A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.
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Artigo de método
Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)
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Resumo
Resumo
Estudar a estrutura e a dinâmica das cinetochores e centrosmers é importante na compreensão da instabilidade cromossômica (CIN) e da progressão do câncer. Como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e participar da segregação precisa do cromossomo é uma questão fundamental. O CENP-A é proposto para ser o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade do centromere, e a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular.
Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a ubiquização em uma lise diferente é induzida por causa da marcação do EYFP na proteína mutante CENP-A K124R. A ubiquização de Lysine 306 (K306) no EYFP-CENP-A K124R foi identificada com sucesso, o que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. Uma ressalva é discutida no uso de GFP/EYFP ou na marcação de proteína de alto peso molecular como ferramenta para analisar a função de uma proteína. Também é discutido o limite técnico atual para a detecção de bandas ubiquadas, identificação de ubiquização específica do local e visualização de ubiquização em células vivas ou uma única célula específica durante todo o ciclo celular.
O método de análise de espectrometria de massa aqui apresentado pode ser aplicado à proteína CENP-A humana com diferentes tags e outras proteínas centromere-kinetochore. Esses métodos combinatórios que consistem em vários ensaios/análises poderiam ser recomendados para pesquisadores interessados em identificar funções funcionais de ubiquização.
Introdução
Na maioria dos eucariotes, os microtúbulos de fuso devem ser anexados a uma única região de cada cromossomo, denominado centômero. O kinetochore é um complexo de proteínas que estão localizadas no centromere. Estudar o tempo dos movimentos da proteína centrómera e da kinetochore e a estrutura de cinetochores e centromers é importante para a compreensão da instabilidade cromossomo (CIN) e da progressão do câncer. As principais questões são como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e como participam da segregação precisa do cromossomo. Na maioria das espécies, a presença de um nucleossomo especial conte....
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Protocolo
1. Cultura celular e transfecção retrovírus de construções pBabe-EYFP-CENP-A
NOTA: O EYFP-CENP-A é expresso a partir de pBabe-EYFP-CENP-A em nível de proteína semelhante ao CENP-A endógeno. A proteína CENP-A celular total é substituída por este EYFP-CENP-A após a interrupção do CENP-A-/F aleelo por Cre recombinase como em células RPE-1 CENP-A-/-6.
- Preparação do supernatante contendo retrovírus usando células de embalagem 293T.
- Dia 0: Espalhe células de embalagem 293T na placa de cultura de 6 poços (1,0 x 106 células/bem). Células de cultura em DMEM de alta glicose com 10% de FB....
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Resultados
O mutante EYFP-CENP-A K124 mostra ubiquização, interação com HJURP, e sem defeitos na localização do centromere nem letalidade celular. Aqui o sistema relatado por Fachinetti et al. (2017)6 foi restituído: em células humanas diploides (RPE-1) transportando uma interrompida e uma alelo CENP-A (CENP-A-/F),EYFP-CENP-A foi expressa do vetor retrovírus pBabe-EYFP. Neste sistema, a expressão do CENP-A endógeno do CENP-A-/F alelo poderia s.......
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Discussão
Aqui descrevemos métodos de análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R8. Em nossos resultados, identificamos com sucesso a ubiquização na lysina 306 (K306) em EYFP-CENP-A K124R, que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. A análise de espectrometria de massa descrita aqui é um método de imita.......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Chao-Jun Li no Centro de Pesquisa Animal Modelo, Universidade de Nanjing pela análise de espectrometria em massa. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e pesquisadores atuais do Centro de Pesquisa Animal Modelo, Nanjing University e Greehey Children's Cancer Research Institute por sua discussão útil, orientação experimental e reagentes. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler por seus generosos presentes de reagentes. Y.N. foi apoiado pelo Fundo de Construção da Província de J....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equpiments/Tools | |||
| 0,5 ml tubos de baixa ligação de proteína | Eppendorf | 022431064 | Para análise de espectrometria de massa |
| Placa de cultura de células de 10 cm | BIOFIL/JET, China | 700224 Placa de | cultura de tecidos de 10 cm (Yohei lab, PN63) |
| Cluster de cultura de células de 6 poços | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | Cultura de 6 poços placa |
| CentriVap | LABCONCO-Concentrador | a | vácuo de bancada para peptídeos secos a vácuo para análise de espectrometria de massa |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μ m | Eksigent Technologies | 805-00120 | Coluna de cromatografia líquida (RPLC) para análise de espectrometria de massa |
| HCX PL APO 100x lente de imersão em óleo | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Lente de imersão em óleo |
| HCX PL APO 63x lente de imersão em óleo | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Lente de imersão em óleo |
| Immobilon-FL PVDF Membrana de transferência | EMD Millipore | IPVH00010 | Para western blot |
| Leica DM IRE2 microscópio de fluorescência motorizado | Microscópio | de | fluorescência motorizado |
| Leica EL6000 fonte de luz compacta Leica | de luz externa para excitação fluorescente | ||
| Micro Vidro de cobertura (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Vidro de cobertura (22 mm x 22 mm) |
| Modelo V16-2 aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamida | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | Aparelho de eletroforese em gel I para aplicar um gel SDS-PAGE maior |
| nanoLC.2D | Eksigent | Technologies-sistema de | cromatografia líquida para análise de espectrometria de massa |
| NuPAGE 4%-12% Géis de proteína Bis-Tris | Thermo Fisher | NP0335BOX | Os géis de proteína Bis-Tris 4%-12% disponíveis comercialmente para análise |
| de espectrometria de massaMicroscópio confocal de varredura a laser Olympus FLUOVIEW FV3000 | Microscópio de varredura a laser confocal Olympus-Confocal (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) | ||
| ORCA-R2 Câmera CCD Degital | Hamamatsu | C10600-10B | Câmera CCD |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | Para uma barreira repelente de água em coloração imunofluorescente |
| TECIDO PLACAS DE CULTURA 10CM | VWR | 25382-166 | Placa de cultura de tecidos de 10 cm |
| Eletroforese vertical para execução de gel (tamanho grande) | Junyi, China | JY-SCZ6+ | Aparelho de eletroforese em gel II para aplicar gel SDS-PAGE maior (Yohei lab, PE23) |
| VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro lâminas |
| Anticorpos primários | |||
| Anticorpo anti-CENP-A | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Anticorpo monoclonal de camundongo |
| Anticorpo anti-CENP-B | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Anticorpo monoclonal de camundongo |
| anti-GAPDH | ABCAM | ab37168 | Anticorpo policlonal de coelho |
| anti-GAPDH | Invitrogen | PA1987 | Anticorpo |
| policlonal de coelhoanti-GFP anticorpo | ANTI #76 (Anticorpo caseiro) | Anticorpo policlonal de coelho | |
| anti-HA (3F10) | Roche | 11815016001 | Anticorpo monoclonal de rato |
| anti-HJURP | Proteintech Group | 15283– Anticorpo | policlonal de coelho |
| 1-AP anti-ubiquitina | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | Anticorpo policlonal de coelho |
| Reagentes | |||
| Ensaio de proteína Bio-Rad | 500-0006 | Reagente comercial de ensaio de proteína I para medição da concentração de proteína (compatível com 0,1% SDS) | |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Sólido, Roscado 9,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Buzina disruptora para sonicação |
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip para tampão de sonicação |
| A1 | - | 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desoxicolato; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; reagente completo de inibidor de protease livre de EDTA | |
| Coquetel completo de inibidor de protease livre de EDTA | Roche | 11-873-580-001 | Reagente completo de inibidor de protease livre de EDTA para tampão A1 |
| Coomassie azul brilhante R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | Solução azul de Coomassie para análise de espectrometria de massa |
| Solução de cristal violeta (2,3% violeta de cristal, 0,1% oxilato de amônio, 20% de etanol) | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | Para coloração de colônias |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | Para coloração nuclear |
| DMEM: F12 Médio | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 Soro |
| Fetal Bovino Médio, certificado, calor inactivado, de origem norte-americana | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (soro fetal bovino) |
| DMEM com elevado teor de glucose (Dulbecco») s Águia modificada' s meio) | Life Technologies / BioWhittaker | 12-604 | DMEM com alto teor de glicose |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies / Invitrogen | L3000 | Reagente de transfecção I para transfecção química |
| Lipofectamin 3000, solução P3000 | Life Technologies / Invitrogen | L3000 | Reagente de transfecção II para transfecção química |
| Metanol | Fisher | A412-4 | Fixação reagant |
| Leite em pó desnatado (substituição aprovada para leite em pó cravo) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lote# 90629) | Leite desnatado sem gordura |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Meio sérico reduzido |
| p-fenilenodiamina | SIGMA-SLDRICH | P6001 | Para montagem do meio |
| Penicilina, Estreptomicina; Líquido | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicilina-estreptomicina |
| Poli-L-Lisina | SOLUÇÃO SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poli-L-Lisina, 0,1% p/v, em água |
| Polietilenoimina [PEI]; 1,0 mg/ml | Policiências | 23966; 2 | Reagentes de transfecção III para transfecção química |
| Proteína A sepharose CL-4B beads | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | Protein A sepharose CL-4B beads para ensaios de ubiquitilação in vivo usando pQCXIP-EYFP-CENP-A |
| Restaurar Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot Stripping Buffer I |
| Tripsina de grau de sequenciamento | Promega | V5111 | Para análise de espectrometria de massa |
| SuperSignal West Femto Substrato de Sensibilidade Máxima | Thermo | 34095 | Substrato quimioluminescente aprimorado ultrassensível (ECL) |
| Água Destilada UltraPure | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Água estéril de grau de cultura |
| de tecidos Tampão de Decapagem Western Blot II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoetanol) | - | - | Western Blot Stripping Buffer II |
| strong>Anticorpos secundários | |||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade) |
| Softwares | |||
| Aquisição FV31S-SW software | Olympus-Sofware | C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) | |
| Análise FV31S-DT software | Olympus | - | Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519) |
| cellSens Dimension software Ver. 1. 18 | Olympus-Sofware | C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/) | |
| Software de Análise Image Studio Ver 4.0 | LI-COR Biosciences-Software | D | |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | - | Gerador de imagens de quimioluminescência para detecção de immunoblot |
| Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx | LI-COR Biosciences-Sistema | de imagem infravermelha para detecção de immunoblot | |
| OpenCFU saftware | - | Para contagem de colônias (http://opencfu.sourceforge.net/) | |
| Openlab versão 5.5.2. Software de imagem científica | Improvision/PerkinElmer-Software | A | |
| Software ProteinPilot versão 4.5 | AB SCIEX-Software | F para análise de espectrometria de massa | |
| Quantidade Um Software de análise 1-D | Bio-Rad-Software | E | |
| TripleTOF 5600+ Sistema | AB SCIEX-Instrumento | de | espectrometria |
| de massaVolocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Volocity Acquisition) | PerkinElmer-Software | B1 | |
| Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Volocity Quantification) | PerkinElmer-Software | B2 |
Referências
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell<....
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Reimpressões e permissões
