Descrito aqui é um método de litografia de nanosfera para fabricação paralela de guias de onda de modo zero, que são matrizes de nanoaperaturas em uma microscopia de vidro revestida de metal para imagens de moléculas únicas em concentrações de nano-a-micromolar de fluoroforos. O método aproveita a automontagem de cristal coloidal para criar um modelo de guia de onda.
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Artigo de método
Fabricação de guias de ondas de modo zero para microscopia de molécula única de alta concentração
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Na enzimologia da fluorescência de molécula única, a fluorescência de fundo de substratos rotulados em solução muitas vezes limita a concentração de fluoróforos a faixas de pico a nanomolar, várias ordens de magnitude menos do que muitas concentrações fisiológicas de ligantes. Nanoestruturas ópticas chamadas de guias de onda de modo zero (ZMWs), que são de 100 a 200 nm de diâmetro, fabricadas em um fino metal condutor, como alumínio ou ouro, permitem a imagem de moléculas individuais em concentrações micromolares de fluoroforos confinando a excitação da luz visível aos volumes eficazes do zeptolitro. No entanto, a necessidade de equipamentos de nanofabização caros e especializados tem impedido o uso generalizado de ZMWs. Normalmente, nanoestruturas como ZMWs são obtidas por escrita direta usando litografia de feixe de elétrons, que é sequencial e lenta. Aqui, coloidal, ou nanosfera, a litografia é usada como estratégia alternativa para criar máscaras em escala de nanômetros para fabricação de guias de ondas. Este relatório descreve detalhadamente a abordagem, com considerações práticas para cada fase. O método permite que milhares de ZMWs de alumínio ou ouro sejam feitos em paralelo, com diâmetros finais de guia de onda e profundidades de 100-200 nm. Apenas equipamentos de laboratório comuns e um evaporador térmico para deposição metálica são necessários. Ao tornar as ZMWs mais acessíveis à comunidade bioquímica, esse método pode facilitar o estudo de processos moleculares em concentrações e taxas celulares.
Introdução
Técnicas de correlação de fluorescência de molécula única, como a transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) ou espectroscopia de correlação de fluorescência de moléculas únicas (FCS) são ferramentas poderosas para biofísica molecular, permitindo o estudo de movimentos dinâmicos, conformações e interações de biomoléculas individuais em processos como transcrição1,2,3, tradução4,5,6, e muitos outros7. Para a smFRET, a mi....
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Protocolo
NOTA: Todas as etapas podem ser concluídas em espaço de laboratório geral.
1. Limpeza de tampas de vidro
- Para fornecer uma superfície limpa para a deposição evaporativa de partículas coloidais, coloque tampas de vidro borossilicato óptico de 24 x 30 mm (0,16-0,19 mm de espessura) dentro das pastilhas ranhuradas de um frasco de coloração de vidro coplin para limpeza.
NOTA: Certifique-se de que as tampas fiquem eretas e bem separadas para que todas as superfícies sejam claramente expostas durante o processo de limpeza. - Despeje acetona suficiente no frasco de coloração para cobrir as tampas, coloque a tampa e sonicate po....
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Resultados
A automontagem das partículas coloidais de poliestireno através de sedimentação evaporativa (etapas 2.1−2.13) pode produzir uma série de resultados, uma vez que requer o controle da taxa de evaporação do solvente. No entanto, como os depoimentos são rápidos (10-15 min por rodada), o procedimento pode ser rapidamente otimizado para diferentes condições de laboratório ambiente. A Figura 3A mostra um modelo coloidal bem formado após deposição e evaporação. Macroscopicamente, a região das contas.......
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Discussão
Para o automontagem coloidal (seção de protocolo 2), o uso de etanol em vez de água à medida que o solvente de suspensão acelera o processo de evaporação para que os modelos estejam prontos em 2-3 minutos após a deposição em vez de 1−2 h como nos métodos anteriores48,49. O protocolo de sedimentação evaporativa apresentado aqui também é mais simples do que os protocolos de sedimentação anteriores que requerem o controle da inclinação da superfície, temperatura e v.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01GM080376, R35GM118139 e NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 a Y.E.G., e por uma bolsa de pré-doutorado da NIAID F30AI114187 a R.M.J.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1. Limpeza de lamínula de vidro | |||
| acetona | Sigma | 32201 | 1 L |
| Frasco de coloração de vidro Coplin | Fisher Scientific | 08-817 | Frasco de coloração com 8 ranhuras e tampa de vidro moldado |
| Lamínulas | VWR | 48404-467 | 24 mm x 30 mm (No.1½, Retangular) |
| Etanol | Sigma | E7023 | 1 L |
| KOH | de hidróxido de potássio | Sigma | 30603 |
| Fisher Scientific | R80115TS | 100 mm de diâmetro, 15 mm de profundidade | |
| Sonicator | Branson | Z245143 | Limpador ultrassônico de mesa, 5510 |
| 2. Deposição Evaporativa de Contas de Poliestireno | |||
| Recipiente de armazenamento transparente | Fisher Scientific | 50-110-8222 | 26 x 18 x 15 pol. |
| Ventilador de mesa | O2Cool | FD05001A | Qualquer ventilador de mesa pequeno (~5 pol.) funcionará |
| Copo de vidro | Fisher Scientific | 02-555-25B Medidor de | de 250 mL |
| Fisher Scientific | 11-661-19 | ||
| Tubos de microcentrífuga | Fisher Scientific | 21-402-903 | 1,5 mL |
| Polysciences | 18602-15 | 1,00 µ m de diâmetro, | |
| Triton X-100 não funcionalizado deturgent | Sigma | X100 | 100 mL |
| 3. Recozimento de Esferas para Reduzir o Tamanho dos Poros no Cristal Coloidal Placa de Modelo | |||
| Alumínio | Fisher Scientific | AA11062RY | Personalizado internamente para 14 cm x 14 cm |
| Placa de aquecimento de cerâmica | Fisher Scientific | HP88857100 | 13 x 8.2 x 3.8 pol. |
| Controlador de temperatura | McMaster-Carr | 38615K71 | Leia a temperatura com sonda de termopar |
| Sonda de termopar | McMaster-Carr | 9251T93 | Tipo K, sonda |
| de superfície4/5. Nanofabricação de guias de onda de modo zero usando o modelo de cristal coloidal< / forte > | |||
| gravante de alumínio | Transeno | Tipo A | |
| Pelotas de alumínio | Kurt J. Lesker | EVMAL40QXHB | Para evaporação de feixe de elétrons |
| Clorofórmio | Sigma 288306 | 1 L | |
| Gravante de cobre | Transeno | 49-1 | |
| Pellets de cobre | Kurt J. Lesker | EVMCU40QXQA | Para evaporação de feixe de elétrons |
| Pellets de ouro | Kurt J. Lesker | EVMAUXX40G | Para evaporação de feixe de elétrons |
| Papel | para lentes Thorlabs | MC-5 | |
| Limpador de plasma | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Fita adesiva | Grampos | MMM119 | |
| Sistema de deposição de filme fino | Kurt J. Lesker | PVD-75 | O sistema de evaporação térmica de mesa também funcionará |
| Pellets de titânio | Kurt J. Lesker | EVMTI45QXQA | Para evaporação por feixe de elétrons |
| Tolueno | Sigma | 244511 | 1 L |
| Representative Results | |||
| COMSOL Multiphysics Modeling Software | COMSOL, Inc. | ||
| Divisor espectral Dual View | Photometrics, Inc. |
Referências
- Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
- Santoso, Y., et al. Confor....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.
