In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Nereo Kalebic; Barbara Langen; Jussi Helppi; Hiroshi Kawasaki; Wieland  B. Huttner

doi:10.3791/61171

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Artigo de método

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

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DOI:

10.3791/61171

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6 de maio de 2020

Nereo Kalebic¹^,² , Barbara Langen¹^,³ , Jussi Helppi¹ , Hiroshi Kawasaki⁴ , Wieland B. Huttner¹

¹Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ²Human Technopole, ³Landesdirektion Sachsen, ⁴Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para realizar manipulação genética no cérebro de furão embrionário usando na eletroporação uterónica. Este método permite o direcionamento de células progenitoras neurais no neocórtex in vivo.

Resumo

A manipulação da expressão genética in vivo durante o desenvolvimento embrionário é o método de escolha ao analisar o papel dos genes individuais durante o desenvolvimento dos mamíferos. No útero a eletroporação é uma técnica-chave para a manipulação da expressão genética no cérebro embrionário mamífero in vivo. Um protocolo para a eletroporação uterópica do neocórtex embrionário de furões, um pequeno carnívoro, é apresentado aqui. O furão está cada vez mais sendo usado como modelo para o desenvolvimento do neocórtex, pois seu neocórtex exibe uma série de características anatômicas, histológicas, celulares e moleculares que também estão presentes em primatas humanos e não humanos, mas ausentes em modelos de roedores, como rato ou rato. No útero a eletroporação foi realizada no dia embrionário (E) 33, um estágio de midneurogenesis no furão. No útero a eletroporação tem como alvo células progenitoras neurais que revestem os ventrículos laterais do cérebro. Durante a neurogênese, essas células progenitoras dão origem a todos os outros tipos de células neurais. Este trabalho mostra resultados e análises representativas no E37, no dia pós-natal (P) 1 e P16, correspondentes a 4, 9 e 24 dias após a eletroporação uterativa, respectivamente. Em estágios anteriores, a progênia das células-alvo consiste principalmente de vários subtipos progenitores neurais, enquanto em estágios posteriores a maioria das células rotuladas são neurônios pós-metóticos. Assim, na eletroporação uterópora permite o estudo do efeito da manipulação genética nas características celulares e moleculares de vários tipos de células neurais. Através de seu efeito em várias populações celulares, na eletroporação uterópica também pode ser usado para a manipulação de características histológicas e anatômicas do neocórtex furão. É importante ressaltar que todos esses efeitos são agudos e são realizados com uma especificidade espostetorial determinada pelo usuário.

Introdução

O neocórtex é a folha externa do cerebrum mamífero e a sede de funções cognitivas mais altas^1,^,²^,³^,⁴^,⁵. Para alcançar uma manipulação genética aguda no neocórtex mamífero in vivo durante o desenvolvimento embrionário, dois métodos diferentes foram explorados: infecção viral⁶ e na eletroporação^{uterónica 7}. Ambos os métodos permitem um direcionamento eficiente de células neocorticais, mas sofrem de algumas limitações. A maior vantagem da eletroporação uteiremida....