bandas de 200-400 bp.
  2. Purificar o DNA do gel excisado utilizando um kit de extração de gel(Tabela de Materiais).
  3. Após a purificação do DNA, verifique a concentração(Tabela de Materiais) de cada amostra da biblioteca ChIP-exo. Envie amostras para sequência de alta taxa para sequência de leitura única.
    NOTA: O comprimento de leitura preferido para sequenciamento de leitura única é de pelo menos 35 bp, o que é suficiente para alinhar exclusivamente as leituras de sequenciamento ao genoma de referência em células do camundongo ou humano. Para a maioria dos fatores de transcrição em células de camundongos ou humanos, 10-20 milhões de leituras por amostra chip-exo são suficientes para identificar seus locais de ligação genômica. Pelo menos 30 milhões de leituras por amostra são necessárias para mapear regiões genômicas enriquecidas em marcas de histona em células de mamíferos.

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Resultados

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A Figura 2A ilustra os resultados da sônica após alise celular e a sônicação, com vários ciclos, de células de neurônios motores diferenciadas das células ES do camundongo. O número ideal de ciclos de sônicação (por exemplo, 12 ciclos na Figura 2A) gerou forte intensidade de DNA em fragmentos de DNA de 100-400 bp. Bibliotecas ChIP-exo de alta qualidade são baseadas no tamanho e quantidade de DNA de cromatina fragmentada. Assim, recomenda-se a otimização da sônic...

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Discussão

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Neste protocolo, o ChIP seguido pela digestão exonuclease é usado para obter bibliotecas de DNA para a identificação de interações proteína-DNA em células de mamíferos em resolução de mapeamento ultra-alta. Muitas variáveis contribuem para a qualidade do experimento ChIP-exo. Parâmetros experimentais críticos incluem a qualidade dos anticorpos, a otimização da sônica e o número de ciclos LM-PCR. Esses parâmetros experimentais críticos também são o que pode limitar os experimentos chip-exo e serão discutidos abaixo.

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos ao membro do laboratório Rhee por compartilhar dados inéditos e discussões valiosas. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) que concede RGPIN-2018-06404 (H.R.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agarose, UltraPureInvitrogen16500Verificando a Sonicação (Seção 4.3.6) e Purificação em Gel de DNA Amplificado LM-PCR (Seção 19.1)
Albumina, Soro Bovino (BSA), Livre de Protease, Isolamento de Choque Térmico, Min. 98%BioShopALB003Solução de Bloqueio
Anticorpo contra Isl1DSHB39.3F7Incuação de anticorpos com esferas (Seção 5.6)
Bioruptor Pico& nbsp;DiagenodeB01060010Cromatina Sonicante (Seção 3.3)
Albumina de soro bovino (BSA), Grau de Biologia MolecularNew England BioLabsB9000SReação de Preenchimento em Grânulos (Seção 10.2) e Desnaturação, Recozimento de Primer e Extensão de Primer (Seção 14.2)
Centrífuga 5424 REppendorf5404000138Sonicante Cromatina (Seção 3.5), Verificação de Sonicação (Seção 4.3.1, 4.3.3 e 4.3.4)
Centrífuga 5804 REppendorf22623508Harvest, reticulação e congelamento de células (Seção 1.3), Lise celular (Seção 2.2 e 2.3), Cromatina Sonicante (Seção 3.1)
cOmplete, Mini, Inibidor de Protease sem EDTA CocktailRoche4693159001Adicionado a todos os tampões, exceto tampão Proteinase K e tampão de eluição ChIP
Solução dATPNew England BioLabsN0440SdA Reação de cauda (Seção 15.1)
Sal de Sódio de Ácido Desoxicólicofisher scientificBP349Tampão de Lise 3, Tampão de Lavagem de Alto Sal e Tampão de Lavagem LiCl
Mistura dNTP, Grau de Biologia MolecularThermo ScientificR0192Reação de Preenchimento em Grânulos (Seção 10.2) e Desnaturação, Recozimento de Primer e Extensão de Primer (Seção 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x Thermo ScientificK1081PCR mediado por ligação (Seção 18.1)
EDTA, 0.5 M, Solução Estéril, pH 8.0BioShopEDT111Tampão de Lise 1-3, Verificação de Sonicação (Seção 4.1), Tampão de Lavagem com Alto Teor de Sal, Tampão de Lavagem LiCl e Tampão de Eluição ChIP
Álcool Etílico Anidro, 100%Álcoois comerciaisP006EAANVerificação de Sonicação (Seção 4.3.3)
Formaldeído, 36.5-38%, contém 10-15% metanolSigmaF8775Colheita, reticulação e congelamento de células (Seção 1.1)
Glicerol, Grau de Reagente, min 99.5%BioShopGLY002Tampão de Lise 1
Glicina, Grau de Biotecnologia, min. 99%BioShopGLN001Colheita, reticulação e congelamento de células (Seção 1.2)
Glicogênio, Grau de RNAThermo ScientificR0551Verificando a Sonicação (Seção 4.3.3)
HEPES, Solução filtrada estéril 1 M, pH 7,3 BioShopHEP003Tampão de Lise 1, Tampão de Lavagem com Alto Sal
Fragmento de Klenow (3->5 exo-)New England BioLabsM0212SdA-Tailing Reaction (Seção 15.1)
Exonuclease LambdaNew England BioLabsM0262SDigestão de exonuclease Lambda em grânulos (Seção 11.2)
Ligase EnhancerNew England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II Kit de Biblioteca de DNA. Ligadura do adaptador de índice em grânulos (Seção 9.1) e Ligação do adaptador universal (Seção 16.1)
Ligase Master MixNew England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II Kit de biblioteca de DNA. Ligadura do Adaptador de Índice em Grânulos (Seção 9.1) e Ligação do Adaptador Universal (Seção 16.1)
Cloreto de Lítio (LiCl), Grau de reagenteBioshopLIT704LiCl Wash Buffer
Grânulos magnéticos para ChIP (Dynabeads Protein G)Dynabeads Protein G (grânulos magnéticos para ChIP)Dynabeads Protein G (grânulos magnéticos para ChIP)Incubação de anticorpos com grânulos (Seção 5)
Grânulos magnéticos para purificação de DNA (AMPure XP Beads)Beckman CoulterA63880Extração de DNA (Seção 13.3) e Limpeza de DNA (Seção 17.1)
Rack magnético (DynaMag-2 Magnet)Invitrogen12321DUsado em muitas etapas nas Seções: 5 - 11, 13
Kit de Extração de Gel MinEluteQiagen 28604Purificação em Gel de DNA amplificado por PCR (Seção 19.2)
Solução de sal de sódio N-Lauroilsarcosina, solução aquosa a 30%, ≥ 97,0% (HPLC)Tampão delise Sigma61747
Etoxilato de octilfenol (IGEPAL CA630)BioShopNON999Tampão de lise 1 e tampão de lavagem LiCl
Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico, grau de biotecnologia (25:24:1)BioShopPHE512Verificando a sonicação (Seção 4.3.1)
phi29 DNA polimeraseNew England BioLabsM0269LReação de preenchimento em grânulos (Seção 10.2) e desnaturação, recozimento de primer e extensão de primer (Seção 14.3 e 14.4)
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x Corning21040CVHarvest, reticulação e congelamento de células (Seção 1.3) e cromatina sonicante (Seção 3.1), incuação de anticorpos com grânulos (Seção 5.1)
Fonte de alimentação básicaPowerPac BioRad1645050verificação de sonicação (Seção 4.3.6) e purificação em gel de DNA amplificado LM-PCR (Seção 19.1)
Sistema de PCR ProFlexPCRProFlex da Applied BiosystemsUsado nas Seções: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 e 18.2
Tubo de Proteína LoBind, 2.0 mL Eppendorf22431102com grânulos (Seção 5.2) e imunoprecipitação de cromatina (Seção 6.3)
Solução de proteinase K, RNA GradeInvitrogen25530049Checking Sonication (Seção 4.2) e eluição e reticulação reversa (Seção 12.3)
Qubit 4.0 FluorômetroInvitrogenQ33226Purificação em gel de DNA amplificado por PCR (Seção 19.3)
Ensaio Quibit dsDNA BR kitInvitrogenQ32853Purificação em Gel de DNA amplificado por PCR (Seção 19.3)
Rnase A, Dnase e Protease-freeThermo ScientificEN0531Verificação de Sonicação (Seção 4.3.2) e Extração de DNA (Seção 13.2)
Cloreto de sódio (NaCl), BioReagente SigmaS5886Tampão de Lise 1-3, Tampão de Lavagem de Alto Sal
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), Grau de EletroforeseBioShopSDS001Verificando Sonicação (Seção 4.1), Tampão de Lavagem de Alto Sal e Tampão de Eluição ChIP Esferas
Sonicação e Tubos Bioruptor de 15 mLDiagenodeC01020031Sonicating Chromatin (Seção 3.1 e 3.2)
ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020Seção 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 e 16.2
Solução de cloridrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 7.4SigmaT2194Tampão Tris-HCl 10 mM
Solução de cloridrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 8.0SigmaT2694Tampão de lise 2, tampão de lise 3, verificação de sonicação (Seção 4.1), tampão de lavagem LiCl e tampão de eluição ChIP
Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn)New England BioLabsE7546SEnd Prep Reaction mix e End Prep Enzyme mix. Reparação final e reação de cauda dA em grânulos (Secção 8.2)
VWR Mini Tube Rocker, Velocidade VariávelVWR10159-752Utilizado em muitas etapas nas secções: 1, 2, 5, 6 e 7
2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol, Triton X-100,1 BioShopTRX506de grau reagente, Cromatina Sonicante (Secção 3.4) e Tampão de lavagem com alto teor de sal
3 Sistema de Incubação de anticorpos de Tampão de lise

Referências

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