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Artigo de método

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

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DOI:

10.3791/61138

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10 de junho de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.

Resumo

Estudar a estrutura e a dinâmica das cinetochores e centrosmers é importante na compreensão da instabilidade cromossômica (CIN) e da progressão do câncer. Como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e participar da segregação precisa do cromossomo é uma questão fundamental. O CENP-A é proposto para ser o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade do centromere, e a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular.

Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a ubiquização em uma lise diferente é induzida por causa da marcação do EYFP na proteína mutante CENP-A K124R. A ubiquização de Lysine 306 (K306) no EYFP-CENP-A K124R foi identificada com sucesso, o que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. Uma ressalva é discutida no uso de GFP/EYFP ou na marcação de proteína de alto peso molecular como ferramenta para analisar a função de uma proteína. Também é discutido o limite técnico atual para a detecção de bandas ubiquadas, identificação de ubiquização específica do local e visualização de ubiquização em células vivas ou uma única célula específica durante todo o ciclo celular.

O método de análise de espectrometria de massa aqui apresentado pode ser aplicado à proteína CENP-A humana com diferentes tags e outras proteínas centromere-kinetochore. Esses métodos combinatórios que consistem em vários ensaios/análises poderiam ser recomendados para pesquisadores interessados em identificar funções funcionais de ubiquização.

Introdução

Na maioria dos eucariotes, os microtúbulos de fuso devem ser anexados a uma única região de cada cromossomo, denominado centômero. O kinetochore é um complexo de proteínas que estão localizadas no centromere. Estudar o tempo dos movimentos da proteína centrómera e da kinetochore e a estrutura de cinetochores e centromers é importante para a compreensão da instabilidade cromossomo (CIN) e da progressão do câncer. As principais questões são como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e como participam da segregação precisa do cromossomo. Na maioria das espécies, a presença de um nucleossomo especial contendo uma proteína específica semelhante a histona chamada CENP-A define a identidade do centromere. Portanto, propõe-se que o CENP-A seja o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade centromere. É importante elucidar o mecanismo de como o CENP-A define a identidade centrômera em humanos.

A proteína de reconhecimento de junção Holliday (HJURP) é o acompanhante específico do CENP-A que deposita CENP-A em nucleosósmos centréricos1,,2,,3. Já noticiamos anteriormente que o CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase é necessário para ubiquização CENP-A na lysina 124 (K124) e na localização do centromere4. Além disso, nossos resultados mostraram que o recrutamento centralizado do CENP-A recém-sintetizado requer ubiquização pré-existente CENP-A5. Assim, foi fornecido um modelo sugerindo que a ubiquização CENP-A é herdada por meio da dimerização entre as divisões celulares.

Em contraste com nossos achados e os de Yu et al., os resultados negativos relativos ao CENP-A e sua localização centromérica foram publicados recentemente6. O artigo alegou que as modificações do CENP-A na lysina 124 (K124) são dispensáveis para o estabelecimento, manutenção e função de longo prazo dos centrosmers humanos, com base em seus resultados negativos mostrando que a mutação do K124R não afetou a localização do centromere CENP-A nem a viabilidadecelular 6. No entanto, há espaço suficiente para debate em seus resultados e conclusões, e já descrevemos que problema poderia haver em sua publicação anterior7. Atenção deve ser dada que eles fundiram proteínas com CENP-A, que têm pesos moleculares muito maiores do que o tamanho do CENP-A endógeno: por exemplo, fundiram ~30 kDa proteína fluorescente amarela aumentada (EYFP) para ~16 kDa CENP-A e analisaram a proteína de fusão EYFP-CENP-A K124R em seu sistema de eliminação RPE-1 CENP-A-/F. A ubiquitina K124 não deverá se ligar diretamente ao HJURP com base nas previsões estruturais4, no entanto, prevê-se que a adição de mono-ubiquitina tenha um impacto na conformação proteica do CENP-A. A proteína da conformação CENP-A pode ser alterada pela presença de uma grande proteína de fusão, e essa mudança conformacional pode mascarar as alterações estruturais causadas pela perda da ubiquidade. Sugerimos que a fusão de proteínas de grande porte induz a ubiquização em uma lise diferente do K124 no mutante EYFP-CENP-A K124R e esta ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R. Evidências de que a ubiquização ocorre em diferentes lisesinas na proteína mutante CENP-A K124R com uma grande proteína de etiqueta (EYFP) foi relatada em nossa publicação anterior8. Verificou-se que a marcação EYFP induz a ubiquização de outro local de lise de EYFP-CENP-A K124R e que o mutante EYFP-CENP-A K124R se liga ao HJURP. Como resultado, essa ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R, e tanto os mutantes EYFP-CENP-A WT e K124R mostraram localização de centromere (usamos e comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutantes, juntamente com pBabe-EFPYFP control.). Os resultados demonstraram que os mutantes CENP-A K124R marcados por bandeiras são letais, mas podem ser resgatados por uma fusão de monoubiquidade, sugerindo que a ubiquização CENP-A é indispensável à viabilidade celular.

Nos últimos anos, muitos estudos desenvolveram diferentes ensaios para identificar modificações pós-transacionais (PTMs) da proteína CENP-A e outras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo quanto in vitro9,,10,,11. Análogos aos PTMs de proteínas histonas que são um dos principais mecanismos que regulam a função da cromatina, PTMs de componentes centromericos de cromatina também estão envolvidos em um mecanismo essencial para regular a estrutura geral e a função dos centromers. A maioria dos sítios CENP-A PTM são específicos para nucleosómos contendo CENP-A, embora alguns deles sejam conservados em histona H3, sugerindo que a modificação desses resíduos contribuem para a função específica do centromere. Os PTMs de CENP-A, incluindo fosforilação, acetilação, metilação e ubiquização foram relatados anteriormente9, sugerindo que o CENP-A é submetido a uma variedade de PTMs e suas matrizes combinatórias em seu domínio amino terminus e C-terminus histone-fold. A importância das modificações do CENP-A em múltiplas funções foi revelada por muitos grupos, incluindo o nosso. Essas funções envolvem deposição do CENP-A em centrosmers, estabilidade proteica e recrutamento da CCAN (rede constitutiva associada ao centromere)9. No entanto, estudos limitados e achados de PTMs CENP-A são pré-formados onde comparações são feitas com uma das histonas canônicas que regulam direta ou indiretamente sua função. Relatórios técnicos com foco na metodologia de identificação desses PTMs CENP-A também são limitados.

Como a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere12, herdada por dimerização entre a divisãocelular 5, e indispensável à viabilidade celular8,o método para identificar a ubiquização CENP-A seria essencial no futuro para estudar a atividade funcional, o posicionamento e a estrutura do centromere. Portanto, aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R8. Protocolos de outros ensaios e análises de controle (análise de imunofluorescência, ensaio de crescimento de colônias e ensaio de onipresençação in vivo) também são apresentados para discutir o resultado da análise de espectrometria de massa corretamente.

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Protocolo

1. Cultura celular e transfecção retrovírus de construções pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: O EYFP-CENP-A é expresso a partir de pBabe-EYFP-CENP-A em nível de proteína semelhante ao CENP-A endógeno. A proteína CENP-A celular total é substituída por este EYFP-CENP-A após a interrupção do CENP-A-/F aleelo por Cre recombinase como em células RPE-1 CENP-A-/-6.

  1. Preparação do supernatante contendo retrovírus usando células de embalagem 293T.
    1. Dia 0: Espalhe células de embalagem 293T na placa de cultura de 6 poços (1,0 x 106 células/bem). Células de cultura em DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 24 h.
      NOTA: Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular para usar na semeadura.
    2. Dia 1: Prepare a reação de transfecção por volta das 23h após a propagação (24h ponto é 0h ponto da transfecção). A expressão transfecte plasmid de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) e pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (ver Tabela 1).
    3. Escolha uma combinação de plasmídeos auxiliares/embalagens listados na Tabela 2 e adicione-os aos tubos contendo um dos plasmídeos listados acima. Existem principalmente essas 3 combinações para plasmídeos auxiliares/embalagens(Tabela 2). Qualquer combinação funcionou nesses experimentos e mostrou eficiência de transfecção semelhante.
    4. Prepare 50 μL de meio de soro reduzido e misture 2,0 μg de cada pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161), e pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (ver Tabela 1) adicionando uma combinação de plasmídeos auxiliares/embalagens listados na Tabela 2 (veja abaixo). Incubar esta mistura em temperatura ambiente por 5 minutos. Esta mistura é a solução A.
    5. Prepare outros 50 μL de meio soro reduzido e misture 1,5 μL de reagentes de transfecção I e II, respectivamente(Tabela de Materiais). Incubar esta mistura em temperatura ambiente por 5 minutos. Esta mistura é a solução B.
      NOTA: Opcionalmente, adicione apenas 6,0 μL de reagente de transfecção III (polietileneimina [PEI]; 1,0 mg/mL) na solução B ou adicione 6,0 μL de reagente de transfecção III, além dos reagentes de transfecção I e II na solução B(Tabela de Materiais).
    6. Misture as soluções A e B juntas, e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
    7. Depois de lavar as células cultivadas uma vez com PBS, adicione a mistura de soluções A e B (ou seja, complexo DNA-lipídicos) diretamente a cada poço da placa de cultura de 6 poços que tem 500 μL de meio de soro reduzido. A concentração final do plasmídeo é de 3,3 μg/mL.
    8. Depois de incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 4,5 h, mude o DMEM médio para a alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Coloque 2 mL/bem de cultura após a mudança média na placa de cultura de 6 poços.
    9. Cultura as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 48 h após a transfecção. Realize a infecção por retrovírus no dia 3 usando o supernatante contendo retrovírus.
  2. Infecção por retrovírus das células-alvo CENP-A-/F RPE-1.
    1. Dia 2: Um dia antes da infecção, espalhe células-alvo CENP-A-/F RPE-1 para transfetar no poço de cultura de 6 poços (2,25 x 105 células/bem). Células de cultura em DMEM: F12 médio (Tabela de Materiais) com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Espalhe células para ensaios de crescimento de colônias, imunofluorescência e análise de manchas ocidentais como controle. Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular para usar na semeadura.
    2. Dia 3 (dia da infecção do vírus): Às 48 horas após a transfecção de células de embalagem 293T, recolher o supernasal contendo vírus e filtrar através de filtro de 0,45 μm (não use um filtro de 0,2 μm que irá tesourar o envelope do vírus). Recomenda-se o uso de filtros polietroésulfone (PES).
    3. Infectar células CENP-A-/F RPE-1 com o vírus. Para um poço da placa de cultura de 6 poços, adicione 1 mL de mídia fresca, supernanato de vírus de 1 mL e polibrene a uma concentração final de 8 μg/mL. Incubar células CENP-A-/F RPE-1 a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 4 dias até o dia 7 após a transfecção.
      NOTA: O período de incubação do crescimento celular CENP-A-/F RPE-1 deve ser determinado empiricamente, seguindo as análises para obter resultados ideais.

2. Análise de imunofluorescência de células contendo pBabe-EYFP-CENP-A

  1. Dia 7: 4 dias após a infecção por retrovírus das construções pBabe-EYFP-CENP-A, remova o meio de cultura por aspiração. Enxágüe células uma vez com TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl). Aplique TBS ao lado dos poços de cultura para evitar perturbar a superfície das células.
    NOTA: O ponto de tempo ideal para fixação celular deve ser determinado empiricamente. Sinais de imunofluorescência tanto do EYFP-CENP-A WT quanto do K124R são detectáveis no centromer pelo menos 4 dias após a infecção por retrovírus das construções pBabe-EYFP-CENP-A mesmo sem infecção por Cre (dados não mostrados, Figura 1C-E para os dados com infecção por Cre).
  2. Realize a fixação celular de metanol e a coloração da imunofluorescência, conforme descrito anteriormente13.
  3. Como anticorpos primários usam um anticorpo anti-GFP (diluição de 1:1.000) e um anticorpo anti-CENP-B (razão de diluição de 1:200) para um marcador de localização centromere em TBS contendo 4% de soro de cabra (ver Tabela de Materiais para anticorpos utilizados).
  4. Remova o excesso de montagem do meio com uma toalha de papel e sele as bordas da tampa com esmalte na última etapa.
  5. Consulte o método anteriormente descrito13 para observação de imagem de imunofluorescência, aquisição, quantificação e análise de sinais remanescentes de EYFP-CENP-A no centromere.
  6. Realizar aquisição de imagens, processamento incluindo desconvolução, quantificação e análise utilizando os softwares A ou Softwares B1 e B2 (ver Tabela de Materiais). Opcionalmente, use softwares C1-C3 (ver Tabela de Materiais) para um microscópio de varredura a laser confocal.
    NOTA: Consulte 2.6.1 em arquivos de codificação suplementar para todos os comandos usados no Software A. Consulte 2.6.2 em arquivos de codificação suplementar para todos os comandos usados nos softwares B1 e B2.

3. Ensaios de crescimento da colônia usando pBabe-EYFP-CENP-A após infecção pelo vírus retro-Cre

NOTA: A razão para a realização deste ensaio é comparar a viabilidade celular entre o mutante EYFP-CENP-A WT e K124R após a interrupção do CENP-A-/F alelo por Cre recombinase (após a substituição da proteína CENP-A celular total).

  1. Transfecção retrovírus de construções pBabe-EYFP-CENP-A.
    1. Realize a transfecção retrovírus das células CENP-A-/F RPE-1, conforme descrito na seção 1. Células de cultura em DMEM: F12 médio com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina por 72 h após a infecção pelo vírus.
    2. Três dias após a infecção por retrovírus das construções pBabe-EYFP-CENP-A (no dia 6), adicione blasticidin S (10 μg/mL) em poços contendo células transfeinadas para serem usados para ensaios de crescimento e controle de colônias. As células são cultivadas pelo menos 14 dias após a infecção pelo vírus na presença de blasticidin S. Mude o meio contendo blasticidin S a cada 5 dias.
      NOTA: Se as células atingirem cerca de 80% de confluência antes de semear para o ensaio da colônia (3.2.7. e 3.2.8), passar as células em proporção 1:2 e 1:5 por trippsinização e revestimento em uma placa de cultura de 6 poços.
    3. Coletar células para a mancha ocidental no dia 7 para confirmar a expressão proteica das construções pBabe-EYFP-CENP-A sem infecção por Cre. Realize a análise da mancha ocidental, conforme descrito na seção 4. Os resultados são mostrados na Figura 1B (faixas 1-4).
    4. Para o ensaio de crescimento da colônia com a infecção pelo vírus Cre, mantenha as células crescendo por 14 dias após a infecção pelo vírus na presença de blasticidin S (ou seja, cultivar células em blasticidin S contendo meio até o dia 17 para os resultados aqui apresentados).
  2. Infecção do vírus Retro-Cre de pBabe-puro-Cre
    NOTA: O dia 0 na etapa 3.2.1 corresponde ao dia 13 da seção 3.1.
    1. Dia 0 ao Dia 3: Realize a transfecção retrovírus das células CENP-A-/F RPE-1 usando pBabe-puro-Cre (B3027) como plasmídeo de expressão (ver seção 1 para obter detalhes). Certifique-se de que blasticidin S (10 μg/mL) seja adicionado no meio de cultura.
    2. Dia 4: Células de trypsinize para desprender-lo da placa. Placa 500 ou 5.000 células em triplicado na placa de cultura de 6 poços. Células de cultura em DMEM: meio F12 com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
    3. Dia 5: Adicione blasticidin S (10 μg/mL) ao meio de cultura. Para 5.000 ou 500 células de revestimento, selecionar células com blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 dias (até o dia 14 em [3.2.7]) ou 3-28 dias (até o dia 18 em [3.2.8]) após infecção por vírus de construções (construções pBabe-EYFP-CENP-A).
      NOTA: Neste ensaio de crescimento da colônia, a transfecção do pBabe-puro-Cre é adicionada juntamente com a transfecção de pBabe-EYFP-CENP-A. A transfecção do pBabe-EYFP-CENP-A é realizada em 3.1. A transfecção do pBabe-puro-Cre é realizada em 3.2.1.
    4. Dia 10 (7 dias após a infecção pelo vírus retro-Cre): Coletar células para análise de manchas ocidentais para confirmar o esgotamento proteico do CENP-A endógeno após infecção pelo vírus retro-Cre e/ou expressão proteica de construções pBabe-EYFP-CENP-A no mesmo dia 10.
    5. Faça manchas ocidentais como descrito na seção 4 no mesmo dia 10. Os resultados são mostrados na Figura 1B (faixas 5-7).
    6. Realize a análise de imunofluorescência (seção 2 acima) para confirmar que tanto o EYFP-CENP-A WT quanto o K124R localizados no centromere 7 dias após a inativação do alelo CENP-A endógeno restante. Os resultados são mostrados na Figura 1C-1E.
    7. Dia 14: Realize o ensaio de crescimento da colônia com a placa semeada com 5.000 células. Fixar células por 10 min em metanol e manchar por 10 minutos em uma solução violeta cristalina (2,3% violeta cristalina, 0,1% de oxalato de amônio, 20% etanol (ver Figura 2B). Conte o número de colônias usando o software OpenCFU (ver Figura 2C).
    8. Dia 18: Use a placa semeada com 500 células. Células de correção e coloração descritas na etapa 3.2.7 (ver Figura 2B). Conte o número de colônias (ver Figura 2C).

4. Análise de manchas ocidentais usando pBabe-EYFP-CENP-A

NOTA: Consulte o métodoanteriormente descrito 13 para análise de manchas ocidentais utilizando anticorpos indicados na Figura 1B e Figura 2A e Tabela de Materiais para proteínas EYFP-CENP-A.

  1. Isolar proteínas ao lise as células cultivadas com diferentes infecções por vírus. Em seguida, use 20 μg de proteína em um poço de gel de PÁGINA SDS. Transfira as proteínas para uma membrana PVDF como descrito anteriormente13.
  2. Lave a membrana 3x após incubações com anticorpos primários secundários. Detecte e analise as bandas proteicas na membrana com o sistema de imagem infravermelha e/ou o imager de chemiluminescence para detecção de imunoblot. Estes resultados são mostrados na Figura 1B e Figura 2A.
    1. Para que o sistema de imagem infravermelha detecte e analise as bandas de proteína, consulte o passo 4.2.1 em arquivos de codificação suplementar.
    2. Use o imager de chemiluminescence para detectar e analisar as bandas de proteína, ver o passo 4.2.2 em arquivos de codificação suplementar. Para este sistema, use um substrato de chemiluminescente aprimorado ultrasensível (ECL)(Tabela de Materiais).
    3. Opcionalmente, use tampão de descascamento de manchas ocidentais para retirar anticorpos pré-incubados da membrana PVDF e reblotá-lo com diferentes anticorpos para a próxima volta da análise ocidental. Determine empiricamente o tempo e a temperatura otimizados de incubação a serem usados.

5. Ensaios de cultura celular, transfecção e on vivo ubiquização utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A

NOTA: O nível proteico de EYFP-CENP-A expresso do pQCXIP-vetor é ~ 10x maior do que o nível de proteína CENP-A endógeno. O uso deste vetor facilita a imunoprecipitação de uma maior quantidade de proteínas EYFP-CENP-A, observação das bandas de ubiquização do EYFP-CENP-A e identificação da ubiquização da proteína CENP-A marcada pela EYFP (EYFP-CENP-A) através da análise de espectrometria de massa.

  1. Transfecção para ensaios de ubiquização in vivo usando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Sementes 36,2 x 105 células CENP-A-/F RPE-1 em um prato de cultura tecidual de 10 cm. Células de cultura em DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
      NOTA: Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular a ser usada na semeadura. Prepare pelo menos 2 pratos para uma amostra de imunoprecipitação (IP) para obter um mínimo de 1 mg de proteína total.
    2. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 18 h.
    3. Às 17 horas após a semeadura, prepare os reagentes de transfecção.
    4. Faça a solução A misturando 6,7 μg plasmid de cada pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(Tabela 1)em 335 μL de soro reduzido, médio e incubar à temperatura ambiente por 5 min. Adicione 6,7 μg plasmid de pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) a todas as amostras.
      NOTA: Todos os vetores estão listados na Tabela 1.
    5. Faça a solução B misturando 10,1 μL de reagentes de transfecção I e II, respectivamente em 335 μL de meio soro reduzido, e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
      NOTA: Um passo opcional é adicionar apenas 40,2 μL reagente de transfecção III (polietileneimina [PEI]; 1,0 mg/mL) na solução B ou adicionar 40,2 μL reagente de transfecção III, além dos reagentes de transfecção I e II na solução B(Tabela de Materiais).
    6. Misture as soluções A e B juntas, e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
    7. Depois de lavar as células cultivadas uma vez com PBS, adicione a mistura de soluções A e B (ou seja, complexo DNA-lipídicos) diretamente a cada um dos 10 cm individuais de cultura tecidual que tem 3,35 mL μL meio de soro reduzido.
      NOTA: A concentração final é de 1,67 μg/mL de plasmídeo.
    8. Incubar as células a 37 °C incubadora com 5% de CO2 para 4,5 h. Após 4,5 h, mude o DMEM médio para alto glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina.
    9. Cultura as células a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h após a transfecção. Coletar células para a preparação de lises celulares.
  2. Preparação de proteínaS A contas ligadas com anticorpo anti-GFP.
    1. Tome 25 μL (50% v/v) de contas de proteína A para uma reação de imunoprecipitação (IP). Lave com tampão A1(Tabela de Materiais) pelo menos 3x para remover o EtOH, e fazer solução de 50% com tampão A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desoxicolato; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; inibidor completo de protease livre de EDTA).
    2. Adicione 2,0 μL de anticorpo anti-GFP (Anticorpo nº 76: anticorpo caseiro) às contas preparadas acima e adicione 10x de volume de tampão A1 comparando com o volume líquido de contas.
    3. Realize a rotação de ponta a ponta a 4 °C para 4-18 h. O período de tempo ideal para rotação de ponta a ponta deve ser determinado empiricamente com base na eficiência da imunoprecipitação.
    4. Centrifugar as contas a 100 x g por 1 min e remover o supernatante desvinculado. Adicione o buffer A1 para refazer uma solução de 50% (v/v) das contas. Use 25 μL (50% v/v) desta solução para uma reação de IP.
  3. Imunoprecipitação (IP) utilizando proteínaS A contas de sepharose ligadas com anticorpo anti-GFP.
    1. Células de lise obtidas na etapa 5.1.9 no buffer A1 por sônica e processo de congelamento.
    2. Medir concentrações proteicas e normalizar quantidades de proteínas entre diferentes amostras de IP. Remova 5% da amostra de cada tubo para funcionar como amostra de entrada de 5% em SDS-PAGE.
      NOTA: A amostra de entrada de 5% pode ser congelada em nitrogênio líquido e estocada a -80 °C, se não for carregada dentro de um dia.
    3. Misture o resto de 95% de lise com 25 μL (50% v/v) de proteína A contas ligadas ao anticorpo anti-GFP que foi preparado na etapa 5.2. Realize a rotação de ponta a ponta a 4 °C para 4-18 h.
      NOTA: O período de tempo ideal para rotação de ponta a ponta deve ser determinado empiricamente.
    4. Proteína centrífuga Uma contas com a proteína ligada a ela (ou seja, imunoprecipitatos) com 100 x g por 1 min, e remover o sobrenante. Lave os imunoprecipitatos com tampão A1 por centrifugação a 100 x g por 1 min. Realize esta etapa 4x.
    5. Misture o buffer de carga 5% e o restante de 95% de imunoprecipitatos com 2x e 4x SDS-PAGE buffer de carregamento14, respectivamente. Ferva essas duas amostras por 5 minutos e depois carregue-as em um gel de poliacrilamida SDS desnaturação de 10,0% para eletroforese em diferentes pistas. Use gel SDS-PAGE maior (por exemplo, 17 cm x 15 cm) para eletroforese. Se as amostras forem executadas em gel menor, pode não ser possível observar faixas de ubiquização claras/afiadas.
    6. Realize a análise da mancha ocidental conforme descrito na seção 4 utilizando os anticorpos indicados no relatório anterior8. O resultado é mostrado na Figura 2A.
    7. Use tampão de despojo de manchas ocidentais para retirar os anticorpos pré-incubados da membrana PVDF e reblotá-lo com diferentes anticorpos para a próxima rodada de análise de manchas ocidentais.

6. Espectrometria de massa para identificar o local de ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R

  1. Transfecção para análise de espectrometria de massa usando pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Sementes CENP-A-/F RPE-1 células em um prato de cultura tecidual de 10 cm. Verifique se a densidade celular é de 36,2 x 105 células por prato. Células de cultura em DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina. Prepare pelo menos 20 pratos para uma amostra de imunoprecipitação (IP), para obter pelo menos 10 mg de proteína total (ver 5,3).
      NOTA: Para obter resultados ideais, determine empiricamente a densidade celular para usar na semeadura.
    2. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 para 18 h. Prepare os reagentes de transfecção ~ 23 h após a propagação (24h ponto é 0 h ponto da transfecção).
    3. Às 17 horas após a semeadura, prepare os reagentes de transfecção e as células transfeiturais como (4.1.3). As células transfeinadas têm pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) e pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 48 h após a transfecção. Coletar células para lises celulares.
    5. As células de lise no buffer A1 e realizam imunoprecipitação como (5.2) e (5.3). Executar esses dois de imunoprecipitação lysates como seguinte (6.1.6) e (6.1.7).
      NOTA: Em (6.1.6), execute a amostra em géis tris-glicina padrão. Em (6.1.7), execute a amostra nos géis proteicos Bis-Tris disponíveis comercialmente 4%-12%. Veja também Discussão.
    6. Mantenha uma amostra para 10% do total de imunoprecipitantes para confirmar a ubiquização EYFP-CENP-A e determinar precisamente a posição do EYFP-CENP-Aubiquitinado, conforme descrito na seção 5. Execute esta amostra em géis tris-glicina padrão. SDS-PAGE e mancha ocidental foram realizadas como (5.3).
    7. Mantenha outra amostra para 90% do total de imunoprecipitantes para análise de espectrometria de massa. Execute esta amostra dentro de dois poços dos géis proteicos Bis-Tris disponíveis comercialmente. Execute a coloração azul Coomassie usando a solução azul Coomassie. Extirpa e corte a região do gel de 50-70 kDa (região putativa mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R). Use esta região de gel para análise de espectrometria de massa.
  2. Análise de espectrometria de massa usando digestão em gel.
    1. Pique cada fatia de gel de interesse em pequenos pedaços (1 mm2) e coloque-a em 0,5 mL de tubos de baixa ligação proteica.
    2. Lave com acetonitrila de 100 μL 50% (v/v) em 25 mM NH4HCO3, vórtice 10-15 min, gire para baixo, descarte o supernasce, repita 3x.
    3. Concentre a amostra usando concentrador de vácuo de bancada por 30 minutos para secar as peças de gel.
    4. Adicione 10 μL de 10 ng/μL de trippsina de grau de sequenciamento e deixe as peças de gel se reidratar por 5 minutos.
    5. Adicione 25 mM NH4HCO3 apenas o suficiente para cobrir as peças de gel, digerir a 37 °C durante a noite.
    6. Transfira o supernatante digerido em um tubo limpo de 0,65 mL siliconizado. Adicionar 50% (v/v) acetonitrila/5% (v/v) ácido fórmico (30 μL ou suficiente para cobrir), vórtice 10 min, girar e transferir para o mesmo tubo de extração. Repita 3x.
    7. Adicione 10 μL de acetonitrila às peças de gel, vórtice 5 min e gire para baixo. Transfira o supernatante para o mesmo tubo.
    8. Concentre as amostras usando concentrador de vácuo benchtop a 2 μL, adicione 8 μL 3% (v/v) acetonitrilo /2% (v/v) ácido fórmico à amostra, vórtice por 15 minutos e gire a 16.000 x g por 30 minutos. As amostras estão prontas para análise de espectrometria de massa.
    9. Realizar a aquisição de dados de MS com a LC-MS/MS utilizando um sistema de cromatografia líquida(Tabela de Materiais)juntamente com um instrumento de espectrometria de massa(Tabela de Materiais).
    10. Injete 8 μL de amostra reconstituída em uma coluna de cromatografia líquida de fase inversa (RPLC).
    11. Separe os peptídeos com um gradiente de 2-80% de solvente B em 60 minutos. Certifique-se de que o gradiente consiste em um percentual crescente de solvente B de 2% para 22% em 40 min, 22% a 35% solvente B em 12 min, depois subindo para 80% solvente B em 4 min, e finalmente mantendo em 80% solvente B para os últimos 4 min. Defina a taxa de fluxo constante em 300 nL/min.
      NOTA: Solvente A contém ácido fórmico de 0,1% e 2% acetonitrilo, solvente B contém 0,1% de ácido fórmico e 98% acetonitrilo. Todas as concentrações são mostradas como volume/volume.
    12. Colete dados de espectrometria em massa usando o modo de aquisição dependente de dados. Brevemente, colete espectros MS em 350-1500 m/z por 250 ms. Selecione os 50 precursores intensos do Top 50 com carga 2-5 para maior fragmentação. Colete espectros MS/MS em 100-2000 m/z por 100 ms, Exclua íons precursores da reseleção para 15 s.
    13. Para pesquisa de banco de dados, abra o software comercial (ver Tabela de Materiais) para analisar dados de espectrometria de massa na área de trabalho.
    14. Para fazer uma nova pesquisa, clique no botão "LC" no menu superior. Em seguida, clique no botão "Adicionar" para carregar os arquivos de dados brutos originais do MS.
    15. Selecione "Human Protein ID" no "Método Paragon" como o método de pesquisa de banco de dados. Pesquise os arquivos originais de dados brutos do MS no banco de dados UniProt Homo Sapiens (contendo 160.566 sequências, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Definir parâmetros de pesquisa como os seguintes: selecionar trippsina como enzima de digestão, permitir até 3 decotes faltantes, 4 modificações e 2-5 cargas por peptídeo. Defina erro de massa de até 20 ppm para a primeira pesquisa e 0,02 Da para íons fragmentados. Especifique limiares de taxa de descoberta falsa (FDR) para locais de proteína, peptídeo e modificação inferiores a 1%. Defina todos os outros parâmetros do software para valores padrão (consulte Figura 3 para análise de espectrometria de massa).
    17. Clique no botão "Salvar como" à direita do menu superior, selecione uma pasta para armazenar os resultados de pesquisa, digite o nome da pesquisa e clique no botão "Salvar".
    18. Clique no botão "Process" à direita do menu superior para iniciar a pesquisa. Após o término da pesquisa, os dados com o nome de pesquisa inserido serão armazenados automaticamente na pasta selecionada. Os dados podem ser facilmente abertos pelo Software F.
    19. Para obter espectros MS/MS de qualquer peptídeo específico, clique duas vezes nos resultados de pesquisa para abri-lo pelo Software F. Primeiro, clique na proteína na lista de proteínas na parte superior do menu e clique no peptídeo no meio do menu. O MS/MS deste peptídeo é mostrado na parte inferior do menu.
    20. Para exportar e salvar os espectros MS/MS, clique com o botão direito do mouse no espectro MS/MS na parte inferior do menu, selecione copiar e, em seguida, cole-se a um arquivo adequado, como PPT ou doc.

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Resultados

O mutante EYFP-CENP-A K124 mostra ubiquização, interação com HJURP, e sem defeitos na localização do centromere nem letalidade celular. Aqui o sistema relatado por Fachinetti et al. (2017)6 foi restituído: em células humanas diploides (RPE-1) transportando uma interrompida e uma alelo CENP-A (CENP-A-/F),EYFP-CENP-A foi expressa do vetor retrovírus pBabe-EYFP. Neste sistema, a expressão do CENP-A endógeno do CENP-A-/F alelo poderia s...

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Discussão

Aqui descrevemos métodos de análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R8. Em nossos resultados, identificamos com sucesso a ubiquização na lysina 306 (K306) em EYFP-CENP-A K124R, que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. A análise de espectrometria de massa descrita aqui é um método de imita...

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Divulgações

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Chao-Jun Li no Centro de Pesquisa Animal Modelo, Universidade de Nanjing pela análise de espectrometria em massa. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e pesquisadores atuais do Centro de Pesquisa Animal Modelo, Nanjing University e Greehey Children's Cancer Research Institute por sua discussão útil, orientação experimental e reagentes. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler por seus generosos presentes de reagentes. Y.N. foi apoiado pelo Fundo de Construção da Província de Jiangsu ''Double-First-Class'', Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Província de Jiangsu 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) e National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudo foi parcialmente apoiado pela subvenção nci R21 CA205659.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equpiments/Tools
0,5 ml tubos de baixa ligação de proteínaEppendorf022431064Para análise de espectrometria de massa
Placa de cultura de células de 10 cmBIOFIL/JET, China700224 Placa decultura de tecidos de 10 cm (Yohei lab, PN63)
Cluster de cultura de células de 6 poçosFisher/Corning Incorporated07-200-83Cultura de 6 poços placa
CentriVapLABCONCO-Concentradoravácuo de bancada para peptídeos secos a vácuo para análise de espectrometria de massa
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μ mEksigent Technologies805-00120Coluna de cromatografia líquida (RPLC) para análise de espectrometria de massa
HCX PL APO 100x lente de imersão em óleoLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Lente de imersão em óleo
HCX PL APO 63x lente de imersão em óleoLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Lente de imersão em óleo
Immobilon-FL PVDF Membrana de transferênciaEMD MilliporeIPVH00010Para western blot
Leica DM IRE2 microscópio de fluorescência motorizadoMicroscópiodefluorescência motorizado
Leica EL6000 fonte de luz compacta Leicade luz externa para excitação fluorescente
Micro Vidro de cobertura (22 mm x 22 mm)Surgipath105Vidro de cobertura (22 mm x 22 mm)
Modelo V16-2 aparelho de eletroforese em gel de poliacrilamidaApogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010Aparelho de eletroforese em gel I para aplicar um gel SDS-PAGE maior
nanoLC.2DEksigentTechnologies-sistema decromatografia líquida para análise de espectrometria de massa
NuPAGE 4%-12% Géis de proteína Bis-TrisThermo FisherNP0335BOXOs géis de proteína Bis-Tris 4%-12% disponíveis comercialmente para análise
de espectrometria de massaMicroscópio confocal de varredura a laser Olympus FLUOVIEW FV3000Microscópio de varredura a laser confocal Olympus-Confocal (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Câmera CCD DegitalHamamatsuC10600-10BCâmera CCD
PAP PenBinding SiteAD100.1Para uma barreira repelente de água em coloração imunofluorescente
TECIDO PLACAS DE CULTURA 10CMVWR25382-166Placa de cultura de tecidos de 10 cm
Eletroforese vertical para execução de gel (tamanho grande)Junyi, ChinaJY-SCZ6+Aparelho de eletroforese em gel II para aplicar gel SDS-PAGE maior (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, FrostedVWR International48312-013Micro lâminas
Anticorpos primários
Anticorpo anti-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Anticorpo monoclonal de camundongo
Anticorpo anti-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PAnticorpo monoclonal de camundongo
anti-GAPDHABCAMab37168Anticorpo policlonal de coelho
anti-GAPDHInvitrogenPA1987Anticorpo
policlonal de coelhoanti-GFP anticorpoANTI #76 (Anticorpo caseiro)Anticorpo policlonal de coelho
anti-HA (3F10)Roche11815016001Anticorpo monoclonal de rato
anti-HJURPProteintech Group15283– Anticorpopoliclonal de coelho
1-AP anti-ubiquitinaBethyl LaboratoriesA300-317A-1Anticorpo policlonal de coelho
Reagentes
Ensaio de proteína Bio-Rad500-0006Reagente comercial de ensaio de proteína I para medição da concentração de proteína (compatível com 0,1% SDS)
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, Sólido, Roscado 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.33995-325Buzina disruptora para sonicação
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.33996-185Microtip para tampão de sonicação
A1-20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desoxicolato; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; reagente completo de inibidor de protease livre de EDTA
Coquetel completo de inibidor de protease livre de EDTARoche11-873-580-001Reagente completo de inibidor de protease livre de EDTA para tampão A1
Coomassie azul brilhante R-250BBI Life SciencesCAS 6104-59-2Solução azul de Coomassie para análise de espectrometria de massa
Solução de cristal violeta (2,3% violeta de cristal, 0,1% oxilato de amônio, 20% de etanol)SigmaI-AldrichHT90132-1LPara coloração de colônias
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Para coloração nuclear
DMEM: F12 MédioATCC30-2006DMEM: F12 Soro
Fetal Bovino Médio, certificado, calor inactivado, de origem norte-americanaLife Technologies/Gibco10082FBS (soro fetal bovino)
DMEM com elevado teor de glucose (Dulbecco») s Águia modificada' s meio)Life Technologies / BioWhittaker12-604DMEM com alto teor de glicose
Lipofectamin 3000Life Technologies / InvitrogenL3000Reagente de transfecção I para transfecção química
Lipofectamin 3000, solução P3000Life Technologies / InvitrogenL3000Reagente de transfecção II para transfecção química
MetanolFisherA412-4Fixação reagant
Leite em pó desnatado (substituição aprovada para leite em pó cravo)Fisher ScientificNC9255871 (Reorder No. 190915; Lote# 90629)Leite desnatado sem gordura
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Meio sérico reduzido
p-fenilenodiaminaSIGMA-SLDRICHP6001Para montagem do meio
Penicilina, Estreptomicina; LíquidoFisher/Gibco15-140Penicilina-estreptomicina
Poli-L-LisinaSOLUÇÃO SIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-Lisina, 0,1% p/v, em água
Polietilenoimina [PEI]; 1,0 mg/mlPoliciências23966; 2Reagentes de transfecção III para transfecção química
Proteína A sepharose CL-4B beadsGE Healthcare/Amersham17-0963-03Protein A sepharose CL-4B beads para ensaios de ubiquitilação in vivo usando pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restaurar Western Blot Stripping BufferThermo ScientificPI21059Western Blot Stripping Buffer I
Tripsina de grau de sequenciamentoPromegaV5111Para análise de espectrometria de massa
SuperSignal West Femto Substrato de Sensibilidade MáximaThermo34095Substrato quimioluminescente aprimorado ultrassensível (ECL)
Água Destilada UltraPureLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Água estéril de grau de cultura
de tecidos Tampão de Decapagem Western Blot II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoetanol)--Western Blot Stripping Buffer II
strong>Anticorpos secundários
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11008anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (anticorpo secundário purificado por afinidade)
Softwares
Aquisição FV31S-SW softwareOlympus-SofwareC1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Análise FV31S-DT softwareOlympus-Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Software de Análise Image Studio Ver 4.0LI-COR Biosciences-SoftwareD
Molecular Imager Versadoc MP4000 SystemBio-Rad-Gerador de imagens de quimioluminescência para detecção de immunoblot
Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLxLI-COR Biosciences-Sistemade imagem infravermelha para detecção de immunoblot
OpenCFU saftware-Para contagem de colônias (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab versão 5.5.2. Software de imagem científicaImprovision/PerkinElmer-SoftwareA
Software ProteinPilot versão 4.5AB SCIEX-SoftwareF para análise de espectrometria de massa
Quantidade Um Software de análise 1-DBio-Rad-SoftwareE
TripleTOF 5600+ SistemaAB SCIEX-Instrumentodeespectrometria
de massaVolocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Volocity Acquisition)PerkinElmer-SoftwareB1
Volocity versão 6.3 Software de Análise de Imagem 3D (Volocity Quantification)PerkinElmer-SoftwareB2
Fonte <

Referências

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Identificação de UbiquitinaçãoProtocolo de ImunoprecipitaçãoAnálise por LC-MS/MSMétodo de Excisão de GelDigestão com TripsinaEsferas de Proteína AAnticorpo Anti-GFPIdentidade do Centromero
Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)
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