Fabricação de guias de ondas de modo zero para microscopia de molécula única de alta concentração

Resumo

Descrito aqui é um método de litografia de nanosfera para fabricação paralela de guias de onda de modo zero, que são matrizes de nanoaperaturas em uma microscopia de vidro revestida de metal para imagens de moléculas únicas em concentrações de nano-a-micromolar de fluoroforos. O método aproveita a automontagem de cristal coloidal para criar um modelo de guia de onda.

Resumo

Na enzimologia da fluorescência de molécula única, a fluorescência de fundo de substratos rotulados em solução muitas vezes limita a concentração de fluoróforos a faixas de pico a nanomolar, várias ordens de magnitude menos do que muitas concentrações fisiológicas de ligantes. Nanoestruturas ópticas chamadas de guias de onda de modo zero (ZMWs), que são de 100 a 200 nm de diâmetro, fabricadas em um fino metal condutor, como alumínio ou ouro, permitem a imagem de moléculas individuais em concentrações micromolares de fluoroforos confinando a excitação da luz visível aos volumes eficazes do zeptolitro. No entanto, a necessidade de equipamentos de nanofabização caros e especializados tem impedido o uso generalizado de ZMWs. Normalmente, nanoestruturas como ZMWs são obtidas por escrita direta usando litografia de feixe de elétrons, que é sequencial e lenta. Aqui, coloidal, ou nanosfera, a litografia é usada como estratégia alternativa para criar máscaras em escala de nanômetros para fabricação de guias de ondas. Este relatório descreve detalhadamente a abordagem, com considerações práticas para cada fase. O método permite que milhares de ZMWs de alumínio ou ouro sejam feitos em paralelo, com diâmetros finais de guia de onda e profundidades de 100-200 nm. Apenas equipamentos de laboratório comuns e um evaporador térmico para deposição metálica são necessários. Ao tornar as ZMWs mais acessíveis à comunidade bioquímica, esse método pode facilitar o estudo de processos moleculares em concentrações e taxas celulares.

Introdução

Técnicas de correlação de fluorescência de molécula única, como a transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) ou espectroscopia de correlação de fluorescência de moléculas únicas (FCS) são ferramentas poderosas para biofísica molecular, permitindo o estudo de movimentos dinâmicos, conformações e interações de biomoléculas individuais em processos como transcrição^1,2,3, tradução^4,5,6, e muitos outros⁷. Para a smFRET, a microscopia de reflexão interna total (TIRF) é um método comum porque muitas moléculas amarradas podem ser seguidas ao longo do tempo, e a onda evanescente gerada pelo TIR é limitada a uma região de 100-200 nm adjacente ao deslizamento de cobertura⁸. No entanto, mesmo com essa restrição no volume de excitação, fluoroforos de interesse ainda precisam ser diluídos para faixas pM ou nM, a fim de detectar sinais de molécula única acima da fluorecência de fundo⁹. Uma vez que as constantes michaelis-menten de enzimas celulares estão tipicamente na faixa μM a mM¹⁰, reações bioquímicas em estudos de moléculas únicas são geralmente muito mais lentas do que as da célula. Por exemplo, a síntese proteica ocorre a 15-20 aminoácidos por segundo em E. coli^11,12, enquanto a maioria dos ribossomos procarióticos em experimentos smFRET traduzem em 0,1-1 aminoácido por segundo¹³. Na síntese proteica, estruturas cristalinas e smFRET em ribossomos parados mostraram que a transferência RNAs (tRNAs) flutua entre estados 'híbridos' e 'clássicos' antes da translocação tRNA-mRNA passo^14,15. Entretanto, quando foram observadas concentrações fisiológicas do fator TRANSLOCação GTPase, EF-G, observou-se uma conformação diferente, intermediária entre os estados híbridos e clássicos, no smFRET⁶. Estudar processos moleculares dinâmicos a taxas e concentrações semelhantes às da célula é importante, mas continua sendo um desafio técnico.

Uma estratégia para aumentar a concentração de substrato fluorescente é o uso de aberturas de comprimento de onda subvendidais baseadas em metal, chamadas de guias de onda de modo zero (ZMWs), para gerar campos de excitação confinados que excitam seletivamente biomoléculas localizadas dentro das aberturas¹⁶ (Figura 1). As aberturas são tipicamente de 100-200 nm de diâmetro e 100-150 nm de profundidade¹⁷. Acima de um comprimento de onda de corte relacionado ao tamanho e forma dos poços (λ_c ≈ 2,3 vezes o diâmetro para guias de ondas circulares com água como o meio dielétrico¹⁸), nenhum modo de propagação é permitido no guia de ondas, daí o termo modo zero guias de onda. No entanto, um campo eletromagnético oscilante, chamado de onda evanescente, exponencialmente em decomposição em intensidade ainda cava uma curta distância no guia de ondas^18,19. Embora semelhante às ondas evanescentes TIR, as ondas evanescentes ZMW têm uma constante de decaimento mais curta, resultando em uma região de excitação eficaz de 10-30 nm dentro do guia de ondas. Em concentrações micromolar de ligantes fluorescentes rotulados, apenas uma ou algumas moléculas estão simultaneamente presentes dentro da região de excitação. Essa restrição do volume de excitação e consequente redução da fluorescência de fundo permite a fluorescência de imagens de moléculas únicas em concentrações biologicamente relevantes. Isso tem sido aplicado a muitos sistemas²⁰, incluindo medições de FCS de difusão de proteína única^21,medidas fret de molécula única de baixa afinidade ligante-proteína²² e interações proteína-proteína²³, e medições espectro-eletroquímicas de eventos de rotatividade molecular único²⁴.

Os ZMWs foram produzidos padronizando diretamente uma camada metálica usando a fresagem de feixe de^{íons 25,26} ou litografia de feixe de elétrons (EBL), seguida por gravação de plasma^16,27. Esses métodos de litografia sem máscara criam guias de onda em série e normalmente requerem acesso a instalações especializadas de nanofabização, impedindo a adoção generalizada da tecnologia ZMW. Outro método, a decolagem de litografia de nanoimimposto ultravioleta^28,usa um molde de slide de quartzo para pressionar um modelo ZMW inverso em um filme de resistência como um selo. Embora este método seja mais simplificado, ele ainda requer EBL para fabricação do molde de quartzo. Este artigo apresenta o protocolo para um método de fabricação modelado simples e barato que não requer fresagem EBL ou íon-feixe e é baseado em embalagem próxima de nanosferas para formar uma máscara litográfica.

A nanosfera ou litografia "natural", que foi proposta pela primeira vez em 1982 por Deckman e Dunsmuir^29,30, usa a auto-montagem de partículas coloidais monodisperse, que vão de dezenas de nanômetros a dezenas de micrômetros^31,para criar modelos para padronização superficial através de gravura e/ou deposição de materiais. As matrizes periódicas bidimensionais (2D) ou tridimensionais (3D) estendidas de partículas coloidais, referidas como cristais coloidais, são caracterizadas por uma iridescência brilhante da dispersão e difração³². Embora menos amplamente utilizada do que o feixe de elétrons ou fotolitografia, esta metodologia de mascaramento é simples, de baixo custo e facilmente dimensionada para baixo para criar tamanhos de características abaixo de 100 nm.

Direcionar a auto-montagem de partículas coloidais determina o sucesso do uso de cristais coloidais como máscaras para padronização superficial. Se o tamanho e a forma das partículas forem homogêneos, as partículas coloidais podem ser prontamente auto-montadas com embalagem hexagonal, impulsionadas pelo esgotamento entropico³³. A evaporação da água após o revestimento de gotas é uma rota eficaz para sedimentar as partículas coloidais, embora outros métodos incluam o revestimento de mergulho^34,o revestimento de spin^35,a deposição eletroforética³⁶e a consolidação em uma interface ar-água³⁷. O protocolo apresentado abaixo baseia-se no método de sedimentação de evaporação, que foi o mais simples de implementar. Os interstícios triangulares entre contas de poliestireno estreitas formam aberturas nas quais emplacar um metal sacrificial, formando postes(Figura 2 e Figura Suplementar 1). Breve ressaramento das contas antes que esta etapa ajuste a forma e o diâmetro desses postes. As contas são removidas, uma camada metálica final é depositada ao redor dos postes e, em seguida, os postes são removidos. Após os dois passos de deposição metálica no nanomasco coloidal, remoção dos postes intermediários e modificação da química da superfície para passivação e amarração, as matrizes ZMW estão prontas para uso para imagens de molécula única. Uma caracterização mais extensa das propriedades ópticas ZMW após a fabricação pode ser encontrada em um artigo³⁸. Além de um evaporador térmico para deposição de vapor dos metais, não são necessárias ferramentas especializadas.

Protocolo

NOTA: Todas as etapas podem ser concluídas em espaço de laboratório geral.

1. Limpeza de tampas de vidro

1. Para fornecer uma superfície limpa para a deposição evaporativa de partículas coloidais, coloque tampas de vidro borossilicato óptico de 24 x 30 mm (0,16-0,19 mm de espessura) dentro das pastilhas ranhuradas de um frasco de coloração de vidro coplin para limpeza.
   NOTA: Certifique-se de que as tampas fiquem eretas e bem separadas para que todas as superfícies sejam claramente expostas durante o processo de limpeza.
2. Despeje acetona suficiente no frasco de coloração para cobrir as tampas, coloque a tampa e sonicate por 10 min a 40 °C.
3. Despeje a acetona e enxágue as tampas preenchendo o frasco de coloração com H₂O destilado e derramando a água. Repita mais 2 vezes.
4. Repita a sônica acetona (passos 1.2 e 1.3) mais uma vez.
5. Despeje suficientes 200 mM KOH no frasco para cobrir as tampas e sonicato, coberto, por 20 min a 40 °C.
   NOTA: O KOH grava ligeiramente o vidro.
6. Enxágüe as tampas com H 2 O₆vezes destiladas.
7. Adicione etanol para cobrir as tampas, adicione a tampa e sonicate por 10 min a 40 °C.
8. Enxágüe as tampas com H 2 O₃vezes destiladas.
9. Pegue cada tampa na borda usando fórceps suaves e seque as tampas com gás N_2. Toque apenas nas bordas do deslizamento de tampa. Coloque cada uma das tampas secas e limpas em uma placa de Petri limpa individualmente.

2. Deposição evaporativa de contas de poliestireno

1. Para criar a máscara de cristal coloidal para a matriz ZMW, centrífuga 50 μL de diâmetro de 1 μm de diâmetro, contas de poliestireno não funcionalizadas (2,5% w/v em água) a 15.000 x g,25 °C por 5 min.
   NOTA: Antes de encanar as contas, a solução de estoque deve ser brevemente vórtice no caso de as contas terem se acomodado no fundo da garrafa.
2. Descarte o supernaspeuta, deixando o mínimo de água restante possível.
   NOTA: A água residual pode alterar as propriedades de evaporação da ressuspensão do etanol^39,por isso a remoção de uma pequena quantidade de contas para remover toda a água é aceitável.
3. Resuspenque as contas da etapa 2.2 em 50 μL de 1:400 TritonX-100:etanol solvente. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar completamente as contas com o solvente.
   NOTA: TritonX-100:o solvente de etanol deve ser selado com filme de parafina após o uso e preparado fresco uma vez por mês. As contas tendem a aderir às laterais de um vaso plástico, como um tubo de microcentrifuuge, de modo a pipeta ao longo dos lados para garantir que todas as contas sejam resuspendidas.
4. Para montar uma câmara de umidade para deposição, coloque 6 pratos de Petri, cada um com um tapa de cobertura, em um banco em uma linha com tampas ligeiramente entreabertas. Em cada prato, mova a mancha para a região aberta para que as manchas sejam expostas ao ambiente quando a umidade for aumentada na próxima etapa.
5. Coloque um higrômetro e um pequeno ventilador elétrico centrado atrás das placas de Petri.
6. Regisso da umidade relativa do ar inicial (RH) no laboratório. Encha um béquer de 200 mL com 150-200 mL de água ~75 °C e coloque-o atrás do ventilador.
7. Ligue o ventilador e cubra as placas de Petri, ventilador, béquer e higrômetro com um recipiente de armazenamento plástico transparente e virado (66 cm x 46 cm x 38 cm).
8. Deixe o RH na câmara subir para 70-75%, o que normalmente leva 5-10 min.
   NOTA: Se o rh do laboratório ambiente estiver baixo (abaixo de ~50%), deixe a câmara atingir um RH maior, mas não superior a 80%, para compensar a perda de umidade durante o depoimento (veja abaixo).
9. Quando o RH atingir 70-75%, registo o RH e levante ligeiramente o recipiente de armazenamento plástico para colocar rapidamente as tampas nas placas de Petri, o que evita o excesso de molhar as tampas.
   NOTA: A temperatura na câmara será ligeiramente mais quente que a temperatura ambiente, tipicamente 25-26 °C, como resultado da umidificação. Se a umidade é visível nas tampas, então as superfícies de vidro estão muito molhadas. Um porta-luvas comercial pode simplificar essa parte do protocolo.
10. Que o RH na câmara continue subindo para 85%. Nesse ponto, registe o RH na câmara de umidade e a pipeta 5 μL da suspensão da conta no centro de cada deslizamento de cobertura.
11. Feche a câmara e as placas de Petri após cada depoimento para minimizar a perda de umidade. Objetivo de terminar todos os 6 depoimentos dentro de 2 minutos.
12. Grave o RH na câmara após o depoimento.
    NOTA: O RH após o depoimento ajudará a medir a rapidez com que a umidade foi perdida durante o depoimento, o que depende das condições do laboratório ambiente. Para uma corrida típica de sucesso, a câmara começará em 85% de RH antes do depoimento e terminará em 70-75% de RH após o depoimento.
13. Deixe as gotículas de contas se espalharem e secar por 5 minutos.
    NOTA: Se os cristais coloidais têm muitos orifícios ou regiões multicamadas, então a câmara provavelmente estava muito úmida ou seca, respectivamente. Ajuste a umidade relativa do ar para fechar as placas de Petri e comece os depoimentos (veja a seção de resultados para maior discussão de otimização).

3. Ressarem as contas para reduzir o tamanho dos poros no modelo de cristal coloidal

1. Para fornecer uma superfície de temperatura uniforme para a ressarição das contas de poliestireno, que estreita os interstícios entre contas e contorna os cantos dos interstícios, coloque uma placa de alumínio plana e moída em cima de uma placa quente de cerâmica padrão.
2. Coloque a temperatura da placa quente para 107 °C, a temperatura de transição de vidro do poliestireno⁴⁰.
   NOTA: Para obter temperatura estável e precisa, uma sonda termopar foi mantida em um orifício de 2-3 mm de largura e 4−5 mm de profundidade na placa de alumínio.
3. Coloque uma mancha contendo o modelo de contas na placa de alumínio quente e anneal para 20 s (consulte a seção de discussão para explicação do tempo de fusão).
4. Após o aquecimento, remova a tampa da placa de alumínio e coloque-a prontamente em outra superfície de alumínio de temperatura ambiente para esfriá-la.
   NOTA: É útil ter as tampas penduradas ligeiramente sobre a borda da placa ou canais rasos do moinho (veja o vídeo que acompanha) na placa para facilitar a captação das tampas.

4. Nanofabricação de guias de onda de modo zero de alumínio usando o modelo de cristal coloidal

1. Usando deposição evaporativa térmica ou de feixe de elétrons, deposite 300 nm de cobre a 2 Å/s sobre o modelo de cristal coloidal para gerar postes nos interstícios entre as contas.
2. Remova o excesso de metal em cima das contas pressionando suavemente a superfície com fita. Descasque lentamente a fita para retirar o metal.
   NOTA: Algumas pequenas manchas de excesso de metal reflexivo podem permanecer após a tração da fita, e estas podem muitas vezes ser removidas por um fluxo de gás N_2. Se remendos substanciais de excesso de metal reflexivo permanecerem após a tração da fita, tente absorver os modelos em tolueno por 2h para dissolver parcialmente as contas de poliestireno. Lave as tampas com água destilada, seque com N₂e repita a fita. O molho adicional não deve dissolver completamente as contas, pois as contas ajudam a proteger os postes de danos durante a tração da fita.
3. Para dissolver as contas de poliestireno, coloque os modelos de contas em tolueno e mergulhe durante a noite.
   ATENÇÃO: A fumaça do tolueno pode ser tóxica. Trabalhe com tolueno sob um capô bem ventilado e use equipamentos de proteção pessoal, incluindo luvas, óculos de segurança e um jaleco. O tolueno deve ser armazenado em armários ventilados designados para líquidos inflamáveis.
4. Após a incubação do tolueno, enxágue os modelos uma vez com clorofórmio e duas vezes com etanol. As tampas da alça se aproximam cuidadosamente neste ponto porque os delicados postes de metal de 200-300 nm de altura estão agora expostos. Seque os modelos com N₂ e remova polímeros residuais e contaminantes em um limpador de plasma de oxigênio por 30 minutos.
   ATENÇÃO: Os vapores de clorofórmio podem ser tóxicos. Trabalhe com clorofórmio sob um capô bem ventilado e use equipamentos de proteção pessoal, incluindo luvas, óculos de segurança e um jaleco. O clorofórmio deve ser armazenado em armários ventilados longe de outros solventes inflamáveis.
5. Usando deposição evaporativa térmica ou de feixe de elétrons, deposite 3 nm de uma camada de adesão de titânio a 1 Å/s seguido por 100-150 nm de alumínio a 4 Å/s ao redor e em cima dos postes de cobre.
   NOTA: Pode-se usar revestimentos mais grossos para obter guias mais profundos e melhor atenuação da fluorescência de fundo, mas isso também diminui o rendimento após expor e dissolver os postes na próxima etapa (veja a seção de discussão).
6. Para dissolver os postes metálicos, mergulhe as tampas em etchant de cobre (à base de ácido cítrico; Tabela de Materiais) por 2h.
   ATENÇÃO: O etchant metálico pode causar queimaduras na pele. Trabalhe com etchants sob um capô bem ventilado e use equipamento de proteção. Lave bem as mãos após o manuseio. O etchant metálico deve ser armazenado em armários ventilados designados para líquidos corrosivos.
7. Enxágüe as tampas com água destilada, seque com N₂, e polir suavemente a superfície do revestimento metálico com papel de lente para expor quaisquer postes que ainda estejam cobertos de revestimento. Coloque as tampas de volta em etchant de cobre por mais 2h, depois enxágue novamente com água destilada e seque com N₂.
   NOTA: Os slides ZMW devem ser armazenados em placas de Petri cobertas e limpas para mantê-los livres de contaminantes.

5. Nanofabricação de guias de onda do modo ouro zero usando o modelo de cristal coloidal

NOTA: O método para fabricar ZMWs de ouro(Figura Suplementar 1),que espelha o protocolo para fabricar ZMWs de alumínio, é fornecido nesta seção.

1. Usando deposição evaporativa de feixe térmico ou elétron, deposite 3 nm de uma camada de adesão de titânio a 1 Å/s seguido por 300 nm de alumínio a 4 Å/s.
2. Remova o excesso de metal em cima das contas pressionando suavemente a superfície com fita. Descasque lentamente a fita para retirar o metal.
3. Para dissolver as contas de poliestireno, coloque os modelos de contas em tolueno e mergulhe durante a noite.
4. Após a incubação do tolueno, enxágue os modelos uma vez com clorofórmio e duas vezes com etanol. Seque os modelos com N₂ e remova contaminantes residuais em um limpador de plasma de oxigênio por 30 minutos.
5. Usando deposição evaporativa de feixe térmico ou elétron, deposite 100-150 nm de ouro a 5 Å/s ao redor e em cima dos postes de alumínio.
6. Para dissolver os postes metálicos, mergulhe as tampas em etchant de alumínio (à base de ácido fosfórico; Tabela de Materiais) por 1h.
7. Enxágüe as tampas com água destilada, seque com N₂, e polir suavemente a superfície do revestimento metálico com papel de lente para expor quaisquer postes que ainda estejam cobertos de revestimento. Coloque as tampas de volta em gravura de alumínio por 1h, depois enxágue novamente com água destilada e seque com N₂.
   NOTA: Os slides ZMW devem ser armazenados em placas de Petri cobertas e limpas.

Resultados

A automontagem das partículas coloidais de poliestireno através de sedimentação evaporativa (etapas 2.1−2.13) pode produzir uma série de resultados, uma vez que requer o controle da taxa de evaporação do solvente. No entanto, como os depoimentos são rápidos (10-15 min por rodada), o procedimento pode ser rapidamente otimizado para diferentes condições de laboratório ambiente. A Figura 3A mostra um modelo coloidal bem formado após deposição e evaporação. Macroscopicamente, a região das contas...

Discussão

Para o automontagem coloidal (seção de protocolo 2), o uso de etanol em vez de água à medida que o solvente de suspensão acelera o processo de evaporação para que os modelos estejam prontos em 2-3 minutos após a deposição em vez de 1−2 h como nos métodos anteriores^48,49. O protocolo de sedimentação evaporativa apresentado aqui também é mais simples do que os protocolos de sedimentação anteriores que requerem o controle da inclinação da superfície, temperatura e v...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Limpeza de lamínula de vidro
acetona	Sigma	32201	1 L
Frasco de coloração de vidro Coplin	Fisher Scientific	08-817	Frasco de coloração com 8 ranhuras e tampa de vidro moldado
Lamínulas	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Retangular)
Etanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	de hidróxido de potássio	Sigma	30603
	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm de diâmetro, 15 mm de profundidade
Sonicator	Branson	Z245143	Limpador ultrassônico de mesa, 5510
2. Deposição Evaporativa de Contas de Poliestireno
Recipiente de armazenamento transparente	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 pol.
Ventilador de mesa	O2Cool	FD05001A	Qualquer ventilador de mesa pequeno (~5 pol.) funcionará
Copo de vidro	Fisher Scientific	02-555-25B Medidor de	de 250 mL
	Fisher Scientific	11-661-19
Tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	21-402-903	1,5 mL
Polysciences		18602-15	1,00 µ m de diâmetro,
Triton X-100 não funcionalizado deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Recozimento de Esferas para Reduzir o Tamanho dos Poros no Cristal Coloidal Placa de Modelo
Alumínio	Fisher Scientific	AA11062RY	Personalizado internamente para 14 cm x 14 cm
Placa de aquecimento de cerâmica	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 pol.
Controlador de temperatura	McMaster-Carr	38615K71	Leia a temperatura com sonda de termopar
Sonda de termopar	McMaster-Carr	9251T93	Tipo K, sonda
de superfície4/5. Nanofabricação de guias de onda de modo zero usando o modelo de cristal coloidal< / forte >
gravante de alumínio	Transeno	Tipo A
Pelotas de alumínio	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	Para evaporação de feixe de elétrons
Clorofórmio		Sigma 288306	1 L
Gravante de cobre	Transeno	49-1
Pellets de cobre	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	Para evaporação de feixe de elétrons
Pellets de ouro	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	Para evaporação de feixe de elétrons
Papel	para lentes Thorlabs	MC-5
Limpador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Fita adesiva	Grampos	MMM119
Sistema de deposição de filme fino	Kurt J. Lesker	PVD-75	O sistema de evaporação térmica de mesa também funcionará
Pellets de titânio	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	Para evaporação por feixe de elétrons
Tolueno	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Divisor espectral Dual View	Photometrics, Inc.