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Aclimatação antes de um teste de tolerância à insulina intraperitoneal para mitigar a hiperglicemia induzida por estresse em camundongos conscientes

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DOI:

10.3791/61179

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22 de maio de 2020

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1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, VA Puget Sound Health Care System, 2Department of Medicine, University of Washington

Neste artigo

Resumo

Elevações induzidas por estresse nos níveis de glicose podem confundir a interpretação de dados derivados de um teste consciente de tolerância à insulina intraperitoneal em camundongos. Neste artigo, descrevemos um método para aclimatar os camundongos ao manuseio, injeções e coleta de sangue antes de realizar o teste de tolerância à insulina, a fim de limitar a hiperglicemia induzida pelo estresse.

Resumo

O teste de tolerância à insulina é comumente usado em estudos metabólicos para avaliar a sensibilidade à insulina de corpo inteiro em roedores. É um teste relativamente simples que envolve a medição dos níveis de glicose no sangue ao longo do tempo após uma única injeção intraperitoneal de insulina. Dado que é realizado no estado consciente e o sangue é frequentemente coletado por meio de um corte de cauda, tem o potencial de provocar uma resposta ao estresse dos animais devido à ansiedade associada ao manuseio e coleta de sangue. Como tal, pode ocorrer um aumento da glicose no sangue induzido pelo estresse, dificultando a detecção e interpretação da medida do desfecho primário, ou seja, uma redução mediada pela insulina na glicose no sangue. Isso foi observado em muitas linhagens de camundongos e é bastante comum em camundongos diabéticos db / db, onde os níveis de glicose podem aumentar, em vez de diminuir, após a administração de insulina. Aqui, descrevemos um método de aclimatação de camundongos ao manuseio, injeções e amostragem de sangue antes de realizar o teste de tolerância à insulina. Descobrimos que isso reduz a hiperglicemia induzida pelo estresse e resulta em dados que refletem com mais precisão a sensibilidade à insulina de todo o corpo.

Introdução

Testes metabólicos em roedores são realizados rotineiramente para avaliar vários parâmetros que regulam a homeostase da glicose1. O padrão-ouro para avaliar a ação da insulina de corpo inteiro in vivo é o clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico2. Este teste envolve a administração de insulina para aumentar os níveis circulantes de insulina, enquanto a glicose é infundida para manter a euglicemia. A taxa de infusão de glicose necessária para manter a euglicemia é indicativa da ação da insulina. Embora seja uma ferramenta poderosa na pesquisa metabólica, a técnica de clamp em camundongos é tecnicamente desafiadora e trabalhosa e, portanto, não é adequada como uma ferramenta de triagem inicial na caracterização de um fenótipo metabólico. Por esses motivos, o teste de tolerância à insulina intraperitoneal (ITT) mais simples é frequentemente escolhido.

O ITT é realizado no estado consciente após um período de jejum (normalmente 4-6 horas). Um bolus de insulina é administrado por via intraperitoneal, após o qual a glicose no sangue é monitorada por um período de tempo que geralmente dura 60 minutos. Espera-se que os níveis de glicose no sangue caiam devido à capacidade da insulina de facilitar a captação de glicose em tecidos sensíveis à insulina; O grau em que isso ocorre é indicativo da ação da insulina em todo o corpo. Em alguns casos, foi demonstrado que os níveis de glicose paradoxalmente aumentam, em vez de diminuir, após a administração de insulina. Esse fenômeno é provavelmente atribuído a uma resposta ao estresse. O manuseio, as injeções e a coleta de sangue podem induzir estresse 3,4,5, resultando na ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e do sistema nervoso autônomo (SNA)6,7,8. Sabe-se que tanto o HPA quanto o SNA contribuem para o aumento dos níveis de glicose circulante 9,10,11. A presença de hiperglicemia induzida por estresse no início de um ITT é problemática, pois interfere na taxa e magnitude da queda da glicose após a administração de insulina12. Isso pode levar a conclusões errôneas sobre a presença de resistência à insulina. Assim, para mitigar o impacto confuso do estresse nos níveis de glicose durante um ITT, desenvolvemos um método de aclimatação de camundongos ao manuseio, injeções e amostragem de sangue antes de realizar o ITT.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do VA Puget Sound Health Care System.

NOTA: Os requisitos locais para monitoramento e/ou intervenção de animais com hipoglicemia podem diferir daqueles descritos aqui.

1. Jejum (t = -210 min)

  1. Após o término do ciclo escuro, transfira os camundongos para uma nova gaiola com cama não nutritiva, como celulose ou cama de papel (não cama de espiga de milho, que afetará os pontos finais metabólicos se consumida por camundongos13). Forneça aos camundongos acesso ad libitum à água durante todo o período de jejum. Seja consistente com a hora e a duração do dia em jejum entre os grupos de camundongos. Para os dados mostrados, os alimentos foram removidos entre 0700 e 0800 horas, que foi de 1 a 2 horas após o término do ciclo escuro.
  2. Mova a(s) gaiola(s) para o local onde o ITT será realizado. Este deve ser um espaço silencioso onde estressores como temperatura, ruído, luz ou movimento sejam minimizados.

2. Aclimatação (t = -150 a -60 min)

IMPORTANTE: Manuseie os ratos com a maior delicadeza possível. Evite o uso de um dispositivo de retenção, se possível.

  1. Aos -150 min, meça o peso corporal. Isso será usado para calcular o volume de insulina que será administrado para o ITT.
  2. Pegue o mouse suavemente pela cauda e descanse em uma superfície plana de mesa enquanto ainda segura suavemente a cauda. Use uma agulha de 20 G (ou tesoura cirúrgica) para fazer uma pequena incisão na ponta da cauda. Uma gota de sangue deve começar a se formar no local.
  3. Coloque o mouse em uma superfície lisa e dura e prenda o mouse suavemente pela cauda.
    1. Para registrar a glicose no sangue neste momento, coloque uma gota de sangue da ponta da cauda na tira de teste de um glicosímetro portátil. Se necessário, massageie suavemente a cauda para obter uma gota de sangue.
  4. Retire 100 μL de solução salina estéril em uma seringa de insulina. Pegue o mouse usando scruffing suave e injete intraperitonealmente. Registre o tempo de injeção de solução salina.
    1. Se vários camundongos estiverem sendo estudados, injete solução salina nos camundongos em intervalos de 1 minuto para dar tempo para as etapas subsequentes abaixo.
  5. Aos 15 minutos após a injeção de solução salina, pegue o camundongo suavemente pela cauda. Use gaze para desalojar suavemente qualquer coágulo de sangue na ponta da cauda.
    1. Opcional: Registre a glicose no sangue novamente neste momento, conforme descrito na etapa 2.3.
  6. Aos 30 minutos após a injeção de solução salina, pegue suavemente o mouse pela cauda. Se desejar, obtenha outra medição de glicose no sangue conforme descrito na etapa 2.3.
  7. Retorne o mouse para a gaiola e repita para outros mouses conforme necessário. Deixe os ratos intactos até -90 min.
  8. Aos -90 min, repita as etapas 2.3 a 2.6, incluindo a medição dos níveis de glicose no sangue, se desejar.
  9. Retorne o mouse para a gaiola, repita para outros mouses conforme necessário. Deixe os camundongos intactos até o ITT (para o qual a medição basal da glicose no sangue é feita em -5 min).

3. Teste de tolerância à insulina (t = -5 a +60 min)

  1. Prepare uma solução de trabalho de insulina regular (CUIDADO) em solução salina estéril, de modo que a dose desejada possa ser injetada a 4 μL / g de peso corporal.
    NOTA: Deve-se ter cuidado ao manusear insulina, pois a injeção acidental pode resultar em hipoglicemia.
  2. Prepare uma solução de dextrose a 25% (v/v) em solução salina estéril para ter à mão caso os camundongos desenvolvam hipoglicemia que exija intervenção.
  3. Aos -5 min, pegue o mouse suavemente pela cauda. Determine o nível basal de glicose no sangue neste momento, colocando uma gota de sangue da ponta da cauda na tira de teste de um glicosímetro portátil. Se necessário, massageie suavemente a cauda para obter uma gota de sangue.
  4. Aspire a solução de trabalho de insulina para uma seringa de insulina (4 μL / g de peso corporal, para uma faixa de dose típica de 0,5-2,0 U / kg). Pegue o mouse usando scruffing suave e injete intraperitonealmente. Tempo recorde de injeção de insulina.
    1. Se vários camundongos estiverem sendo estudados, injete insulina nos camundongos em intervalos de 1 minuto para dar tempo para a coleta de sangue subsequente e o registro de dados abaixo.
  5. Aos 15 minutos após a injeção de insulina, pegue o camundongo suavemente pela cauda. Use gaze para desalojar suavemente qualquer coágulo de sangue na ponta da cauda. Determine a glicose no sangue novamente neste momento, conforme descrito na etapa 3.3.
  6. Retorne o mouse à gaiola e monitore os sinais de hipoglicemia (por exemplo, letargia excessiva). Se os camundongos desenvolverem sintomas de hipoglicemia, meça a glicose no sangue conforme descrito na etapa 5 e administre dextrose, se necessário. Um camundongo submetido à intervenção de dextrose seria removido do protocolo ITT neste momento.
  7. Repita as etapas 3.5 e 3.6 30 minutos após a injeção de insulina.
  8. Repita as etapas 3.5 e 3.6 45 minutos após a injeção de insulina.
  9. Repita as etapas 3.5 e 3.6 60 minutos após a injeção de insulina.
  10. Retorne os ratos para sua gaiola de origem, contendo alguns pellets de comida no chão da gaiola para ajudar na recuperação do ITT. Continue a monitorar por 30 minutos e, se os camundongos não recuperarem a atividade/comportamento normal, siga o procedimento descrito na etapa 3.6.
    NOTA: A Figura 1 resume a aclimatação acima e o procedimento ITT.

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Resultados

A Figura 2A e a Figura 3A são dados representativos (dados individuais e médios, respectivamente) que mostram um aumento paradoxal nos níveis de glicose no sangue em camundongos diabéticos db / db nos 15 minutos após a administração de insulina, consistente com hiperglicemia induzida por estresse. Observe que nenhum aumento na glicose no sangue foi evidente nos irmãos de ninhada não diabéticos de controle (db / + ou +/+) que foram submetidos ao mesmo procediment...

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Discussão

O clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico é considerado o padrão-ouro para avaliar a ação da insulina in vivo. Modificações na metodologia para a realização do clamp resultaram na técnica sendo feita em camundongos conscientes e desenfreados2 que foram previamente cateterizados usando um sistema de dois cateteres14 para permitir a coleta de sangue pela artéria carótida e infusões pela veia jugular. Isso limita a necessidade de manusear ou conte...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant P30 DK-017047 (Centro de Pesquisa de Diabetes da Universidade de Washington, Núcleo de Análise de Função Celular) e pelo Departamento de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos, VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA). O conteúdo deste manuscrito não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA ou do Governo dos Estados Unidos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dextrose-50Pfizer Injetáveis00409-6648-16Para uso se o camundongo apresentar hipoglicemia.
Compressas de gazeFisher Scientific22037907Para desalojar o coágulo sanguíneo na ponta da cauda.
GlicosímetroAccu-ChekM001_usPara medir a glicose no sangue.
EscalaPara medir o peso corporal.
Insulina (Novolin R)Novo Nordisk0169-1833-11Para injeção.
Seringas de insulinaVWRBD-329461Para preparações injetáveis.
Temporizador
de minutos Estéril agulha 20 GVWRBD-305175Para corte de cauda.
Solução salina estérilLifeshield 1261699Para injeções.
Tesoura cirúrgicaFine Science Tools14088-10Para corte de cauda.
Tiras de testeAccu-Chek06908217001_usPara medir a glicose no sangue.
de gramas

Referências

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