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Identificação e Caracterização de Espécies imunogênicas de RNA em Alérgenos HDM que modulam inflamação pulmonar eosinofílica

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DOI:

10.3791/61183

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30 de maio de 2020

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, Long School of Medicine, University of Texas Health San Antonio, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, 3Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Xiangya Hospital, Central South University

Neste artigo

Resumo

Alérgenos ambientais, como ácaros domésticos (HDM), geralmente contêm substâncias microbianas que ativam respostas imunes inatas para regular a inflamação alérgica. O protocolo aqui apresentado demonstra a identificação de espécies de dsRNA em alérgenos HDM e caracterização de suas atividades imunogênicas na modulação da inflamação pulmonar eosinofílica.

Resumo

Alérgenos ambientais, como ácaros domésticos (HDM) são frequentemente em formas complexas que contêm tanto proteínas alérgicas que impulsionam respostas aberrantes tipo 2 quanto substâncias microbianas que induzem respostas imunes inatas. Esses componentes microbianos associados ao alérgeno desempenham um papel importante na regulação do desenvolvimento de condições inflamatórias tipo 2, como asma alérgica. No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem em grande parte indefinidos. O protocolo aqui apresentado determina as características estruturais e a atividade in vivo do RNA imunoestimulatório associado ao alérgeno. Especificamente, alérgenos comuns são examinados para a presença de espécies de RNA de dupla laminada (dsRNA) que podem estimular as respostas de IFN nos pulmões e conter o desenvolvimento de eosinofilia pulmonar grave em um modelo de camundongos de asma alérgica induzida por HDM. Aqui, incluímos os seguintes três ensaios: Mancha de ponto para mostrar as estruturas dsRNA no total de RNA isolado de alérgenos, incluindo espécies HDM, RT-qPCR para medir as atividades de HDM RNA na expressão de genes estimulantes de interferon (ISGs) em pulmões de camundongos e análise FACS para determinar os efeitos do RNA HDM sobre o número de eosinófilos em BAL e pulmão, respectivamente.

Introdução

Com base na hipótese de higiene originalmente proposta por Strachan1, a exposição infantil a fatores microbianos ambientais, como a endotoxina, pode proteger contra o desenvolvimento de transtornos alérgicos2,,3. Durante infecções microbianas, por exemplo, infecções virais, a detecção imune inata de ácidos nucleicos estranhos (RNA/DNA) desencadeia respostas de defesa do hospedeiro4,,5,,6. No entanto, a existência e prevalência de ácidos nucleicos imunogênicos, como espécies de RNA (dsRNA) de dupla-encalhadas em ácaros domésticos (HDM) ou outros alérgenos de insetos permanecem desconhecidas. Este protocolo foi projetado para determinar se os alérgenos hdm ou insetos e não-insetos contêm espécies de dsRNA longas que podem ativar uma resposta imune protetora para neutralizar o desenvolvimento de inflamação pulmonar eosinofílica grave em um modelo de camundongo de asma alérgica. Aqui, fornecemos três métodos simples e rápidos para avaliar os determinantes estruturais no RNA total HDM que são necessários para regular a inflamação pulmonar eosinofílica induzida por alérgenos.

O sistema imunológico mucosa é o maior órgão imunológico do corpo e serve como primeira linha de defesa hospedeira contra infecções microbianas e insultos alérgicos7,,8. O dsRNA longo, o intermediário de replicação de muitos vírus, é conhecido por funcionar como um padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) para estimular potentemente respostas inatas via Toll like receptor 3 (TLR3) para induzir a expressão de genes estimulados por interferon (ISGs)9,,10,,11,12,13,14. Recentemente, mostramos que o RNA total hdm continha estruturas de dsRNA, o que regulava a expressão dos ISGs e reduzia a inflamação pulmonar eosinofílica grave quando administrado através da instilação intratraqueal em um modelo murino de asma alérgica induzida pelos extratos de HDM15. A gravidade das inflamações pulmonares é determinada pela análise dos tipos de células imunes na lavagem broncoalveolar (BAL) e no tecido pulmonar através da citometria de fluxo16,17,,18,,19,20.

Este protocolo inclui três ensaios: 1) detecção rápida de estruturas dsRNA com mancha de ponto RNA usando um anticorpo monoclonal de rato J2 que se liga especificamente ao dsRNA (≥40bp) de forma independente de sequência; 2) avaliação rápida para efeitos in vivo do RNA imunoestimulativo nos pulmões do camundongo medindo a indução de ISGs utilizando RT-qPCR; 3) quantificação precisa de eosinófilos em BAL e pulmão no contexto de inflamação pulmonar induzida pelo HDM utilizando a análise da citometria de fluxo.

Os ensaios acima podem ser usados para estudar não apenas doenças pulmonares alérgicas, mas também infecções bacterianas e virais respiratórias. Por exemplo, o anticorpo J2 específico dsRNA também pode ser usado em outras aplicações como cromatografia imunoaffinity, imunohistoquímica, ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) e imunostaining21,,22,23. Além disso, várias aplicações a jusante da coleta de fluidos BAL podem ser utilizadas para quantificar conteúdos solúveis, como citocinas e quimiocinas usando ELISA, e perfil transcricional de células nas vias aéreas (por exemplo, macrófagos alveolares). Embora existam uma variedade de protocolos disponíveis na literatura para avaliar as condições pulmonares, a maioria desses protocolos muitas vezes se concentra na validação do alvo. Os procedimentos aqui descritos podem ser aplicados para identificar componentes em alérgenos ambientais que são importantes para regular o desenvolvimento de doenças alérgicas.

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Protocolo

Os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas Health San Antonio.

1. Mancha de ponto para mostrar a presença de estruturas dsRNA no RNA total HDM

  1. Isolamento total do RNA de alérgenos, insetos e alergênicos não-insetos
    1. Coloque hdm, insetos ou animais não-insetos coletados vivos ou obtidos comercialmente em tubos de 50 mL, e congele rapidamente com líquido-N2. Em seguida, armazene a -70 °C para posterior isolamento total do RNA.
      NOTA: Neste experimento, foram selecionados animais HDM, insetos e não-insetos porque são conhecidos por serem fontes comuns de alérgenos. Além disso, uma função imunoestimulatória de suas RNAs permanece incerta.
    2. Transfira uma quantidade adequada (equivalente a 100 μL em volume ou menos) de animais HDM, insetos ou não-insetos armazenados a -70 °C em um tubo de 2 mL contendo esferas cerâmicas (esferas cerâmicas de 1,4 mm), em seguida, congele tubos em um recipiente líquido-N2 por ~10 min.
    3. Para o isolamento total do RNA, adicione 1 mL de reagente de isolamento de RNA à base de tiocianato de guanidinium24 para cada tubo, em seguida, quebre o inseto e animais pequenos não-insetos com um disruptor celular de alta energia na velocidade máxima para 45 s e frio no gelo. Repita este passo duas vezes.
    4. Transfira a solução da etapa 1.1.3 para um novo tubo de 1,5 mL e adicione 200 μL de clorofórmio a cada tubo e vórtice. Tubos centrífugas a 14.000 x g para 14 min a 4 °C.
    5. Uma vez concluída a centrifugação, transfira a fase aquosa superior (200 μL) para um novo tubo de 1,5 mL contendo 500 μL de isopropanol para precipitar a pelota de RNA. Não perturbe a interfase. A razão de volume recomendada da fase superior versus isopropanol é de 1:2.5.
    6. Misture por vórtice suave, depois tubos de centrífugas a 14.000 x g por 14 min a 4 °C.
    7. Aspire o supernasce com cautela, depois lave a pelota de RNA com 500 μL de 75% de etanol e centrífuga a 7.500 x g por 10 min a 4 °C. Remova todo o líquido com cuidado, seque a pelota e dissolva a pelota de RNA com 20-50 μL de H2O sem RNase.
    8. Meça a concentração de RNA com um espectrofotômetro usando os seguintes parâmetros:
      1. Abra o software associado e selecione o tipo de ácidos nucleicos para medir. Mude o tipo de amostra para RNA.
      2. Realize a medição em branco com 1-2 μL de H2O sem RNase. Limpe o H2O sem RNase. Agora, o instrumento está pronto para a medição.
      3. Carregar 1-2 μL da amostra de RNA e medir a concentração de RNA (μg/μL).
        NOTA: A razão de absorção em 260 e 280 nm (A260/280) em ~2.0 (1.9-2.2) é geralmente aceita como "pura" para RNA. Se não for processado imediatamente, armazene amostras de RNA a -70 °C e evite os ciclos de congelamento para manter o RNA intacto.
  2. Detecção da estrutura dsRNA no RNA total usando anticorpo J2 específico dsRNA
    1. Prepare dois 20 μL de amostras de RNA (200 ng/μL). Um com tratamento RNase-III (1 μL para RNA de 1 μg, incubar a 37 °C por 60 min) e o outro sem tratamento RNase-III.
      NOTA: O RNase III é usado aqui para degradar especificamente o dsRNA, mas não o RNA25de uma única linha .
    2. Use um lápis para desenhar grades onde as amostras de RNA serão borradas na membrana.
    3. Ponto 2 μL dos 200 ng/μL da amostra de RNA na membrana de nylon carregada positivamente.
    4. Transligue as amostras à membrana a 1.200 microjoules x 100 em um crosslinker UV. Repita as etapas 1.2.3 e 1.2.4 mais duas vezes no local da amostra. Isso resultará em um total de 0,8 μg por mancha.
      NOTA: Não localmente mais de 2 μL de amostra de RNA na membrana de cada vez.
    5. Bloqueie a ligação não específica com 5% de leite em TBS-T por 1h com agitação à temperatura ambiente. Remova a solução de bloqueio da etapa 1.2.5 e adicione o anticorpo anti-dsRNA J2 na diluição de 1:1.000 em 1% de leite em TBS-T e incubar durante a noite com agitação a 4 °C.
    6. Lave a membrana com TBS-T por 5 minutos e repita esta etapa por 3 vezes. Adicione o anticorpo secundário (Alcalino fosfattase-conjugado Anti-Mouse IgG diluído em 1% de leite 1:5.000) e incubar por 1h em um shaker à temperatura ambiente. Lave a membrana com TBS-T por 5 minutos e repita esta etapa por 3x.
    7. Adicione o substrato (BCIP/NBT) e incubar por 5-15 min até que um sinal desejado seja visível.
    8. Pare a reação enxaguando a membrana com ddH2O.
    9. Seque a membrana em papéis de tecido e tire uma foto usando um smartphone (um resultado representativo é mostrado na Figura 1).

2. RT-qPCR para medir a capacidade do RNA total HDM no estímulo à expressão dos ISGs pulmonares

  1. Isolamento de RNA de tecidos pulmonares de camundongos
    NOTA: Os camundongos (fêmeas, de 8 a 12 semanas, C57BL/6J) foram mantidos em condições específicas sem patógenos.
    1. Anestesia brevemente o animal com isoflurano e administre através da instilação intratraqueal com 5 μg (diluído em 80 μL PBS) de HDM RNAs tratados com ou sem RNase III.
    2. Após 16-18 h pós tratamento HDM RNA, sacrifique o mouse por inalação de CO2 por alguns minutos. Em seguida, coloque o mouse em uma plataforma e fixe membros com agulhas.
    3. Desinfete o rato com 70% de etanol e corte a pele do abdômen até o pescoço com uma tesoura esterilizada.
    4. Conserte a pele com agulhas e corte as costelas para expor os pulmões. Remova os pulmões inteiros e lave-os com PBS frio. Coloque os pulmões em papéis de tecido e extirve um pequeno pedaço de cada lobo-pulmão em um tubo de 2 mL contendo contas (200-300 μL em volume, esferas cerâmicas de 1,4 mm).
      NOTA: O objetivo do uso de contas cerâmicas é moer tecidos pulmonares inteiros
    5. Congele as amostras de pulmão colocando tubos em um recipiente líquido-N2 por ~10 min.
    6. Adicione 500 μL de reagente de isolamento de RNA à base de tiocianato de guanidinium em cada tubo e quebre os tecidos pulmonares com um homogeneizador para 45 s. Esfrie no gelo entre cada passo. Repita este passo duas vezes.
    7. Siga os passos 1.1.4- 1.1.7 para isolamento do RNA pulmonar.
    8. Seque a pelota e dissolva a pelota de RNA com a quantidade adequada de H2O sem RNase (~20-30 μL).
    9. Meça a concentração de RNA conforme descrito na etapa 1.1.8.
  2. RT-qPCR para determinar a capacidade do RNA HDM em estimular a expressão genética pulmonar.
    1. Utilizando 100 ng/μL de RNA extraído dos tecidos pulmonares como modelo, realize a síntese de cDNA de acordo com o protocolo referenciado26.
    2. Configure uma reação RT-qPCR a 10 μL/well para uma placa de 384 poços usando cDNA gerada acima e os pares de primer específicos de genes(Tabela 1 e Tabela 2).
    3. Sele os poços firmemente com um filme adesivo transparente e vórtice da placa por 30 s. Gire a placa a 1.000 x g por 30 s para coletar amostras na parte inferior dos poços.
    4. Carregue a placa em uma máquina RT-qPCR e comece a executar a reação RT-qPCR usando o protocolo de cicloviário térmico(Tabela 3).
    5. Exporte os resultados em um arquivo de planilha ou analise os dados usando o software fornecido pela manufatura após a conclusão do programa (um resultado representativo é mostrado na Figura 2).

3. Análise FACS para determinar os efeitos do RNA HDM na infiltração de eosinófilos em BAL e pulmão

  1. Coleta de fluidos BAL para análise FACS
    1. Camundongos eutanizais (fêmeas, 8-12 semanas de idade, C57BL/6J) que foram tratados com extratos de alérgenos HDM (de acordo com o desenho experimental mostrado na Figura 3B) por inalação de CO2.
    2. Coloque o mouse em uma plataforma e fixe membros com agulhas.
    3. Desinfete o rato com 70% de etanol. Use uma tesoura para cortar a pele da parte superior do abdômen até o pescoço.
    4. Suavemente, puxe as glândulas salivares e o músculo esternoide cuidadosamente separado usando os fórceps para expor a traqueia. Coloque uma corda de nylon (~10 cm) sob a traqueia usando fórceps.
    5. Faça uma incisão na traqueia (~2 mm sob a laringe) apenas o suficiente para inserir uma cânula. Não corte a traqueia. Nó a corda em torno de traqueia e cânula.
    6. Carregue a seringa com 1 mL de PBS+EDTA e anexe-a à extremidade da cânula. Injete 1 mL de PBS+EDTA no pulmão e aspire completamente a solução. Retire a seringa da cânula cuidadosamente e transfira a solução para um tubo de 15 mL no gelo.
    7. Recarregue a seringa com o PBS+EDTA fresco e repita esta etapa 2x.
    8. Centrifugar o tubo contendo o BAL agrupado obtido na etapa 3.1.7 para pelotar as células a 500 x g por 7 min a 4 °C. Regisso o volume do fluido BAL e transfira o supernante para dois tubos de 1,5 mL sem perturbar a pelota.
      NOTA: O supernatante de BAL pode ser armazenado a -70 °C para análise futura, por exemplo, ELISA.
    9. No caso de haver RBCs presentes na pelota devido a inflamação pulmonar grave, após a remoção do supernascimento, adicione 500 μL de tampão de lise RBC e misture bem com a resuspensão. Transfira a solução para um novo tubo de 1,5 mL e centrífuga por 7 min a uma velocidade de 500 x g a 4 °C.
    10. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 150 μL de tampão FACS.
    11. Transfira os 150 μL da amostra resuspended em placa de 96 poços e centrifugar a placa por 7 minutos à velocidade de 500 x g a 4 °C.
    12. Rapidamente, inverta a placa em papéis de tecido para coletar as células que residem na parte inferior dos poços.
    13. Manche as células com anticorpos no tampão FACS na presença de anticorpos bloqueadores de 2,4G2 (2,5 μg / 100 μL). Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos em um lugar escuro.
    14. Após a coloração, centrifufique a placa para pelotar as células a 500 x g por 7 min a 4 °C.
    15. Remova a solução de coloração invertendo a placa em papel de tecido e depois lave resususus com 100 μL de tampão FACS. Em seguida, centrifugar a placa novamente a 500 x g por 7 min a 4 °C e remover o tampão FACS invertendo a placa em papel de tecido.
    16. Resuspend amostras em 150 μL de tampão FACS e transferir amostras para os tubos FACS contendo 350 μL de tampão FACS. Adicione 25 μL de contas de contagem a cada amostra. As amostras estão prontas para análise de citometria de fluxo.
      NOTA: Vários tipos de células em fluido BAL foram rotulados com anticorpos conforme indicado. As contas de contagem foram adicionadas antes da execução do FACS. Os dados de citometria de fluxo foram analisados por meio de um software comercialmente disponível. Consulte a Figura 3 e a Tabela 4 para a estratégia de gating.
  2. Digestão do tecido pulmonar para a análise FACS
    1. Siga os passos 3.1.1 - 3.1.3.
    2. Corte a pele do abdômen até o pescoço com uma tesoura esterilizada. Conserte a pele com agulhas e corte as costelas para expor os pulmões.
    3. Remova os pulmões inteiros e lave-os com PBS frio. Coloque amostras no tubo de 1,5 mL contendo 50 μL de solução de digestão pulmonar.
    4. Pique os tecidos pulmonares em pequenos pedaços com uma tesoura curvada. Transfira os tecidos pulmonares para uma placa de 6 poços, depois adicione 8 mL de solução de digestão pulmonar. Coloque a placa em um agitador na incubadora de 37 °C por 45 min.
    5. Após a incubação, use o tubo superior de 1,5 mL para moer os tecidos pulmonares. Coloque uma placa de 70 μm em uma nova placa de 6 poços e aplique a amostra através de um filtro de 0,22 μm.
    6. Transfira a solução filtrada para um tubo de 15 mL e, em seguida, centrífugue os tubos a 500 x g por 7 min a 4 °C. Aspire o supernasciente e resuspense a pelota em 1 mL de tampão de lise RBC e deixe-a no gelo por 3 minutos.
    7. Transfira a amostra para tubo de 1,5 mL e centrífuga a 500 x g por 7 min a 4 °C. Repita 2x
    8. Lave as células pulmonares 2x com tampão FACS de 1 mL. Aspire o supernasal e resuspenque a pelota em 1 mL de tampão FACS e, em seguida, transfira 100 μL da amostra em placa de 96 poços.
    9. Centrifugar a placa por 7 min a uma velocidade de 500 x g a 4 °C. Siga os passos descritos na coleta de fluidos BAL para análise facs (3.1.13 a 3.1.16) para manchar as células de amostras de tecido pulmonar digerido.
      NOTA: Os eosinófilos nos pulmões foram rotulados com anticorpos como indicado, depois misturados com contas de contagem para posterior análise facs. Os dados de citometria de fluxo foram analisados por meio de software associado. Consulte a Figura 3 para avaliar as respostas imunes induzidas pelo RNA do HDM.

4. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando um software comercialmente disponível.
  2. Determine os valores p por teste T de estudante de duas caudas não verificados para a comparação de dois grupos.
  3. Calcule os números absolutos de eosinófilos com base em contas de referência (painel superior) usando a fórmula

figure-protocol-1

  1. Determine os valores p por duas vias ANOVA e sidak teste de comparações múltiplas para a comparação de mais de dois grupos.
  2. Considere um valor p menor que 0,05 como estatisticamente significativo. Os valores p são indicados em parcelas como *p <0,05, **p<0.01, ***p<0.001 e ****p<0.0001.
    NOTA: Todas as receitas de buffer são fornecidas na Tabela 5.

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Resultados

A presença de estruturas de dsRNA longas em HDM, insetos e animais pequenos não-insetos foi examinada por mancha de ponto usando um anticorpo monoclonal de camundongos específico dsRNA J2 (≥ 40bp). RNase III foi usado para digerir dsRNA em fragmentos de dsRNA de 12 a 15 bp, que eram indetectáveis por J2 (Figura 1).

A capacidade do RNA total hdm de estimular uma resposta imune inata nos pulmões do camundongo de forma dependente de dose foi analisada por RT-qPCR

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Discussão

O protocolo atual descreve como avaliar as propriedades imunoestimulatórias do RNA microbiano associado ao alérgeno e seus impactos no desenvolvimento da inflamação pulmonar eosinofílica em um modelo de camundongo de asma alérgica. Embora os DSRNAs longos sejam conhecidos como intermediários de replicação de muitos vírus que podem potencialmente ativar respostas de interferon em células de mamíferos, suas presenças em alérgenos HDM têm sido desconhecidas até nosso trabalho recente15. A combinação ...

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Divulgações

Não temos nada para revelar.

Agradecimentos

Agradecemos à Sra. Karla Gorena pela assistência técnica na citometria de fluxo. L.S. é apoiado pelo China Scholarship Council e Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. é apoiado pelo Departamento de Ciências Clínicas do Laboratório, Faculdade de Ciências Médicas Aplicadas, Universidade de Jouf, Sakaka, Arábia Saudita. X.D.L. é apoiado pelo UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund e pelo Max and Minnei Voelcker Fund.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,40 µ m Falcon Cell StrainerThermo Fisher Scientific08-771-1
Seringas de 1 mLHenke Sass Wolf5010.200V0
Tubo de 15 mLTH. Tubo Geyer7696702
50 mLTH. Geyer7696705
70% etanolDecon Labs2701
Absolute Counting BeadsLife Technologies Europe B.V.C36950
ACK-RBC tampão de liseLonza10-548E
Amersham Hybond-N+ MembranaGE HealthcareRPN203B
AntSan AntonioNota: Tampão
(consulte a Tabela 5 para receita)
200 diluições
Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)BioLegend1173171 a 200 diluições
Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)eBioscience15-0193-811 a 200 diluições
Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)Invitrogen15-0031-81a 200 diluições
Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)BioLegend1031301 a 200 diluição
Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506Invitrogen65-0866-141 a 200 diluição
Anti-Mouse IgG (H + L), AP ConjugadoPromegaS3721
Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)Invitrogen11-5931-821 a 200 diluição
Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5 / 114.15.2)eBioscience47-5321-801 a 200 diluição
Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)BD Pharmingen5521261 a 200 diluição
BCIP / NBT substratoThermo Fisher ScientificPI34042
Blocking Buffer(consulte a Tabela 5 para receita)
Cannual, 20G X 1,5 "CADENCE SCIENCE9920
CentrífugaThermo Fisher Scientific75004030
CFX384 Touch Sistema de Detecção de PCR em Tempo RealBio-Rad Laboratories1855485
ClorofórmioThermo Fisher ScientificC298-500
BarataGreer LaboratoriesB26
Contas de contagemThermo Fisher Scientific01-1234-42
D. farinaeGreer LaboratoriesB81
D. pteronyssinusGreer LaboratoriesB82
Denville Placas de Cultura de Células com tampa, placa de cultura de células de 96 poçosThomas Scientific1156F03
Banho Seco Digital - Quatro BlocosUniversal Medical, Inc.
EarthwormSan AntonioNota: Ácido
FACS(veja a receita na Tabela 5)
Biosciences
FlyGreer LaboratoriesB8
FórcepsRoboz Instrumento CirúrgicoRS-5135
HemocitômetroHausser Scientific3110
HT-DNASigmaD6898
In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)Bio X CellBE0307
iScript cDNA Kit de SínteseBio-Rad Laboratories1708891
IsofluranoAbbott Labssc-363629Rx
IsopropanolThermo Fisher ScientificBP2618500
J2 anticorpo monoclonal anti-dsRNASCICONS10010200
digestão pulmonar(veja a receita na Tabela 5)
Matriz de lise DMP Biomedicals116913050-CF
Lysing Matrix D, tubo de 2 mLMP BiomedicalsSKU:116913100
Camundongos (fêmea, 8-12 semanas de idade, C57BL/6J)Jackson Laboratory#000664
Tubo de microcentrífuga 1.5 mLMicroscópio Sigma-Aldrich30120.094
OlympusCK30
SKU: BS: 607
Mini-Beadbeater-16Biospec607
MosquitoGreer LaboratoriesB55
NanoDrop 2000CThermo Scientific Spectofotômetro Medex SupplyTSCND2000C
Agulha, 21 G x 1 1/2 inBD Biosciences305167
Leite desnatadoBio-Rad Laboratories1706404
Corda de nylonDynarex3243
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)LonzaBE17-516F
RNase IIIThermo Fisher ScientificAM2290
RNase T1Thermo Fisher ScientificAM2283
TesouraRoboz Instrumento CirúrgicoRS-6802
Shaker ou Pequeno misturador de laboratórioBoekel Scientific201100
SPHERO AccuCount FluorescenteSpherotechACFP-70-5Aranha de diluição de 1 a 10
SanAntonioNota: TBS
(veja a receita na Tabela 5)
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific15596018
Tween 20Sigma-AldrichP9416
UV Stratalinker 2400 UVLabX20447
VespaSan AntonioNota: Coletado
de diluição de anticorpos coletado localmente Rato Anti-Mouse CD11b V450 (clone M1 / 70) BD Bioscience 560456 1 a 1 BSH1004 etilenodiaminotetracético (EDTA) coletado localmente Tampão Sigma-Aldrich E6511 Tubos de polipropileno de fundo redondo Falcon, 5 mL STEMCELLTM TECHNOLOGIES 38056 Citômetro de fluxo (BD FACS Celesta) BD Solução de Homogeneizadores Mini-BeadBeater coletado localmente TBS-T (veja a receita na Tabela 5) Meio celular total (veja a receita na Tabela 5) localmente

Referências

  1. Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
  2. Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
  3. Stein, M. M., et al. Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children. New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).
  4. Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System. Immunity. 44, 739-754 (2016).
  5. Schlee, M., Hartmann, G. Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing. Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).
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