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Artigo de método

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

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DOI:

10.3791/61173

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18 de maio de 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 2Lester and Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 3Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) e modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados recapitulam fielmente a doença humana e são modelos preferidos para pesquisas básicas e translacionais sobre câncer de mama. Aqui, um método é descrito para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária para estudar biologia tumoral e avaliar a resposta medicamentosa.

Resumo

Modelos pré-clínicos que recapitulam fielmente a heterogeneidade tumoral e a resposta terapêutica são fundamentais para a pesquisa translacional do câncer de mama. Linhas celulares imortalizadas são fáceis de cultivar e geneticamente modificadas para estudar mecanismos moleculares, mas a pressão seletiva da cultura celular muitas vezes leva a alterações genéticas e epigenéticas ao longo do tempo. Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) recapitulam fielmente a heterogeneidade e a resposta medicamentosa de tumores mamários humanos. Os modelos PDX exibem uma latência relativamente curta após o transplante ortotópico que facilita a investigação da biologia do tumor de mama e da resposta a medicamentos. Os modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados permitem o estudo da imunidade do tumor de mama. O protocolo atual descreve o método para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária seguido de tratamentos medicamentosos. Esses modelos pré-clínicos fornecem abordagens valiosas para investigar a biologia do tumor de mama, a resposta a medicamentos, a descoberta de biomarcadores e os mecanismos de resistência a medicamentos.

Introdução

A maioria das mortes por câncer de mama pode ser atribuída a doenças recorrentes resistentes às terapias convencionais1,2. A heterogeneidade inter e intra-tumora dos cânceres de mama contribuem para a resistência terapêutica. Além disso, a heterogeneidade tumoral pode afetar o prognóstico preciso e desafiar o manejo da doença3,4. A identificação de biomarcadores preditivos de resposta melhorará significativamente os resultados clínicos de pacientes com câncer de mama. Embora a maioria dos tipos de câncer de mama sejam tumores imunologicamente 'frios' que provavelmente não são responder à imunoterapia, os inibidores de checkpoint imunológicos têm mostrado promessa nos ensaios clínicos2,5. Por exemplo, um estudo de fase III mostrou melhor sobrevida livre de doenças (DFS) e evidências preliminares de que o atezolizumabe (anticorpo monoclonal contra PD-L1) combinado com nab-paclitaxel pode fornecer um benefício global de sobrevivência em comparação com nab-paclitaxel sozinho em tumores com ≥1% de mancha PD-L16. O desenvolvimento de terapias que sensibilizem tumores mamários para a imunoterapia revolucionará os regimes de tratamento.

Modelos pré-clínicos que recapitulam fielmente a heterogeneidade do câncer de mama humano e a resposta a medicamentos são fundamentais para estudar a biologia tumoral e identificar potenciais biomarcadores para terapia direcionada. As linhas celulares imortalizadas são amplamente utilizadas para pesquisas sobre câncer de mama, uma vez que essas linhas celulares são fáceis de crescer e geneticamente modificadas para estudar mecanismos moleculares. No entanto, devido à pressão seletiva da cultura celular de longo prazo in vitro, a deriva genética pode ocorrer ao longo do tempo e as linhas de células cancerígenas de mama podem levar a alterações genômicas específicas da linha celular que são distintas das aberrações em tumores primários de mama7,8,9.

Os pedaços tumorais de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) são capazes de recapitular a heterogeneidade da doença humana, e são histologicamente e imunohistoquesticamente semelhantes ao tumor de origem10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. É importante ressaltar que os modelos PDX são fenotipicamente estáveis em múltiplos transplantes, evidenciados pela histologia, transcriptome, proteome e análise genômica10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Os modelos PDX mostram respostas de tratamento comparáveis às observadas clinicamente10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Foram estabelecidos modelos PDX para os modelos PDX positivos para receptor de estrogênio (ER+),receptor de progesterona positivo (PR+),fator de crescimento epidérmico 2 positivo (ERBB2+, HER2+) e câncer de mama triplo negativo (TNBC) modelos PDX e fornecem uma excelente plataforma para testar terapias endócrinas, quimio e direcionadas. No entanto, uma das principais ressalvas dos modelos PDX no momento é a falta de um sistema imunológico funcional no mouse.

Os modelos de rato geneticamente modificados (GEMM), como trp53 homozigos nulos, cMyc, Wnt1, PyMT, ou modelos de superexpressão Her2, permitem o estudo da iniciação espontânea do tumor, progressão e metástase no contexto de um sistema imunológico intacto. No entanto, a latência tumoral é longa, o que dificulta a realização de ensaios pré-clínicos com múltiplos braços30,31. No entanto, o GEMM pode ser transplantado para hospedeiros síngênicos para gerar número suficiente de tumores que recapitulem de perto tumores humanos32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Por exemplo, o epitélio mamário de um rato BALB/c p53-nulo foi transplantado nas almofadas de gordura limpas de camundongos receptores do tipo selvagem síndico para formar tumores primários, que podem ser transplantados ainda mais em hospedeiros síngênicos56,57. Os tumores p53-nulos recapitularam diferentes subtipos de tumores humanos.

A combinação de modelos PDX e GEMM transplantável fornece ferramentas pré-clínicos valiosas para investigar a biologia do tumor de mama, a resposta a medicamentos e a imunidade anti-tumor. No protocolo atual, é descrito um método de transplante ortotópico de fragmentos de tumor PDX e GEMM na almofada de gordura mamária do rato. Estes modelos são passíveis de passagens seriais e geralmente mantêm um fenótipo estável. Para mitigar o risco de deriva genética ou perda de heterogeneidade através de passagens ao longo do tempo, múltiplos fragmentos de tecido são criopreservados a cada passagem para transplante subsequente no caso de alterações biológicas ou morfológicas serem observadas ao longo do tempo29,58.

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Protocolo

Todos os protocolos de uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Os fragmentos tumorais, com cerca de1-2 mm de tamanho, são de estoque viávelmente congelado obtido do Xenoenxerto Derivado do Paciente e núcleo avançado de modelos In Vivo na Baylor College of Medicine.

1. Preparação de fragmentos de tumor mamário criopreservados para transplante

  1. Transfira o criovial com fragmentos tumorais de nitrogênio líquido para um banho de água de 37 °C.
  2. Agitar o criovial com um movimento ocasionalmente suave durante o descongelamento.
  3. Depois que o tecido for descongelado, tire o criovial do banho de água e misture por inversão suave.
  4. Seque do lado de fora do criovial e pulverize com 70% de etanol. Transfira para um capuz de biossegurança.
  5. Transfira os tecidos tumorais descongelados em um tubo cônico de 15 mL preenchido com 10 mL de meio águia modificada de Dulbecco (DMEM). Misture bem invertendo o tubo. Deixe que os fragmentos de tecido se acomodem na parte inferior do tubo.
  6. Aspire o supernatante e resuspend em 10 mL de DMEM frio. Misture bem invertendo o tubo. Deixe que os fragmentos de tecido se acomodem na parte inferior do tubo.
  7. Aspire o supernatante e resuspend em 10 mL de DMEM frio. Coloque o tubo no gelo.
    NOTA: O tecido está pronto para transplante.

2. Coleta e preparação de tumor mamário fresco para transplante

  1. Eutanize o rato portador de tumor de mama.
    NOTA: O hospedeiro PDX pode ser camundongos fêmeas SCID/Bege, NSG ou NRG enquanto no estudo atual são utilizados camundongos balb/c fêmeas com idade entre 3 e 5 semanas.
  2. Pulverizar a região tumoral do rato eutanizado com 70% de etanol.
    NOTA: Tente evitar o cabelo com a amostra de tumor que possa causar contaminação de fragmentos tumorais para criostoragem ou transplante.
  3. Com fórceps serrilhados para beliscar e levantar a pele ao redor do tumor, use uma tesoura para fazer uma incisão curta.
  4. Separe o tumor da pele com a tesoura para dissecar todo o tumor do rato hospedeiro. Corte qualquer tecido restante da almofada de gordura do rato da superfície externa do tumor. Coloque o tumor em um tubo cônico de 15 mL preenchido com 5 mL de DMEM frio.
    NOTA: Use tumores com um tamanho máximo de 1 cm de diâmetro, uma vez que tumores maiores provavelmente contêm núcleos necroses.
  5. Em uma capa de biossegurança, transfira o tumor dissecado para uma placa de Petri estéril de 10 cm contendo DMEM suficiente para evitar a secagem.
  6. Corte o tumor em fragmentos de 1 mm3 com bisturi ou lâmina sob condições assépticas.
    NOTA: O bisturi ou a lâmina devem ser expostos sob UV na capa de biossegurança por pelo menos 20 minutos antes do uso.
  7. Transfira os fragmentos tumorais para um tubo cônico de 15 mL cheio de DMEM frio. Coloque o tubo no gelo.
    NOTA: O tecido está pronto para transplante. Os fragmentos tumorais dissecados da etapa 2.4 podem ser, 1) snap congelados em nitrogênio líquido para extração de proteína e RNA/DNA, 2) fixada com 4% de paraformaldeído (PFA) ou 10% de formalina tamponada neutra (NBF) para hematoxilina e eosina (H&E) e análise imunohistoquímica (IHC), ou 3) criopreservada em meio de congelamento de 1,25 mL (10% de sulfoxida de dimetil [DMSO], 40% DMEM e 50% soro bovino fetal [FBS], congelando lentamente em um congelador de -80 °C durante a noite e depois transferindo para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

3. Prepare o animal para a cirurgia

  1. Para o manejo da dor animal, injete subcutâneamente a liberação sustentada da buprenorfina 60 min antes da cirurgia em uma dose de 1 mg/kg ou siga o guia da instituição para 72h de cobertura analgésica.
  2. Montar o conjunto cirúrgico de acordo com as diretrizes institucionais para cirurgias assépticas.
  3. Anestesia uma fêmea de 4 semanas em uma câmara de indução da máquina de anestesia isoflurane à taxa de ~11,25 mL/h. Transfira o rato para a área de procedimento, para a placa de cirurgia estéril (borracha de silicone), onde receberá anestesia através de uma pequena máscara facial. Coloque o rato de costas e grave as pernas em suas posições naturais.
    NOTA: SCID/Bege, NSG ou NRG são usados para PDX e Balb/c é usado para modelos de transplante GEMM.
  4. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.
  5. Confirme o nível apropriado de sedação por aperto de dedo do dedo.
    NOTA: Nenhuma resposta/movimento do animal indica que o animal está suficientemente anestesiado e pronto para cirurgia.
  6. Raspe o rato no abdômen inferior, especialmente na região em torno do quarto mamilo onde a cirurgia ocorrerá.
  7. Utilizando um movimento circular e começando no centro do local da cirurgia, trabalhe em direção às bordas externas com esfoliação cirúrgica povidone-iodo, seguido pela remoção de povidone-iodo com uma almofada de etanol isopropílico de 70%. Repita duas vezes adicionais.

4. Transplante de fragmentos tumorais na quarta almofada de gordura mamária (inguinal)

  1. Use uma cortina cirúrgica estéril para cobrir o corpo do animal, exceto o local da incisão.
    NOTA: Confirme o nível adequado de sedação por aperto de dedo do dedo antes de fazer a incisão.
  2. Usando fórceps serrilhados beliscam e levantam a pele no mamilo #4.
  3. Com o lado contundente para baixo, use a tesoura para fazer uma incisão de parasagittal curta, do mamilo #4 em direção à cabeça.
  4. Utilizando um aplicador de ponta de algodão, separe a pele do peritônio no lado medial da incisão.
  5. Enquanto segura o lado lateral da incisão, retire delicadamente a almofada de gordura mamária #4 da pele usando o mesmo cotonete.
  6. Uma vez que a almofada de gordura é separada, fixe a pele com uma agulha de 27 G perto do corpo do animal.
  7. Se for experimentalmente necessário limpar a almofada de gordura do epitélio mamário do rato endógeno, execute as seguintes etapas.
    1. Usando as fórceps serrilhadas, estenda suavemente a almofada de gordura para longe do corpo e localize o linfonodo inguinal, que fica abaixo dos pontos de intersecção dos principais vasos da glândula (perto de onde os fórceps estarão segurando a glândula).
    2. Cauterize cuidadosamente os vasos medial para o linfonodo e a gordura juntando-se ao quarto e quinto blocos de gordura que formam uma área triangular.
      NOTA: Desligue temporariamente a fonte de oxigênio para esta etapa.
    3. Usando uma tesoura de micro dissecação, corte cada vaso cauterizado um de cada vez (para garantir que não haja sangramento após cada corte) até que a seção da almofada de gordura que contém o linfonodo seja removida.
    4. Descarte o tecido "limpo" da almofada de gordura.
  8. Segure a quarta almofada de gordura mamária usando fórceps de separação sem cortes. Por outro lado, insira a ponta fechada dos fórceps finos angulares no meio da almofada de gordura acima do vaso restante e perto da parede do peritônio. Abra lentamente as fórceps para fazer um pequeno bolso. Remova os fórceps finos angulares da almofada de gordura.
  9. Usando as fórceps finas angulares, pegue um pedaço de fragmento do tumor e insira-o no bolso.
  10. Abra lentamente as pontas dos fórceps para liberar o fragmento do tumor no bolso da almofada de gordura.
  11. Retire cuidadosamente os fórceps finos angulares.
    NOTA: Olhe para o bolso para confirmar que o fragmento do tumor permanece no bolso da almofada de gordura mamária ao retirar os fórceps. Tumores podem ser implantados em ambas as almofadas de gordura contralateral quando o excesso de tecido tumoral é necessário para experimentos ou bancos. Animais com transplantes de dupla mão não são recomendados para estudos de tratamento devido a interações conhecidas entre tumores contralaterais. Alternativamente, um dispositivo trocarte pode ser usado para o processo de implantação.
  12. A partir da base da incisão, colete a pele de cada lado usando a garra e fórceps serrilhados. Recomponha os dois lados e levante ligeiramente para preparar a pele para a aplicação do clipe da ferida. Uncurl as bordas da incisão com as garras fórceps e aperte as bordas juntas para formar uma superfície contínua no topo.
  13. Segurando os dois lados junto com fórceps serrilhados, use o aplicador do clipe da ferida para colocar um clipe de ferida no centro da incisão. Se necessário, aplique o adesivo de tecido nas extremidades da incisão, a fim de mantê-los fechados e protegidos.
  14. Coloque o animal em uma gaiola limpa que está em uma superfície de aquecimento. Monitor para sangramento, sinais de deshiscência e dor durante o período pós-cirúrgico. O animal deve estar se movendo em minutos após a cirurgia.
  15. Preste muita atenção ao local da incisão e à saúde geral dos animais por pelo menos 3 dias após a cirurgia. Siga as diretrizes institucionais para o tratamento da dor.
  16. Limpe as ferramentas cirúrgicas por 10 s em um esterilizador de contas de vidro antes de continuar com o próximo transplante. Aguarde que as ferramentas esfriem antes de usar.
  17. Repita os passos 4.1-4.15 até que todos os camundongos sejam transplantados.
    NOTA: A suplementação de estrogênio é necessária para tumores ER+, que podem ser fornecidos através de água ou pelotas de liberação lenta59.

5. Monitorando o crescimento do tumor em resposta ao tratamento medicamentoso

NOTA: Tumores palpáveis de PDXs transplantáveis estabelecidos e tumores p53-nulos levam entre 2 semanas e 8 semanas para se desenvolver após a cirurgia, dependendo das taxas intrínsecas de crescimento do tumor.

  1. Meça tumores em duas dimensões usando pinças duas vezes por semana. Calcule o volume usando a fórmula:
    Volume do tumor (mm3) = W2 x L/2
    onde W é largura e L é o comprimento do tumor.
  2. Inicie o tratamento medicamentoso quando o volume do tumor atingir 150-300 mm3.
    NOTA: Dependendo da propriedade dos medicamentos, pode-se usar gavage oral ou injeção intraperitoneal para o parto dos medicamentos.
  3. Coletar amostras de tumores e realizar a coloração de IHC60,isolamento de proteína e RNA/DNA e fenotipagem imunológica61 para vários propósitos. Coletar sangue e realizar fenotipagem imunológica ou usá-lo para estudos farmacocinéticos/farmacodinâmicos.

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Resultados

A Figura 1 mostra os equipamentos (Figura 1A) e procedimentos-chave(Figura 1B) de transplante ortotópico. A Figura 2 mostra a caracterização de um tumor PDX transplantado (MC1). Fragmentos tumorais (1 mm3) do modelo MC1 foram transplantados na almofada de gordura #4 de camundongos SCID/Bege. Um mês depois, o tamanho médio do t...

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Discussão

Para reduzir as variações no crescimento do tumor entre os animais, é fundamental cortar o tecido tumoral em fragmentos de 1 mm3 para transplante. Modelos que crescem tecido mole são mais difíceis de trabalhar e os fragmentos tumorais precisam ser cortados ligeiramente maiores (1−2 mm3). Ao colocar o tecido no bolso da almofada de gordura mamária tome cuidado para não dividir o tecido em vários pedaços, pois isso resultará em múltiplos tumores pequenos ou tumores de forma estranha.

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Divulgações

A MTL é fundadora de um parceiro limitado na StemMed, Ltd. e fundadora e gerente da StemMed Holdings, sua sócia geral. A MTL é fundadora e detentora de ações na Tvardi Therapeutics, Inc. LED é uma funcionária compensada da StemMed, Ltd.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R37CA228304 e R01HL146642 a Xi Chen, CA148761 para Jeffrey M. Rosen), Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-19-1-0524 para Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 para Xiangdong Lv), American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE para Xi Chen) e Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award to Xi Chen), o Núcleo de Modelos Derivados do Paciente e Avançado In Vivo na Baylor College of Medicine (financiamento do RP170691 CPRIT Core Facility Award e NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mg/mL de buprenorfina-SRZooPharm (via veterinários BCM)Seringa estéril
26GBD148232E
Esfoliante BetadineFisher19-027132
CotonetesVWR International Laboratory89031-272DMEM estéril
FisherMT 10-013-CMElétrico estéril
barbeadorOster78005-050
Esterilizador de contas de vidro (Germinador)Roboz Surgical StoreDS-401
Lubrificante pomada oftálmicaAkorn Animal Health17478-062-35
Micro Dissecação Fórceps; Serrilhado, Angular (fórceps regular)Roboz Surgical StoreRS-5139Tesoura
de mola de micro dissecação estéril (cortador de almofada de gordura)Roboz Surgical StoreRS-5658BT
Micro fórceps estéril (fórceps de colocação de tecido)Roboz Surgical StoreRS-5069Placa de Petri estéril
Fisher08-757- 100DEstéril
Campo estérilSai Infusion TechnologyPSS-SD1estéril
Roboz Surgical StoreRS-5960estéril
Fórceps (pinça de garra)Roboz Surgical StoreRS-5158de ferida estéril
BD Autoclip Wound System01-804Removedor de clipe de ferida estéril
BD Autoclip Wound System01-804-15Estéril
Clipes de feridaBD Autoclip Wound System01-804-5Estéril
estéril Tesoura de cirurgia Tecido Aplicador de clipe

Referências

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