Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íon hiperativado e neurotoxicidade induzida por proteínas, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de doenças neurodegenerativas associadas à idade.
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Artigo de método
Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans
Neste artigo
Resumo
Resumo
Combater patologias neurodegenerativas humanas e gerenciar seu impacto socioeconômico generalizado está se tornando uma prioridade global. Apesar de seus efeitos prejudiciais sobre a qualidade de vida humana e o sistema de saúde, a maioria dos distúrbios neurodegenerativos humanos ainda permanece incurável e inde prevenivel. Portanto, o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas contra tais males está se tornando uma urgência premente. A deterioração dos circuitos e funções neuronais associadas à idade é evolutivamente conservada em organismos tão diversos quanto o humilde verme Caenorhabditis elegans e humanos, significando semelhanças nos mecanismos celulares e moleculares subjacentes. C. elegans é um modelo genético altamente maleável, que oferece um sistema nervoso bem caracterizado, transparência corporal e um repertório diversificado de técnicas genéticas e de imagem para avaliar a atividade neuronal e o controle de qualidade durante o envelhecimento. Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íons hiperativado (por exemplo, deg-3(d) e mec-4(d)) e agregado de proteínas (por exemplo, neurotoxina α-syuncleina e poli-glutamato)-induzidas por neurotoxicidade, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de quebra neuronal relacionada à idade. Uma combinação desses modelos de neurodegeneração animal, juntamente com telas genéticas e farmacológicas para moduladores de morte celular, levará a uma compreensão sem precedentes da discriminação relacionada à idade da função neuronal e fornecerá insights críticos com ampla relevância para a saúde humana e qualidade de vida.
Introdução
Nas últimas duas décadas, C. elegans tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo para investigar os mecanismos moleculares da morte celular necrótica. C. elegans oferece um sistema nervoso excepcionalmente bem caracterizado e mapeado, estrutura corporal transparente e um repertório diversificado de métodos genéticos e de imagem para monitorar a função celular in vivo e a sobrevivência ao longo do envelhecimento. Assim, vários modelos genéticos C. elegans de neurodegeneração já foram desenvolvidos para avaliar a viabilidade neuronal. Em particular, os modelos de nematoides bem descritos e utilizados incluem a necrose hiperativa ind....
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Protocolo
1. Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos
NOTA: Mutações de ganho de função na família genética de degenerinas, incluindo mec-4 e deg-3, entre outras, resultam na geração de canais de íons hiperativos desencadeando a morte celular necrosada de seis neurônios receptores de toque necessários para mecanosensação em vermes3. A necrose induzida pela estimulação aberrante das degenerinas apresenta várias semelhanças mecanicistas e morfológicas à excitotoxicidade em mamíferos. A manutenção do metabolismo energético e da homeostase de cálcio tem um papel crucial na sobrevivência neuronal dur....
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Resultados
Célula necrosada induzida por canais de íons hiperativos
Utilizando os procedimentos aqui apresentados, os embriões mutantes mec-4(u231) e deg-3u662 foram incubados por 25 min a 34 °C ou mantidos na temperatura padrão de 20 °C. Ao eclodir, o número de corpos de células neuronais foi determinado no estágio larval L1 de ambos os grupos. A morte celular necrótica é diminuída em nematoides que eclodiram de ovos pré-condicionados de choque térmico(Figura 1
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Discussão
Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis para crescimento, sincronização e exame microscópico de alguns modelos versáteis de C. elegans que investigam a neurodegeneração dependente da idade. Particularmente, avaliamos e dissecamos os fundamentos celulares e moleculares da quebra neuronal relacionada à idade, utilizando necrose hiperativada induzida pelo canal de íons e neurotoxicidade induzida porproteínas 1,,2,
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Divulgações
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Chaniotakis M. e Kounakis K. pela gravação e edição de vídeo. K.P. é financiado por uma bolsa da Fundação Helênica de Pesquisa e Inovação (HFRI) e da Secretaria Geral de Pesquisa e Tecnologia (GSRT). A N.T. é financiada por subvenções do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC – GA695190 – MANNA), dos Programas-Quadro da Comissão Europeia e do Ministério da Educação grego.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) | ||
| Cloreto de cálcio desidratado (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Eletroforese de colesterol SERVA | 17101.01 | ||
| deg-3(u662)V ou deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Manter os animais a 20 ° | |
| Microscópio C DIC (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Estereomicroscópio de dissecação | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Microscópio de epifluorescência | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli cepa OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri pratos (60 mm x 15 mm) | Software de análise de imagem Sigma-Aldrich | P5237 | |
| Fiji | https://fiji.sc | ||
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X ou mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Manter os animais a 20 > C | |
| Lâminas de microscópio (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Vidro de cobertura do microscópio (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Pacote de software Microsoft Office 2011 Excel | Microsoft Corporation, Redmond, EUA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| ágar de meio de crescimento de nematóides (NGM) | |||
| Solução de estoque de nistatina | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptona | BD, Bacto | 211677 | |
| Tampão | |||
| Cloreto de sódio (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Equipamento padrão para preparação de placas de ágar ( autoclave, placas de Petri, etc.) | |||
| Equipamento padrão para manutenção de minhocas (picareta de fio de platina, incubadoras, etc.) | |||
| software de análise estatística | GraphPad Software Inc., San Diego, EUA | Pacote de software GraphPad Prism | |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Cloridrato de tetramisol | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Mediante solicitação: G. Caldwell (Universidade do Alabama, Tuscaloosa AL) |
Referências
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003....
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Reimpressões e permissões
