Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

Resumo

Descrevemos um método confiável para a preparação de extratos celulares inteiros de leveduras ou outras células usando uma fábrica de congelador criogênico que minimiza a degradação e a desnaturação de proteínas. Os extratos celulares são adequados para purificação de complexos proteicos funcionais, análises proteômicas, estudos de co-imunoprecipitação e detecção de modificações de proteína labile.

Resumo

A facilidade da manipulação genética e a forte conservação evolutiva das máquinas celulares eucarióticas na levedura saccharomyces cerevisiae tornou-a um organismo modelo genético preeminente. No entanto, uma vez que o isolamento eficiente da proteína depende da interrupção ideal das células, o uso de levedura para análise bioquímica de proteínas celulares é dificultado por sua parede celular que é cara para digerir enzimaticamente (usando lyticase ou zymolyase), e difícil de interromper mecanicamente (usando um batedor de contas tradicional, uma prensa francesa ou um moedor de café) sem causar aquecimento de amostras, o que por sua vez causa denaturação e degradação de proteínas. Embora a moagem manual de células de levedura sob nitrogênio líquido (LN₂) usando uma argamassa e pilão evite o superaquecimento das amostras, é trabalhosa intensiva e sujeita à variabilidade na lise celular entre os operadores. Por muitos anos, temos preparado com sucesso extratos de levedura de alta qualidade usando criogrinding de células em uma fábrica de congelador automatizada. A temperatura de -196 °C alcançada com o uso da LN₂ protege o material biológico da degradação por proteases e núcleos, permitindo a recuperação de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas. Aqui descrevemos esta técnica em detalhes para células de levedura brotante que envolve primeiro o congelamento de uma suspensão de células em um tampão de lise através de sua adição dropwise em LN₂ para gerar gotículas congeladas de células conhecidas como "pipoca". Esta pipoca é então pulverizada sob LN₂ em um moinho de congelador para gerar um extrato congelado "em pó" que é descongelado lentamente e esclarecido por centrifugação para remover detritos insolúveis. Os extratos resultantes estão prontos para aplicações a jusante, como purificação de proteínas ou ácidos nucleicos, análises proteômicas ou estudos de co-imunoprecipitação. Esta técnica é amplamente aplicável para a preparação de extratos celulares de uma variedade de microrganismos, tecidos vegetais e animais, espécimes marinhos, incluindo corais, bem como isolar DNA/RNA de espécimes fósseis forenses e permafrost.

Introdução

A levedura é um organismo modelo popular para estudos de proteínas, pois é um simples organismo eucariótico com abundância de ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para pesquisadores¹. Por causa de sua parede celular resistente, um desafio que os pesquisadores enfrentam é desaformar as células sem danificar o conteúdo celular. Diferentes métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos proteicos através da interrupção de células de levedura que incluem lise enzimática (zymolyase)^2,3, lise química⁴, lise física por congelamento^5,

Protocolo

1. Preparação de Pipoca de Levedura

1. Cultivar células de levedura em 0,5 L de mídia YPD a uma densidade de 1 x 10⁷ células/mL. Conte células usando um Contador Coulter ou qualquer outro meio.
2. Centrífugas por 10 min a 2.400 g e 4 °C.
3. Lave cada amostra uma vez com 500 mL de água desionizada de gelo 18 mega Ohm Milli-Q.
4. Pelotas resuspend em 15 mL de tampão de lyse gelado [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerol, com agente redutor recém-adicionado 10 mM β-mercaptoetanol, coquetel inibidor de protease, 10 μM inibidor proteasome MG-132, 1 mM inibidor de butilato de sódio e inibidores de fosfatose (1 mM ....

Resultados

Comparamos dois métodos diferentes para a lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a 4 °C e um método automatizado de criogrinding a -196 °C, para avaliar as proteínas de recuperação relativa nos extratos celulares preparados com ambos os métodos. Para este estudo, optou-se por usar uma levedura brotante YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3 -Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])¹⁶ carregando.......

Discussão

Uma limitação de estudar proteínas nativas a partir de levedura é a lise ineficiente das células de levedura devido à sua parede celular resistente. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos, o método mais consistente e eficiente em nossas mãos é o criogrinding de células de leveduras flash congelado como pipoca. Este método permite a preparação confiável de extratos celulares inteiros de alta qualidade de levedura brotante em comparação com outros métodos de lise. Os resultados representativos demonstraram que a c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de policarbonato de 50 mL com tampas de rosca	Beckman	357002	Tubos de centrífuga
BD Bacto Peptona	BD Biosiences	211677	Levedura YPD componente de mídia
BD Extrato de levedura	Bacto BD Biosiences	212750	Levedura YPD componente de mídia
Centrífuga Beckman Avanti	Beckman	B38624	Centrífuga de alta velocidade
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anidro	MP Biomedicals	901521	Levedura YPD componente de mídia
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Rotor de caçamba oscilante
Eppendorf centrífuga refrigerada 5810 R	Eppendorf	22625101	Centrífuga refrigerada
Glicerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Excludente de volume e crioprotetor
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 anticorpo	Novagen	70796	Anticorpo para etiqueta HIS
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Sal para manter a força iônica
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Inibidor de proteassoma
Coquetel de inibidor de fosfatase	ThermoFisher Scientific	A32957	Coquetel de inibidor de fosfatase
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L
Coquetel de inibidor de protease	ThermoFisher Scientific	A32963	Coquetel de inibidor de protease
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Butirato de sódio	EM Science	BX2165-1	Inibidor de histona desacetilase
Fluoreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S6521	Inibidor de Fosfatase
Vanadato de Sódio	MP Biomedicals	159664	Inibidor de Fosfatase
Beta;-glicerofosfato de Sódio Alfa	Aesar	13408-09-8	Inibidor de Fosfatase
Spex Certiprep 6850 moinho congelador	SPEX Sample Prep	6850	Moinho Congelador
TALON Metal Affinity Resina	BD Biosiences	635502	Para puxar para baixo as proteínas marcadas com HIS
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Detergente não iônico
β-Mercaptoetanol	AMRESCO	M131-250ML	Agente redutor

de mancha de proteína