Summary
एक प्रोटोकॉल के लिए afferent लसीका जहाजों की शल्य चिकित्सा suturing द्वारा लिम्फ प्रवाह ब्लॉक करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है ।
Abstract
लिम्फ नोड्स (एलएन) को निकालने के लिए एंटीजन, साइटोकिन्स और कोशिकाओं को परिवहन करके ऊतक द्रव संतुलन को बनाए रखने और प्रतिरक्षा सुरक्षा को अनुकूलित करने में लिम्फेटिक जहाज महत्वपूर्ण हैं। लिम्फिक जहाजों के कार्य का अध्ययन करते समय लिम्फ प्रवाह में रुकावट एक महत्वपूर्ण विधि है। मुरीन फुटपैड से पॉपलाइटल लिम्फ नोड्स (पीएलएन) तक के अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों को पीएलएन में लिम्फ ड्रेनेज के लिए एकमात्र मार्गों के रूप में अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है। इन अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों को चुनिंदा रूप से पीएलएन के प्रवाह को रोका जा सकता है। यह विधि एलएन, अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों, साथ ही क्षेत्र के आसपास अन्य लिम्फेटिक जहाजों में लिम्फिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को न्यूनतम क्षति के साथ लिम्फ प्रवाह में हस्तक्षेप की अनुमति देती है। इस विधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एलएन में उच्च एंडोथेलियल वेणुओं (एचईवी) और केमोकीन अभिव्यक्ति को कैसे प्रभावित करता है, और कार्यात्मक लिम्फेटिक जहाजों के अभाव में एलएन के आसपास के एडीपोज ऊतक के माध्यम से लिम्फ कैसे बहता है। लिम्फेटिक फ़ंक्शन के महत्व की बढ़ती मान्यता के साथ, इस विधि में एलएन माइक्रोएनवायरमेंट और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में लिम्फेटिक जहाजों के कार्य को आगे जानने के लिए व्यापक अनुप्रयोग होंगे।
Introduction
लिम्फेटिक प्रणाली का स्थानिक संगठन अतिरिक्त तरल पदार्थ और परिवहन एंटीजन और एंटीजन-पेश कोशिकाओं (एपीसीएस) को सूखा एलएन में कुशलतापूर्वक हटाने के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक समर्थन प्रदान करता है। प्रारंभिक लिम्फेटिक जहाजों (जिसे लिम्फेटिक केशिकाएं भी कहा जाता है) उनके असतत अंतरकोशिकीय जंक्शनों के कारण अत्यधिक पारमीय होते हैं, जो आसपास के बाह्य स्थानों1से तरल पदार्थ, कोशिकाओं और अन्य सामग्रियों के प्रभावी संग्रह की सुविधा प्रदान करते हैं। प्रारंभिक लिम्फेटिक जहाजों को लिम्फेटिक जहाजों को इकट्ठा करने में विलय होता है, जिनमें तंग इंटरसेलुलर जंक्शन, एक निरंतर तहखाने झिल्ली और लिम्फेटिक मांसपेशी कवरेज होता है। लिम्फेटिक जहाजों को इकट्ठा करना एकत्रित लिम्फ को ड्रेनिंग एलएन तक पहुंचाने और अंततः लिम्फ को संचलन2,3में लौटने के लिए जिम्मेदार है। लिम्फ को निकालने वाले एलएन में लिम्फ को प्रेरित करने वाले लिम्फेटिक जहाजों का संग्रह 4 ,5,6, 7 , 5,7हैं । एफेरेंट लिम्फेटिक जहाजों की बाधा एलएन में लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध कर सकती है, जो लिम्फ प्रवाह के कार्य का अध्ययन करते समय एक उपयोगी तकनीक है।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि लिम्फ प्रवाह एंटीजन और एपीसीएस के परिवहन के साथ-साथ एलएन होओस्टेसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह अच्छी तरह से समझा जाता है कि ऊतक-व्युत्पन्न एपीसी, आमतौर पर माइग्रेट डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को सक्रिय करते हैं, टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए एलएन में एफेरेंट लिम्फेटिक जहाजों के माध्यम से यात्रा करते हैं8। विचार है कि मुक्त फार्म एंटीजन, जैसे रोगाणुओं या घुलनशील एंटीजन, निष्क्रिय एलएन निवासी APCs को सक्रिय करने के लिए एलएन के लिए लिम्फ के साथ प्रवाह पिछले एक दशक में स्वीकृति प्राप्त कर रहा है9,10,11,12। लिम्फ के साथ यात्रा करने वाले फ्री-फॉर्म एंटीजन एलएन की यात्रा करने के लिए संक्रमण के बाद मिनट लेते हैं, और एलएन-निवासी सेल सक्रियण उत्तेजना के बाद 20 मिनट के भीतर हो सकता है। यह पलायन डीसी की सक्रियता से बहुत तेज है, जो निकासी एलएन9में प्रवेश करने के लिए 8 घंटे से अधिक समय लेता है। प्रतिरक्षा सुरक्षा शुरू करने के लिए एंटीजन के परिवहन के अलावा, लिम्फ अपने माइक्रोएनवायरमेंट को बनाए रखने के लिए एलएन में साइटोकिन्स और डीसी भी रखता है, और प्रतिरक्षा सेल होमोस्टेसिस13, 14का समर्थन करता है। इससे पहले, लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करके, अफ़रीद लिम्फिक जहाजों को रोककर यह दर्शाया गया था कि एलएन15, 16, 17को होमोस्टैटिक टी सेल और बी सेल होमिंग का समर्थन करने के लिए आवश्यक एचईवी फेनोटाइप को बनाए रखने के लिए लिम्फ की आवश्यकता होती है। सीसीएल21 एक महत्वपूर्ण केमोकी है जो एलएन 8,18में डीसी और टी सेल की स्थिति का निर्देशदेताहै। लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने से एलएन में सीसीएल21 अभिव्यक्ति में बाधा उत्पन्न होती है और एलएन19में डीसी और टी सेल पोजिशनिंग और/या बातचीत में संभावित रूप से व्यवधान डालता है । इस प्रकार, लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने से एलएन माइक्रोएनवायरमेंट को बाधित करके ड्रेनिंग एलएन तक प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से एंटीजन/डीसी पहुंच को समाप्त किया जा सकता है जो एलएन में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है । लिम्फ प्रवाह के कार्य की बेहतर जांच करने के लिए, एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है(चित्रा 1)चूहों में लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए फुटपैड से पीएलएन तक अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों को सुटरिंग करके। यह विधि स्वस्थ और रोगग्रस्त परिस्थितियों में लसीका कार्य पर भविष्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक हो सकती है।
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Protocol
सभी पशु कार्य को संस्थागत और सरकारी नैतिकता और पशु हैंडलिंग समिति द्वारा अनुमोदित किए जाने की आवश्यकता है । यह एक गैर-जीवित सर्जरी है।
1. सामग्री की तैयारी
- 100 मिली इथेनॉल के 70 एमएल को 30 एमएल बाँझ पानी के साथ मिलाकर 70% इथेनॉल तैयार करें। सर्जरी से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें और नसबंदी बनाए रखने के लिए सर्जरी से पहले और उसके दौरान 70% इथेनॉल में उपकरण रखें।
- एक इंजेक्शन उपकरण तैयार करें।
- पॉलीथीन ट्यूबिंग के ~ 30 सेमी (व्यास में 0.28 मिमी) कट। पॉलीथीन ट्यूबिंग के एक छोर से 30 जी x 1/2 सुई (सुई ए) की नोक को कनेक्ट करें। ध्यान से एक और 30 जी x 1/2 सुई (सुई बी) उखाड़ फेंकना और पॉलीथीन ट्यूबिंग के दूसरे छोर से टूटे हुए पक्ष को कनेक्ट करें ।
- सुई ए को 1 एमएल ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज से अटैच करें।
नोट: इस पॉलीथीन ट्यूबिंग के लिए, ट्यूबिंग में 1.6 सेमी तरल पदार्थ 1 माइक्रोन20से मेल खाता है।
- नमकीन (बैक्टीरियोस्टैटिक ०.९% [w/v] सोडियम क्लोराइड) में 10:1 केटामाइन/जाइलाज़ीन मिश्रण (10 मिलीग्राम/एमएल केटामाइन और 1 मिलीग्राम/एमएल जाइलाज़ीन) तैयार करें । उपयोग से पहले समाधान को ताजा तैयार करें।
2. सर्जरी के लिए जानवर की तैयारी
नोट: 6−10 सप्ताह की आयु के चूहों का उपयोग करें। महिला और पुरुष चूहों दोनों का उपयोग किया जा सकता है। इस अध्ययन में 6−10 सप्ताह पुराने C57BL/6 मादा चूहों का इस्तेमाल किया गया । इस विधि को चूहों के अन्य उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
- केटामाइन/जाइलाज़ीन मिश्रण के 250 माइक्रोल इंजेक्ट करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। माउस पूरी तरह से सो रहा है जब तक रुको। सुनिश्चित करें कि माउस पूर्ण एनेस्थेटाइजेशन का पता लगाने के लिए एक अंगुली चुटकी पर प्रतिक्रिया नहीं करता है।
- बालों की कतरनी के साथ पैरों के चारों ओर फर दाढ़ी।
- पैर के चारों ओर डिपिलेटरी क्रीम लगाएं और 5 मिनट तक इंतजार करें। अवशिष्ट फर और डिपिलेटरी क्रीम को नम ऊतक का उपयोग करके मिटा दें और बाँझ पानी से पैर को साफ करें। ऑपरेटिंग क्षेत्र को निष्फल करने के लिए पैर के चारों ओर 70% इथेनॉल स्प्रे करें। इथेनॉल चीरा साइट तक ही सीमित है।
3. अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों की सर्जिकल टांका
नोट: दाहिने पैर sutured है, और बाएं पैर नकली नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । लिम्फेटिक सीवन प्रोटोकॉल (चरण 3.1−3.8) 20−30 मिनट लेता है।
- माउस को एक प्रवण स्थिति में रखें और दाहिने पैर पर ऑपरेशन क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए सर्जिकल टेप के साथ इसे ठीक करें।
- इंट्राडरमैली 1% इवांस ब्लू डाई या इंजेक्शन उपकरण के तरल पदार्थ के 9 सेमी फुटपैड में टयूबिंग के 5 माइक्रोन इंजेक्ट। धीरे से पैर के पैड की मालिश करने में मदद इवांस नीले लसीका जहाजों में प्रवेश ।
नोट: इंसुलिन सिरिंज छोटे मात्रा इंजेक्शन के लिए नियंत्रित करने के लिए आसान नहीं है। इंजेक्शन उपकरण का उपयोग करके मात्रा को अधिक सटीक रूप से नियंत्रित किया जा सकता है। त्वचा के नीचे नीले रंग से लिम्फेटिक जहाजों की कल्पना की जाती है। व्यापक प्रशिक्षण के साथ, दोनों अफरंतवादी लिम्फेटिक जहाजों को सैफेनस धमनी के समानांतर, आदिपोस ऊतक में पारदर्शी जहाजों के रूप में नग्न आंखों के साथ देखा जा सकता है। व्यापक प्रशिक्षण के साथ, उन मामलों में इवांस ब्लू डाई इंजेक्शन के बिना जहाजों को सीवन करना संभव है जहां डाई से संभावित गड़बड़ी की चिंताएं हैं। - एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, पॉपलाइटल फॉसा के निचले किनारे से 5 मिमी एक चीरा साइट चुनें। कैंची के साथ त्वचा में एक छोटा सा चीरा (~ 5 मिमी) बनाओ। ठीक ऑपरेशन संदंश का उपयोग करना, चीरा खिंचाव, और इकट्ठा लसीका जहाजों(चित्रा 1A) कापर्दाफाश ।
नोट: यदि आवश्यक हो, तो लिम्फेटिक जहाजों को बेनकाब करने के लिए त्वचा के एक छोटे टुकड़े को हटाया जा सकता है। - विच्छेदन माइक्रोस्कोप(चित्रा 1B)के तहत पीएलएन के लिए अग्रणी दोनों अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों की पहचान करें।
नोट: फुटपैड से पीएलएन तक दो अफरेंट लिम्फेटिक जहाज हैं। दोनों को लिम्फ प्रवाह को पूरी तरह से ब्लॉक करने के लिए sutured की जरूरत है । - सुई धारक का उपयोग करके, सावधानी से एफेरेंट लिम्फेटिक पोत और सैफेनस धमनी के बीच सीवन सुई (0.7 मीट्रिक या छोटे) डालें और सुई को धीरे-धीरे अफरेंट लिम्फेटिक पोत के चारों ओर खींचें। धीरे-धीरे सीवन स्ट्रिंग खींचें और सीवन स्ट्रिंग के लगभग 2 सेमी पीछे छोड़ दें। एक सर्जन की गांठ(चित्रा 1C)के साथ एक लसीका पोत सीवन के लिए स्ट्रिंग को कसकर बांधने में मदद करने के लिए सुई धारक का उपयोग करें।
नोट: चीरा के नीचे ऊतक हवा के लिए लंबे समय तक जोखिम के साथ बाहर सूख सकता है । चीरा को यथासंभव छोटा बनाना और सीवन को जल्दी से करना (यानी, 5 मिनट के भीतर) ऊतक को सूखने से रोकदेगा। कपास झाड़ू के साथ नमकीन की एक छोटी मात्रा को लागू करके ऊतक नमी बनाए रखें। - धीरे से फुटपैड मालिश सुनिश्चित करने के लिए कोई इवांस ब्लू डाई सीवन साइट गुजरता है और फिर कैंची के साथ अतिरिक्त स्ट्रिंग काट ।
- अन्य एफेरेंट लिम्फेटिक पोत(चित्रा 1D)पर एक ही सीवन चरण (यानी, चरण 3.5 और 3.6) करें। एक ही सीवन है कि कदम ३.५(चित्रा 1E)में जहाजों सीवन के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ त्वचा चीरा बंद करो ।
- नकली नियंत्रण के लिए, इंट्राडरमली बाएं फुटपैड पर 1% इवांस ब्लू डाई के 5 माइक्रोन इंजेक्ट करें और लिम्फेटिक जहाजों की कल्पना करने के लिए फुटपैड की मालिश करें। त्वचा को एक उत्तेजना के साथ खोलें और फिर पोत(चित्रा 1F)को खोले बिना घाव को बंद कर दें।
- वैकल्पिक रूप से, 2−4 घंटे के लिए संचालित चूहों की निगरानी करें। पैर के सीवन पक्ष को इवांस ब्लू के साथ एडिमा दिखाना चाहिए जो जांघ में फैल गया है, जबकि कंट्रोल लेग फुटपैड में प्रतिबंधित इवांस ब्लू डाई दिखाएगा । यदि चूहों को जगाने, एक अतिरिक्त केटामाइन/जाइलाज़ीन मिश्रण इच्छामृत्यु तक एनेस्थेटाइज्ड रखने के लिए इंजेक्शन दिया जाएगा ।
4. लिम्फ प्रवाह की ट्रैकिंग
- सर्जरी के तुरंत बाद, इंट्राडरमैली नियंत्रण और लिम्फेटिक सुटर्ड पैर दोनों के फुटपैड में 2% फ्लोरोसेइन आइसोथियोसाइनेट (फिटसी) के 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
- चूहों को केटामाइन/जाइलाज़ीन मिश्रण के 400 माइक्रोन के साथ इच्छामृत्यु दें और चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड होने पर सर्वाइकल डिस्लोकेशन करें।
- पॉपलाइटल फॉसा से पीएलएन ्स को इकट्ठा करें और फिटसी इंजेक्शन के बाद 2, 6 और 12 घंटे में विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पीएलएन के चारों ओर पेरि नोडल एडीपोस ऊतक को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक(चित्रा 1जी, एच)में क्रायोमोल्ड के पक्ष में सामना कर रहे मेडुलरी साइनस क्षेत्र के साथ पीएलएन एम्बेड करें।
- क्रायोटोम का उपयोग करके 20 माइक्रोन जमे हुए अनुभाग तैयार करें।
- फिटसी वितरण निर्धारित करने के लिए एक कन्मोसिकल माइक्रोस्कोप के तहत क्रायोसेक्शन छवि।
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Representative Results
लिम्फेटिक पोत सीवन का उपयोग पिछले अध्ययनों में15,16,17, 19का किया गया है, जहां इसने लिम्फेटिक जहाजों के आणविक जीवविज्ञान को बेहतर ढंग से समझा जाने से पहले लिम्फ प्रवाह के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य किया। लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने से एलएन होमोस्टेसिस बाधित होता है, जिससे एचईवी को एलएन15, 16, 17के लिए इष्टतम लिम्फोसाइट होमिंग के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण जीन अभिव्यक्ति खोने की ओरजाताहै। तब से, यह प्रदर्शित करने में एक और दो दशक लग गए कि लिम्फ के साथ यात्रा करने वाले डीसी एचईवी जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल को बनाए रखने में महत्वपूर्ण हैं और एलएन13से होमिंग लिम्फोसाइट्स। लिम्फ प्रवाह द्वारा प्रदान किया गया कतरनी तनाव एलएन में केमोकीन अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एलएन19में लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने से केमोकाइन सीसीएल21 अभिव्यक्ति बाधित होती है, जो एलएन में डीसी और टी सेल पोजिशनिंग को निर्देशित करने में महत्वपूर्ण है। इसलिए, बाधित प्रवाह एलएन 8,18में डीसी और टी कोशिकाओं की स्थिति से समझौता कर सकता है ।
सर्जरी के तुरंत बाद, लिम्फ प्रवाह को ट्रैक करने के लिए एक छोटे आणविक वजन फ्लोरोसेंट ट्रेसर, फिटसी का उपयोग किया गया था। फिटसी (2% फिटसी के 10 माइक्रोन) को नकली नियंत्रण और लिम्फेटिक सट्रेड लेग के फुटपैड में इंट्राडरमैली इंजेक्ट किया गया था। बाद में 2, 6 और 12 घंटे की निकासी की गई। निकासी पीएलएन अक्टूबर में एम्बेडेड थे, और 20 माइक्रोन जमे हुए वर्गों को तैयार किया गया था। कॉन्फोकल छवियों ने सीवन के बाद पीएलएन में फिटसी संचय को काफी कम दिखाया। पीएन में अवशिष्ट फिटसी को एलएन साइनस(चित्रा 2)में अधिमानतः संचित किया गया था।
कैसे लिम्फ एलएन आसपास के एडीपोज ऊतक के माध्यम से बहती है लसीका सीवन का उपयोग कर जांच की गई थी । पीएलएन के लिए अग्रणी अफ़रीद लिम्फेटिक जहाजों को लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए सुस्त किया गया था, और यह निर्धारित किया गया था कि पेरि नोडल एडीपोज ऊतक लिम्फ प्रवाह की एक छोटी मात्रा का समर्थन कर सकता है जब लिम्फेटिक जहाजों को21अवरुद्ध किया गया था। एलएन के कैप्सूल के लिए एडीपोज ऊतक के माध्यम से लिम्फ प्रवाह को मैप किया गया था; यह एलएन साइनस में खिलाने के लिए दिखाई दिया। लिम्फ की छोटी मात्रा समय के साथ एलएन साइनस में प्रवाहित हो सकती है(चित्रा 3)।
चित्रा 1: पॉपलाइटल एलएन (पीएन) के चरण, लिम्फेटिक पोत सीवन। संक्षेप में, चूहों को केटामाइन और जाइलाज़ीन मिश्रण के साथ एनेस्थेटाइज्ड करने के बाद, उनके पैरों को मुंडा दिया गया था, और अवशिष्ट फर को एक डिपिलेटरी क्रीम द्वारा हटा दिया गया था। दाहिने पैर सीवन के लिए इस्तेमाल किया गया था और बाएं पैर नकली नियंत्रण था । फुटपैड के दाईं ओर PBS में तैयार 1% इवांस ब्लू डाई के 5 माइक्रोन के साथ इंट्राडरमैली इंजेक्शन लगाया गया था । (क)फुटपैड की धीरे-धीरे मालिश करके इवांस ब्लू डाई ने अफरेंडेंट लिम्फेटिक जहाजों को भर दिया । (ख)लिम्फेटिक जहाजों को बेनकाब करने के लिए पीएन से 5 मिमी दूर एक छोटी त्वचा कटौती की गई, जो दो सफेद तीरों द्वारा इंगित की जाती है । (C,D) दोनों अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों को सुस्त किया गया । (ङ)स्किन एक्सीशन को टांके लगाकर बंद कर दिया गया था। (च)नियंत्रण पैर को लिम्फेटिक जहाजों को टांका लगाए बिना इवांस ब्लू इंजेक्शन, स्किन एक्सिक्शन और सीवन क्लोजर मिला । (जी)लिम्फ फ्लो ब्लॉकेज की सफलता इवांस ब्लू डाई द्वारा इंगित की गई थी, जो नियंत्रण पैर के पीएन में प्रवेश कर गई थी लेकिन सुसर्टेड लेग नहीं ।(एच, I)एकत्र pLNs अक्टूबर कंपाउंड में सबकैप्सुलर साइनस (SCS) और मेडुलरी साइनस (एमएस) के साथ साफली नाइट्रोजन में ठंड स्नैपिंग से पहले सामना करना पड़ रहा था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: नकली या सुटर पैर के निकासी पीएलएन में फिटसी वितरण। फिटसी इंजेक्शन के बाद पीएलएन की कन्फोकल छवियों ने 2, 6 और 12 घंटे एकत्र किए, जिससे सीवन के बाद पीएलएन में फिटसी संचय में काफी कमी आई। पीएन में अवशिष्ट फिटसी को एलएन साइनस में अधिमानतः पाया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: पेरि नोडल एडीपोज ऊतक (पीएटी) में फिटसी वितरण, नकली या सुटर पैर के निकासी वाले पीएलएन के आसपास। पैट और एलएन की कन्फोकल छवियों से पता चला है कि फिटसी पैट और एलएन साइनस में प्रवेश करती है लेकिन जब लिम्फेटिक जहाजों को अवरुद्ध किया गया तो पूरे एलएन में प्रभावी रूप से वितरित नहीं किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने से स्वस्थ और रोगग्रस्त परिस्थितियों में एलएन को एंटीजन डिलीवरी में हेरफेर करने में व्यापक अनुप्रयोग होंगे। यह अध्ययन करने के लिए एंटीजन डिलीवरी के समय को नियंत्रित करने के लिए इस विधि का उपयोग करना संभव है कि कैसे निरंतर लिम्फ प्रवाह एलएन को निकालने में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को नियंत्रित करता है। लिम्फ प्रवाह व्यवधान की इस विधि का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है कि एलएन में सेल कंपार्टमेंटेशन, सेल एक्टिवेशन, सेल माइग्रेशन और सेल-सेल इंटरैक्शन को कैसे प्रभावित करता है।
चूहों विशेष रूप से अपने लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं(Flt4-cre-dtr)में मानव डिप्थीरिया विष रिसेप्टर (DTR) व्यक्त विकसित किया गया है; ये विशेष रूप से लिम्फेटिक वेसल्स को कम करने के लिए लिम्फेटिक फंक्शन22का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . डीटी का प्रशासन लिम्फेटिक जहाजों और एलएन में लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को मारता है। लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की कमी लिम्फेटिक फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए क्षेत्रीय या व्यवस्थित रूप से लिम्फ प्रवाह को पूरी तरह से निरस्त कर सकती है। यह विधि ऊतक में महत्वपूर्ण तरल पदार्थ संचय का कारण बनती है और लिम्फेडेमा और लिम्फेटिक फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक महान मॉडल के रूप में कार्य करती है।
लिम्फेटिक एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट डीटीआर अभिव्यक्ति मॉडल की तुलना में, लिम्फेटिक सीवन विधि का लाभ यह है कि यह लिम्फेटिक एंडोथेलियल कोशिकाओं या क्षेत्र के आसपास किसी अन्य लिम्फेटिक पोत को न्यूनतम क्षति के साथ लिम्फ प्रवाह को बाधित करता है। हस्तक्षेप सीधे निकासी एलएन में कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करता है, इसलिए एलएन माइक्रोएनवायरमेंट या प्रतिरक्षा कोशिका संचार पर परिणामस्वरूप प्रभाव डीटी द्वारा प्रेरित संभावित सेल मृत्यु के बजाय लिम्फ प्रवाह नाकाबंदी का परिणाम है। इस विधि का एक और लाभ यह है कि लिम्फ प्रवाह तुरंत सर्जरी के बाद अवरुद्ध है, तो लिम्फ प्रवाह नाकाबंदी के समय बेहतर नियंत्रित किया जा सकता है ।
इस विधि की सीमा यह है कि इसका उपयोग केवल फुटपैड से पीएलएन तक एफेरेंट लिम्फेटिक जहाजों में लिम्फ प्रवाह के क्षेत्रीय हस्तक्षेप का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि को इकट्ठा करने वाले लिम्फेटिक जहाजों के सटीक स्थान की पहचान की आवश्यकता है। लिम्फेटिक जहाजों को इकट्ठा करना कुछ शारीरिक स्थानों में पहचानना मुश्किल है, और इस प्रकार इस तकनीक को लिम्फ प्रवाह को अवरुद्ध करने के लिए अफरेंट लिम्फेटिक जहाजों की सफल पहचान से पहले व्यापक शारीरिक और शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। एक और सीमा यह है कि यह विधि सीधे लिम्फ को प्रारंभिक लिम्फेटिक जहाजों में प्रवेश करने से रोक नहीं सकती है। सीवन के बाद, अवरुद्ध लिम्फ प्रवाह मध्यवर्ती तरल पदार्थ दबाव को बढ़ा सकता है और प्रारंभिक लिम्फेटिक जहाजों में लिम्फ प्रवाह दिशा को बदल सकता है। इस प्रकार, क्षेत्र के आसपास बरकरार लिम्फेटिक जहाजों बाधित लसीका जहाजों के कार्य के लिए क्षतिपूर्ति और लिम्फ प्रवाह की दिशा बदल सकते हैं।
इसके अलावा, इवांस ब्लू डाई का इंजेक्शन इंटरस्टिशियल फ्लूइड प्रेशर को बढ़ाता है, जो बाद में ट्रेसर या एंटीजन इंजेक्शन में हस्तक्षेप कर सकता है। इवांस ब्लू डाई का ऑटोफ्लोरेसेंस इम्यूनोफ्लोर्सेंट स्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य फ्लोरोसेंट ट्रेसर्स या अन्य फ्लोरोफोरस के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। इवांस ब्लू डाई और संभावित एंटीजन, अन्य ट्रेसर, या लसीका समारोह विनियमन के संभावित आणविक तंत्र के बीच किसी भी बातचीत से बचने के लिए, नग्न आंखों के साथ इवांस ब्लू डाई के बिना एकत्र लिम्फेटिक जहाजों की पहचान करना संभव है। यह जहाजों की पहचान करने के लिए व्यापक प्रशिक्षण के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इवांस ब्लू डाई को बदलने के लिए आइसोसल्फान ब्लू डाई जैसे अन्य रंगों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक पांडुलिपि के प्रूफरीडिंग के लिए शुक्रिया जरदिनेजाद का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर, पीजेटी-156035) और कनाडा फाउंडेशन फॉर इनोवेशन फॉर एसएल (32930) और नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना फॉर यूजिया लिन (81901576) द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
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