Summary
Viene presentato un protocollo per bloccare il flusso linfatico mediante sutura chirurgica di vasi linfatici afferenti.
Abstract
I vasi linfatici sono fondamentali per mantenere l'equilibrio dei fluidi tissutali e ottimizzare la protezione immunitaria trasportando antigeni, citochine e cellule ai linfonodi drenante (LN). L'interruzione del flusso linfatico è un metodo importante quando si studia la funzione dei vasi linfatici. I vasi linfatici afferenti dal pedana murina ai linfonodi poplitei (PLN) sono ben definiti come le uniche vie per il drenaggio linfatico nei PLN. Suturare questi vasi linfatici afferenti può prevenire selettivamente il flusso linfatico verso i PLAN. Questo metodo consente l'interferenza nel flusso linfatico con danni minimi alle cellule endoteliali linfatiche nel pLN drenante, nei vasi linfatici afferenti e in altri vasi linfatici intorno all'area. Questo metodo è stato utilizzato per studiare come la linfa influisce sulle alte venule endoteliali (HEV) e sull'espressione della chemiochina nella LN e su come la linfa fluisce attraverso il tessuto adiposo che circonda la LN in assenza di vasi linfatici funzionali. Con il crescente riconoscimento dell'importanza della funzione linfatica, questo metodo avrà applicazioni più ampie per svelare ulteriormente la funzione dei vasi linfatici nella regolazione del microambiente LN e delle risposte immunitarie.
Introduction
L'organizzazione spaziale del sistema linfatico fornisce supporto strutturale e funzionale per rimuovere in modo efficiente il fluido extracellulare e trasportare antigeni e cellule che presentano antigeni (APC) nelle LN drenante. I vasi linfatici iniziali (chiamati anche capillari linfatici) sono altamente permeabili a causa delle loro giunzioni intercellulari discontinue, che facilitano l'efficace raccolta di fluidi, cellule e altri materiali dagli spazi extracellularicircostanti 1. I vasi linfatici iniziali si fondono nella raccolta di vasi linfatici, che hanno strette giunzioni intercellulari, una membrana basale continua e una copertura muscolare linfatica. La raccolta dei vasi linfatici è responsabile del trasporto della linfa raccolta nelle LN drenante e, infine, del ritorno della linfa allacircolazione 2,3. I vasi linfatici di raccolta che spingono la linfa nella LN drenante sono i vasi linfatici afferenti4,5,6,7. L'ostruzione dei vasi linfatici afferenti può bloccare il flusso linfatico nelle LN, che è una tecnica utile quando si studia la funzione del flusso linfatico.
Studi precedenti hanno dimostrato che il flusso linfatico svolge un ruolo significativo nel trasporto di antigeni e APC, oltre a mantenere l'omeostasi LN. È ben noto che le APC derivate dai tessuti, tipicamente attivate dalle cellule dendritiche migratorie (IC), viaggiano attraverso i vasi linfatici afferenti fino alla LN per attivare le cellule T8. L'idea che gli antigeni in forma libera, come microbi o antigeni solubili, fluiranno passivamente con la linfa verso l'LN per attivare gli APC residenti in LN ha ottenuto l'accettazione nell'ultimo decennio9,10,11,12. Gli antigeni in forma libera che viaggiano con la linfa prendono minuti dopo l'infezione per viaggiare verso l'LN e l'attivazione cellulare residente in LN può verificarsi entro 20 minuti dopo la stimolazione. Questo è molto più veloce dell'attivazione dei PC di migrazione, che richiede più di 8 ore per entrare nell'LN9 drenante. Oltre a trasportare antigeni per avviare la protezione immunitaria, la linfa trasporta anche citochine e TC nella LN per mantenere il suo microambiente e sostenere l'omeostasi delle celluleimmunitarie 13,14. In precedenza, il blocco del flusso linfatico suturando i vasi linfatici afferenti ha dimostrato che la linfa è necessaria per mantenere il fenotipo HEV necessario per sostenere la cellula T omeostatica e l'homing cellulare B all'LN15,16,17. CCL21 è una chemiochina critica che dirige il posizionamento delle celle DC e T nell'LN8,18. Il blocco del flusso linfatico interrompe l'espressione CCL21 nell'LN e potenzialmente interrompe il posizionamento e/o l'interazione delle cellule DC e T nell'LN19. Pertanto, il blocco del flusso linfatico può abrogare direttamente o indirettamente l'accesso all'antigene /DC all'LN drenante interrompendo il microambiente LN che regola le risposte immunitarie nella LN. Per studiare meglio la funzione del flusso linfatico, viene presentato un protocollo sperimentale (figura 1) per bloccare il flusso linfatico nei topi suturando i vasi linfatici afferenti dal pLN al pLN. Questo metodo può essere una tecnica importante per futuri studi sulla funzione linfatica in condizioni sane e masticate.
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Protocol
Tutto il lavoro sugli animali deve essere approvato dal comitato istituzionale e governativo per l'etica e la gestione degli animali. Questo è un intervento di non sopravvivenza.
1. Preparazione dei materiali
- Preparare 100 mL di etanolo al 70% mescolando 70 mL di etanolo al 100% con 30 mL di acqua sterile. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico e mantenere gli strumenti in etanolo al 70% prima e durante l'intervento chirurgico per mantenere la sterilizzazione.
- Preparare un apparato di iniezione.
- Tagliare ~30 cm di tubi in polietilene (0,28 mm di diametro). Collegare la punta di un ago 30 G x 1/2 (ago A) a un'estremità del tubo di polietilene. Rimuovere con cura un altro ago da 30 G x 1/2 (ago B) e collegare il lato rotto all'altra estremità dei tubi in polietilene.
- Attaccare l'ago A a una siringa tubercocina da 1 ml.
NOTA: Per questo tubo di polietilene, 1,6 cm di fluido nel tubo corrispondono a 1 μL20.
- Preparare una miscela 10:1 chetamina/xiazina (10 mg/mL di ketamina e 1 mg/mL di xiazina) in salina (batteriostatica 0,9% [w/v] cloruro di sodio). Preparare la soluzione appena prima dell'uso.
2. Preparazione dell'animale per l'intervento chirurgico
NOTA: Utilizzare topi di età compresa tra 6 e 10 settimane. Possono essere utilizzati topi sia femmine che maschi. In questo studio sono stati usati topi femmine di 6−10 settimane, C57BL/6. Questo metodo può essere adattato per altri ceppi di topi.
- Anestetizzare il topo iniettando 250 μL della miscela chetamina/xiazina per via intraperitoneale. Attendere che il mouse sia completamente addormentato. Assicurarsi che il mouse non reagisca a un dito del dito per rilevare l'anestesia completa.
- Radere la pelliccia intorno alle gambe con le tosaerba.
- Applicare la crema depilatoria intorno alla gamba e attendere 5 minuti. Pulire la pelliccia residua e la crema depilatoria utilizzando un tessuto umido e pulire la gamba con acqua sterile. Spruzzare il 70% di etanolo intorno alla gamba per sterilizzare l'area operativa. L'etanolo è limitato al sito di incisione.
3. Sutura chirurgica di vasi linfatici afferenti
NOTA: La gamba destra è suturata e la gamba sinistra viene utilizzata come controllo fittizio. Il protocollo di sutura linfatica (passaggi 3.1−3.8) richiede 20−30 min.
- Mantenere il mouse in una posizione soggetta a protezione e fissarlo con nastro chirurgico per esporre l'area operativa sulla gamba destra.
- Iniettare intradermally 5 μL di 1% di colorante blu Evans o 9 cm del fluido dell'apparato di iniezione tubando nel pedane. Massaggiare delicatamente il pedana per aiutare Evans blu ad entrare nei vasi linfatici.
NOTA: La siringa per insulina non è facile da controllare per l'iniezione di piccolo volume. Il volume può essere controllato in modo più accurato utilizzando l'apparato di iniezione. I vasi linfatici sono visualizzati da colorante blu sotto la pelle. Con un ampio addestramento, entrambi i vasi linfatici afferenti possono essere visti ad occhio nudo come vasi trasparenti nel tessuto adiposo, parallelamente all'arteria safenosa. Con un ampio addestramento, è possibile suturare i vasi senza iniettare colorante Evans Blue nei casi in cui ci siano preoccupazioni di potenziali disturbi dal colorante. - Al microscopio sezionato, scegliere un sito di incisione a 5 mm dal bordo inferiore della fossa poplitea. Fai una piccola incisione (~ 5 mm) nella pelle con le forbici. Utilizzando forcep di funzionamento fine, allungare l'incisione ed esporre i vasi linfatici di raccolta (Figura 1A).
NOTA: Se necessario, un piccolo frammento di pelle può essere rimosso per esporre i vasi linfatici. - Identificare entrambi i recipienti linfatici afferenti che portano ai pLN al microscopio di sezionazione (figura 1B).
NOTA: Ci sono due vasi linfatici afferenti dal footpad al pLN. Entrambi devono essere suturati per bloccare completamente il flusso linfatico. - Utilizzando un portaaghi, inserire con cautela l'ago da sutura (0,7 metrico o più piccolo) tra il vaso linfaticofferente e l'arteria safenosa ed estrarre delicatamente l'ago intorno al vaso linfaticofferente. Tirare delicatamente la corda di sutura e lasciare circa 2 cm della corda di sutura alle spalle. Utilizzare il supporto dell'ago per legare saldamente la corda per suturare un vaso linfatico con un nodo del chirurgo (Figura 1C).
NOTA: Il tessuto sotto l'incisione può asciugarsi con esposizione prolungata all'aria. Rendere l'incisione il più piccola possibile ed eseguire rapidamente la sutura (cioè entro 5 minuti) impedirà al tessuto di asciugarsi. Mantenere l'umidità del tessuto applicando un piccolo volume di soluzione salina con un batuffolo di cotone. - Massaggiare delicatamente il footpad per assicurarsi che nessuna tintura Evans Blue passi il sito di sutura e quindi tagliare la corda in eccesso con le forbici.
- Eseguire gli stessi passaggi di sutura (cioè i passaggi 3.5 e 3.6) sull'altro vaso linfaticofferente(Figura 1D). Chiudere l'incisione cutanea con la stessa sutura utilizzata per suturare i vasi nel passaggio 3.5 (Figura 1E).
- Per il controllo fittizio, iniettare intradermally 5 μL di 1% di colorante blu Evans sul pedana sinistro e massaggiare il footpad per visualizzare i vasi linfatici. Aprire la pelle con un'escissione e quindi chiudere la ferita senza suturare il vaso (Figura 1F).
- Opzionalmente, monitorare i topi azionati per 2−4 h. Il lato sutura della gamba dovrebbe mostrare edema con Evans Blue diffuso alla coscia, mentre la gamba di controllo mostrerà una tinta blu Evans limitata nel footpad. Se i topi si risvegliano, verrà iniettato un ulteriore mix di ketamina/xiazina per mantenere l'anestesia fino all'eutanasia.
4. Tracciamento del flusso linfatico
- Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, iniettare intradermally 10 μL di isotiocianato di fluoresceina al 2% (FITC) nel footpad sia del controllo che della gamba suturata linfatica.
- Eutanasia i topi con 400 μL di miscela ketamina/xiazina ed eseguire la lussazione cervicale quando i topi sono completamente anestetizzati.
- Raccogliere i pLN dalla fossa poplitea e rimuovere con cura il tessuto adiposo perinodale attorno ai pLAN sotto il microscopio a dissezione a 2, 6 e 12 ore dopo l'iniezione FITC.
- Incorporare i pLAN con l'area del seno midollare rivolta verso il lato del criomoldo in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT)(Figura 1G,H).
- Preparare sezioni congelate da 20 μm usando un criotomo.
- Immagini le criosezioni al microscopio confocale per determinare la distribuzione FITC.
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Representative Results
La sutura linfatica dei vasi è stata utilizzata neglistudi precedenti 15,16,17,19, dove è servita come strumento importante per studiare la funzione del flusso linfatico prima che la biologia molecolare dei vasi linfatici fosse meglio compresa. Il blocco del flusso linfatico interrompe l'omeostasi LN, che porta gli HEV a perdere l'espressione genica critica necessaria per l'homing dei linfociti ottimale all'LN15,16,17. Da allora, ci sono voluti altri due decenni per dimostrare che i DC che viaggiano con la linfa sono cruciali per mantenere il profilo di espressione genica HEV e i linfociti che si accaparro all'LN13. Lo stress da taglio fornito dal flusso linfatico è fondamentale per stimolare l'espressione della chemiochina nella LN. Il blocco del flusso linfatico interrompe l'espressione della chemiochina CCL21 nell'LN19, che è fondamentale per dirigere il posizionamento delle cellule DC e T nella LN. Pertanto, il flusso interrotto può compromettere il posizionamento di COMPUTER e celle T nell'LN8,18.
Subito dopo l'intervento chirurgico, un piccolo tracciante fluorescente di peso molecolare, FITC, è stato utilizzato per tracciare il flusso linfatico. Fitc (10 μL del 2% FITC) è stato iniettato intradermally nel footpad del controllo fittizio e nella gamba suturata linfatica. I pLAN drenante sono stati raccolti 2, 6 e 12 ore dopo. I pLN drenante sono stati incorporati nello PTOM e sono state preparate sezioni congelate da 20 μm. Le immagini confocali hanno mostrato un accumulo fitc sostanzialmente ridotto nei pLAN dopo la sutura. Il FITC residuo nei pLAN è stato accumulato preferenzialmente nei seni LN(figura 2).
Il modo in cui la linfa scorre attraverso il tessuto adiposo che circonda la LN è stato studiato utilizzando sutura linfatica. I vasi linfatici afferenti che portano ai PLN sono stati suturati per bloccare il flusso linfatico, ed è stato determinato che il tessuto adiposo perinodale poteva sostenere una piccola quantità di flusso linfatico quando i vasi linfatici sono statibloccati 21. Il flusso linfatico attraverso il tessuto adiposo fino alla capsula della LN è stato mappato; sembrava nutrirsi nei seni LN. Piccole quantità di linfa possono essere confluite nei seni LN nel tempo (Figura 3).
Figura 1: Fasi della sutura dei vasi linfatici afferenti LN (pLN) popliteal. In breve, dopo che i topi sono stati anestetizzati con una miscela di ketamina e xiazina, le loro gambe sono state rasate e la pelliccia residua è stata rimossa da una crema depilatoria. La gamba destra era usata per la sutura e la gamba sinistra era il controllo fittizio. Il lato destro del pedone è stato iniettato intradermally con 5 μL di colorante Evans Blue all'1% preparato in PBS. (A) Massaggiando delicatamente il pedana, il colorante Evans Blue riempiva i vasi linfatici afferenti. (B) Un piccolo taglio cutaneo è stato eseguito a 5 mm di distanza dal pLN per esporre i vasi linfatici, indicati dalle due frecce bianche. (C,D) Entrambi i vasi linfatici afferenti sono stati suturati. (E) L'escissione cutanea è stata chiusa da suture. (F) La gamba di controllo ha ricevuto l'iniezione blu evans, l'escissione cutanea e la chiusura della sutura senza suturare i vasi linfatici. (G) Il successo del blocco del flusso linfatico è stato indicato dalla tintura blu Evans, che è entrata nel pLN della gamba di controllo ma non nella gamba suturata. (H,I) I pLN raccolti sono stati incorporati nel composto OCT con seno sottocapsulare (SCS) e seno midollare (MS) rivolto verso il lato del criomoldo prima di congelare lo snap nell'azoto liquido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Distribuzione FITC nei pLAN drenante della gamba fittizia o suturata. Le immagini confocali dei pLAN raccolti 2, 6 e 12 ore dopo l'iniezione FITC hanno mostrato un accumulo fitc sostanzialmente ridotto nei pLAN dopo la sutura. Il FITC residuo nei pLAN è stato trovato preferenzialmente nei seni LN. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Distribuzione FITC nel tessuto adiposo perinodale (PAT), attorno ai pLN drenante della gamba finta o suturata. Le immagini confocali del PAT e della LN hanno mostrato che il FITC entra nei seni PAT e LN, ma non è stato distribuito efficacemente in tutta la LN quando i vasi linfatici sono stati bloccati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il blocco del flusso linfatico avrà ampie applicazioni nella manipolazione della somministrazione di antigeni alla LN in condizioni sane e mase. È possibile utilizzare questo metodo per controllare i tempi di erogazione dell'antigene al fine di studiare come il flusso linfatico continuo regola la risposta immunitaria nelle LN drenante. Questo metodo di interruzione del flusso linfatico può anche essere utilizzato per studiare come la linfa influisce sulla compartimentazione cellulare, l'attivazione cellulare, la migrazione cellulare e le interazioni cellula-cellula nella LN.
Sono stati sviluppati topi che esprimono specificamente il recettore della tossina della difterite umana (DTR) nelle loro cellule endoteliali linfatiche(Flt4-cre-dtr); questi possono essere utilizzati per esaurire specificamente i vasi linfatici per studiare la funzione linfatica22. La somministrazione di DT uccide le cellule endoteliali linfatiche lungo i vasi linfatici e nella LN. L'esaurimento delle cellule endoteliali linfatiche può abrogare completamente il flusso linfatico a livello regionale o sistemico per studiare la funzione linfatica. Questo metodo causa un significativo accumulo di liquidi nei tessuti e funge da ottimo modello per studiare il linfedema e la funzione linfatica.
Rispetto al modello di espressione DTR specifico della cellula endoteliale linfatica, il vantaggio del metodo di sutura linfatica è che interrompe il flusso linfatico con danni minimi alle cellule endoteliali linfatiche o a qualsiasi altro vaso linfatico intorno all'area. L'intervento non influisce direttamente sulle cellule nella LN drenante, quindi l'impatto risultante sul microambiente LN o sulla comunicazione delle cellule immunitarie è una conseguenza del blocco del flusso linfatico piuttosto che della potenziale morte cellulare indotta dalla DT. Un altro vantaggio di questo metodo è che il flusso linfatico viene immediatamente bloccato dopo l'intervento chirurgico, quindi la tempistica del blocco del flusso linfatico può essere meglio controllata.
La limitazione di questo metodo è che può essere utilizzato solo per studiare l'intervento regionale del flusso linfatico nei vasi linfatici afferenti dal footpad al pLN. Questo metodo richiede l'identificazione dell'esatta posizione dei vasi linfatici di raccolta. La raccolta dei vasi linfatici è difficile da identificare in alcuni luoghi anatomici, e quindi questa tecnica richiede un ampio addestramento anatomico e chirurgico prima di identificare con successo i vasi linfatici afferenti per bloccare il flusso linfatico. Un'altra limitazione è che questo metodo non può bloccare direttamente la linfa che entra nei vasi linfatici iniziali. Dopo la sutura, il flusso linfatico bloccato può aumentare la pressione del fluido interstiziale e cambiare la direzione del flusso linfatico nei vasi linfatici iniziali. Pertanto, i vasi linfatici intatti intorno all'area possono compensare la funzione dei vasi linfatici interrotti e cambiare la direzione del flusso linfatico.
Inoltre, l'iniezione di colorante Evans Blue aumenta la pressione del fluido interstiziale, che può interferire con la successiva iniezione di tracciante o antigene. L'autofluorescenza del colorante Evans Blue può interferire con altri traccianti fluorescenti o altri fluorofori utilizzati per la colorazione immunofluorescente. Per evitare qualsiasi interazione tra colorante Evans Blue e potenziali antigeni, altri traccianti o potenziali meccanismi molecolari di regolazione della funzione linfatica, è possibile identificare i vasi linfatici di raccolta senza colorante Evans Blue ad occhio nudo. Questo obiettivo può essere raggiunto con un'ampia formazione per identificare le navi. Altri coloranti, come la tintura blu isosulfan possono anche essere usati per sostituire il colorante Evans Blue.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ava Zardynezhad per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è supportato dal Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) e dalla Canada Foundation for Innovation for SL (32930), e dalla National Natural Science Foundation of China per Yujia Lin (81901576).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
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