Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

Resumo

Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.

Resumo

Os organoides intestinais derivados da hiPSC são estruturas epiteliais que se auto-agrupam a partir de células diferenciadas em estruturas 3D complexas, representativas do epitélio intestinal humano, nas quais exibem estruturas semelhantes a criptas/vilosidades. Aqui, descrevemos a geração de organoides intestinais derivados de hiPSC pela diferenciação gradual de hiPSCs em endoderme definitivo, que é então posteriormente posteriormente posteriormente formado para formar epitélio do intestino posterior antes de ser transferido para condições de cultura 3D. O ambiente de cultura 3D consiste em matriz extracelular (MEC) (por exemplo, Matrigel ou outra MEC compatível) suplementada com SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 e CHIR99021. Os organoides sofrem passagem a cada 7 dias, onde são mecanicamente interrompidos antes de serem transferidos para a matriz extracelular fresca e deixados expandir. A QPCR e a imunocitoquímica confirmam que os organoides intestinais derivados da hiPSC contêm tipos de células epiteliais intestinais maduras, incluindo células caliciformes, células de Paneth e enterócitos. Adicionalmente, organoides apresentam evidências de polarização pela expressão de vilina localizada na superfície apical das células epiteliais.

Os organoides resultantes podem ser usados para modelar o desenvolvimento intestinal humano, bem como inúmeras doenças intestinais humanas, incluindo a doença inflamatória intestinal. Para modelar a inflamação intestinal, os organoides podem ser expostos a mediadores inflamatórios como TNF-α, TGF-β e LPS bacteriano. Organoides expostos a citocinas pró-inflamatórias exibem um fenótipo inflamatório e fibrótico em resposta. O emparelhamento de hiPSCs saudáveis versus hiPSCs derivados de pacientes com DII pode ser útil na compreensão dos mecanismos que conduzem a DII. Isso pode revelar novos alvos terapêuticos e novos biomarcadores para auxiliar no diagnóstico precoce da doença.

Introdução

As propriedades das células-tronco pluripotentes (CTPs), como a auto-renovação e a capacidade de diferenciação para qualquer tipo celular do corpo humano, as tornam ferramentas valiosas no estudo do desenvolvimento, patologia de doenças e testes de drogas¹. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) são particularmente úteis para estudos de modelagem de doenças, pois podem ser derivadas de pacientes, capturando diretamente o genoma responsável pelo fenótipo da doença ^2,3. Tais hiPSCs podem ser diferenciadas ao tipo celular afetado pelo defeito genético, permitindo um exame cuidadoso do mecanismo molecular da^doença4.

Protocolos de diferenciação para PSCs humanas visam a diferenciação direta de células através dos principais estágios de desenvolvimento por ativação ou inibição de vias de sinalização específicas que governam o comprometimento e especificação da linhagem. A manutenção da hiPSC em um estado pluripotente requer níveis moderados de sinalização da Activin A (Act-A), enquanto uma dose elevada de Act-A por 3 dias compromete a hiPSC a um destino definitivo da endoderme (DE) ^5,6. As vias Act-A e Wnt direcionam a identidade anteroposterior do DE. A sinalização por Act-A induz marcadores do intestino anterior (FG) como HHEX, HNF4α e GATA4, enquanto bloqueia a expressão de genes do intestino posterior (HG) como CDX2. A sinalização Wnt induz a posteriorização do DE, que adota um perfil de expressão do gene HG ^7,8. Uma vez estabelecida a identidade celular HG, a diferenciação pode ser movida de 2D para 3D e direcionada para a formação de organoides intestinais.

Os organoides intestinais são tipicamente cultivados em um sistema de cultura baseado em matriz extracelular 3D (por exemplo, Matrigel ou outras MECs compatíveis)⁹, composto por laminina, colágeno IV e entactina e enriquecido com fatores de crescimento como EGF, FGF, PDGF e IGF-1 para contribuir para a sobrevivência e proliferação de suporte. Os organoides são cultivados em um meio definido contendo Gastrin, Noggin e CHIR para estimular e apoiar o crescimento e proliferação de células-tronco intestinais durante o cultivo de longo prazo.

Depois que as células epiteliais intestinais são incorporadas à matriz extracelular, as criptas intestinais começam a se formar e se expandir, eventualmente formando esferoides. Estes amadurecem em estruturas organoides que mimetizam o funcionamento fisiológico do epitélio intestinal. Os organoides podem tipicamente ser cultivados por mais de 1 ano sem perda significativa dos perfis funcional e de expressão gênica. A passagem é necessária semanalmente usando a digestão enzimática dos organoides em fragmentos menores que então se auto-remontam em organoides completos.

Linhagens organoides estabelecidas podem ser utilizadas como modelo confiável de inúmeras desordens ligadas ao intestino, incluindo Doença de Crohn, Retocolite Ulcerativa e cânceres colorretais10,11,12,13. Este é um modelo preferido às células animais, pois elas expressam genes humanos ligados a esses distúrbios e respondem a estímulos externos mais parecidos com o que ocorre no tecido humano in vivo.

Protocolo

NOTA: Todo o trabalho de cultura de tecidos detalhado abaixo deve ser feito em uma capela de fluxo laminar Classe II.

1. Diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) para a endoderme do intestino posterior

1. Para revestir um frasco de cultura celular com matriz extracelular, primeiro calcule a quantidade de matriz necessária. Aqui está um exemplo de uma placa de 12 poços sendo revestida com Matrigel. Calcule a quantidade necessária de matriz extracelular para revestir uma placa de 12 poços. Use a seguinte fórmula:
   
   OBS: Revestir placas de cultura de células com matriz extracelular de escolha. Se utilizar Matrigel, utilizar uma concentração de 0,035 mg/cm² 24 h antes da semeadura para diferenciação. Verifique a concentração do lote de matriz extracelular na folha do produto e prepare alíquotas menores antes dos experimentos de acordo com as instruções do fabricante.
2. Diluir a quantidade necessária de matriz extracelular em meio DMEM frio usando uma pipeta p1000.
3. Misture bem usando uma stripette de 5 mL.
4. Adicionar 500μL de matriz diluída a cada placa de poço. Agitar suavemente a placa para distribuir uniformemente a matriz extracelular diluída e incubar durante um mínimo de 12 h a 37 °C.
5. Antes de semear as células para a placa, lave cada poço com 500 μL de PBS para remover o excesso de matriz extracelular. Isso evitará o descolamento celular durante a diferenciação.
6. Deixe a última lavagem nos poços até que esteja pronta a semeadura para evitar a secagem da matriz extracelular.
7. Para semear a diferenciação das hiPSCs em endoderme definitivo (DE) ou intestino posterior (HG), pegue um frasco de hiPSCs cultivadas em um meio de manutenção de escolha (por exemplo: 8 meios essenciais) e aspirar o meio. (Aqui, semeamos células a 25.000 células/cm²).
   NOTA: A densidade de semeadura é crucial para o sucesso da diferenciação e precisa ser otimizada para cada linhagem celular hiPSC individual.
8. Lavar as células no balão com 5 ml de PBS. Aspirar o PBS.
9. Adicionar 2,5 mL de solução de dissociação celular (por exemplo, TrypLE) e deixar em RT por 4 min. Aspirar a solução de dissociação celular e bater suavemente no balão para separar as células.
10. Lavar o balão com 5 ml de meio DMEM aquecido a 37 °C e recolher todas as células num tubo de 15 ml.
11. Tome 10 μL de solução celular ressuspensa e meça a densidade celular com um hemocitômetro.
12. Pegue o suficiente da suspensão celular para coletar 1,05 x 10⁶ células e coloque em um tubo de 15 mL.
13. Gire a 160 x g por 3 min. Enquanto as células estão sendo centrifugadas, aspirar PBS da matriz extracelular revestida placa de 12 poços.
14. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 12 mL de meio de manutenção com inibidor de ROCK (10 μM).
15. Usando uma pipeta p1000, adicionar 1 mL de suspensão celular a cada poço da placa de 12 poços. Ressuspenda bem as células para garantir uma distribuição igual entre os poços.
16. Agite a placa suavemente para distribuir as células dentro dos poços da placa, mas evite o rodopio do meio, pois ele concentrará as células no meio dos poços.
17. Colocar numa incubadora a 37 °C, 5% CO₂ .
18. Mude a mídia para a mídia de manutenção (por exemplo, mídia essencial 8) apenas (sem inibidor de ROCK) 24 horas após a semeadura.
19. Para iniciar a diferenciação com DE, preparar a média basal da endoderme de acordo com a Tabela 1.
    NOTA: No início da diferenciação as células devem estar entre 60-80% de confluência.
20. Preparar 12 mL de meio DE adicionando Activin A (100 ng/mL) e Wnt3 (50 ng/mL) ao meio basal da endoderme.
21. Aqueça o meio a 37 °C.
22. Aspirar o meio de cada poço da placa ou frasco de cultura de tecidos.
23. Inicie a diferenciação do DE adicionando 1 mL de meio DE a cada poço da placa de 12 poços.
24. Em 24 h após iniciar a diferenciação de DE (D1 DE), prepare novos meios de DE e realize a troca de meios.
25. Repita o passo 1,24 às 48 h (D2 DE). Se houver muita morte celular nesta fase, lave todos os poços com 500 μL de PBS antes da mudança de meio.
    NOTA: Para confirmar o sucesso da diferenciação endodérmica, realizar citometria de fluxo para avaliar a expressão de SOX17. Normalmente esperamos que >80% das células sejam SOX17 positivas por D3 DE. Se a expressão de SOX17 for subótima, a densidade de semeadura celular deve ser otimizada, bem como as concentrações de Act-A.
26. Iniciar a diferenciação HG neste ponto, ou seja, 72 h após o início da diferenciação de ED. Preparar 12 mL de meio HG adicionando CHIR99021 (3 μM) e RA (1 μM) ao meio basal da endoderme (Tabela 1).
    NOTA: Em D3 DE a célula deve ter formado uma monocamada uniforme. A diferenciação ótima do DE é crucial para estágios posteriores de diferenciação.
27. Aspirar meio DE.
28. Iniciar a diferenciação HG adicionando 1 mL de meio HG a cada poço da placa de 12 poços.
29. Continue a diferenciação por 4 dias com trocas diárias de mídia.
    NOTA: Para determinar o sucesso da posteriorização do DE, realizar citometria de fluxo para avaliar a expressão de CDX2. Em D4 de diferenciação HG normalmente esperamos que >80% das células sejam CDX2 positivas. Se a posteriorização for subótima, a concentração de CHIR99021 deve ser otimizada.
30. Para coletar uma amostra para extração de RNA, aspirar o meio de diferenciação e lavar o poço com 500 ul de PBS.
31. Aspirar PBS e adicionar um volume adequado de tampão de lise celular de um kit de extração de RNA.
32. Usando uma pipeta p1000, raspe o fundo do poço para garantir a lise de todas as células.
33. Aspirar o lisado celular e colocar em um tubo limpo.
34. Proceder à extracção de ARN ou congelar o lisado a -20 °C até estar pronto para a extracção de ARN.
35. Para imunomarcação, aspirar meios de diferenciação e lavar poços com 500 μL de PBS.
36. Aspirar o PBS e adicionar 500 μL de PFA a 4%.
    NOTA: PFA é tóxico. Use EPIs apropriados e siga os procedimentos laboratoriais locais para o descarte de PFA.
37. Incubar a 4 °C durante 20 min.
38. Remova o PFA e lave os poços com 500 μL de PBS três vezes.
39. Deixe a última lavagem PBS nas células até que esteja pronto para realizar a imunomarcação.

2. Passagem de organoides intestinais

1. Preparar o meio intestinal basal de acordo com a Tabela 2.
2. Para transferir da cultura de células 2D para 3D, use uma placa de 6 poços para gerar células DE de hiPSCS. Separar a monocamada de células da placa de 6 células usando uma stripette de 5 mL.
3. Coletar células em um tubo de centrífuga de 15 mL, antes de centrifugar a 400 x g por 1 min para produzir um pellet de células.
4. Ressuspender o pellet celular em meios de crescimento intestinal contendo fatores de crescimento: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), Gastrina (10 nM), Noggin (100 ng/μL), EGF (500 ng/μL), R-Spondin1 (100 ng/mL), CHIR99021 (6 μM), inibidor de ROCK (10 μM).
5. Adicionar volume adequado de matriz extracelular dependendo do número de poços a serem banhados. Isso pode ser calculado usando as equações abaixo.
   [1] Volume total de matriz/meio extracelular (μL) = 30 μL * número de poços de placa de 48 poços
   [2] Volume necessário de matriz extracelular (μL) = Resposta de [1] * 2/3
   [3] Volume necessário de mídia (μL) = Resposta de [1] * 1/3
6. Adicionar 30 μL de suspensão celular ao centro de cada poço de uma placa de 48 poços.
7. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C durante um período mínimo de 5 minutos para permitir a fixação da matriz extracelular.
8. Uma vez que as cúpulas da matriz extracelular tenham se definido, adicione 300 μL de meios de crescimento intestinal contendo todos os fatores de crescimento a cada poço.
9. Devolver a placa a uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: Se após 48 h nenhum organoide puder ser observado e/ou houver morte celular significativa As concentrações de ROCKi e NOGGIN podem precisar ser otimizadas.
10. Para passar os organoides, observe as células sob um microscópio de luz para avaliar a densidade e o tamanho dos organoides e determinar se eles precisam de passagem.
11. Substitua o meio de cultura celular por PBS gelado.
    NOTA: As culturas de organoides precisarão ser divididas aproximadamente a cada 5-7 dias. A passagem de culturas de organoides intestinais é necessária uma vez que há um acúmulo de restos celulares evidentes dentro do lúmen organoide e um amarelamento do meio de crescimento intestinal circundante.
12. Desprender mecanicamente organoides e esfera de matriz extracelular da placa usando um movimento de raspagem com uma stripette de 5 mL.
13. Recolher os organoides de cada poço num tubo de centrifugação de 15 ml.
14. Centrifugar a suspensão organoide a 400 x g por 1 min para pellet os organoides. Aspirar o sobrenadante até atingir o topo da pastilha celular, tomando cuidado ao atingir a camada visível da matriz extracelular.
15. Ressuspender o pellet em 15 mL de PBS gelado.
    NOTA: Esta etapa serve para lavar qualquer matriz extracelular remanescente que não foi removida no spin inicial.
16. Centrifugar a 400 x g por 1 min. Aspirar o meio até o pellet, contendo os organoides.
17. Ressuspender em 1 mL de PBS gelado. Usando uma pipeta p200, interrompa manualmente os organoides intactos pipetando para cima e para baixo várias vezes.
    NOTA: Observe o tamanho dos organoides usando microscópio de luz para determinar se eles precisam ser dissociados ainda mais.
18. Adicionar 9 mL de meio sem fatores de crescimento.
19. Centrifugar a 400 x g por 1 min. Aspirar o sobrenadante até a pastilha de organoides.
20. Calcule a quantidade necessária de matriz e meios extracelulares usando as equações abaixo:
    [1] Volume total de matriz/meio extracelular (μL) = 30 μL * número de poços de placa de 48 poços
    [2] Volume necessário de matriz extracelular (μL) = Resposta de [1] * 2/3
    [3] Volume necessário de mídia (μL) = Resposta de [1] * 1/3
21. Ressuspender a pastilha organoide no volume calculado do meio intestinal com fatores de crescimento (incluindo inibidor de Noggin & ROCK).
22. Adicione o volume necessário de matriz extracelular nesta suspensão celular e ressuspenda para garantir a distribuição uniforme dos organoides.
23. Pipetar 30 μL desta suspensão para o centro de cada poço de uma placa de 48 poços (de preferência pré-aquecida numa incubadora a 37 °C).
24. Retornar a placa a uma incubadora de 37 °C por 5 min até que a matriz extracelular esteja definida.
25. Preparar meios intestinais com fatores de crescimento (+ inibidor de ROCK) (aproximadamente 17 mL por placa de 48 poços).
26. Adicione 300 μL a cada poço.
27. Incubar a 37 °C a 5% de CO₂.
28. Após a passagem, aspirar o meio para os organoides intestinais e substituir por meios intestinais frescos com fatores de crescimento (sem inibidor de Noggin & ROCK) a cada 2-4 dias.
    NOTA: Se após 48 horas nenhum organoide puder ser observado e/ou houver morte celular significativa As concentrações de ROCKi e NOGGIN podem precisar ser otimizadas.
    NOTA: Os organoides intestinais respondem a uma série de mediadores inflamatórios in vivo. O TNFα é uma proteína de sinalização celular envolvida em diversos processos inflamatórios.
29. Para desencadear uma resposta inflamatória em organoides intestinais, preparar TNFα a uma concentração de 40 ng/mL apenas em meios basais.
30. Meio aspirado a partir de placa de 48 poços.
31. Adicionar 300 μL de meio basal preparado contendo 40 ng/mL de TNFα.
32. Incubar a placa a 37 °C durante 48 horas para replicar um ambiente pró-inflamatório.
    NOTA: Os organoides intestinais respondem a uma série de mediadores inflamatórios in vivo. O TNFα é uma proteína de sinalização celular envolvida em diversos processos inflamatórios.
33. Eliminar quaisquer células remanescentes por aspiração para uma armadilha de vácuo contendo 5% de Trigene.

Resultados

Um esquema do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1A. No dia 1 do protocolo, as hiPSCs devem estar compactas e formando pequenas colônias com confluência total de aproximadamente 50-60%. 24 horas após a indução da diferenciação para células DE começam a migrar para longe das colônias de células-tronco para formar uma monocamada de células. Isso continua nos 3 dias seguintes e deve formar uma monocamada completa em D3 de diferenciação do DE (Figura 1). A expressão gênica deve ser monitorada ao longo da diferenciação com marcadores de pluripotência (OCT4, NANOG, SOX2) altamente expressos em D0 e rapidamente regulados para baixo durante a diferenciação de DE. Durante a diferenciação de DE, a expressão de T deve atingir o pico em D1, seguida por EOMES e MIXL em D2. Em D2 os genes DE (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) devem começar a ser expressos e atingir pico em D3 (Figura 2 e Figura 3). As células devem ser uma monocamada por DE D3 e podem então ser posteriorizadas na endoderme do intestino posterior. Durante o evento de posteriorização, as estruturas 3D começarão a se formar já em D2. No entanto, às vezes eles só começam a aparecer no D4 ou não aparecem; isso nem sempre é indicativo de que as células irão ou não prosseguir e formar organoides intestinais (Figura 1). Durante a especificação HG a expressão de CDX2 e HNF4a deve ser induzida e aumentar ao longo do tempo (Figura 3).

Após a transferência de folhas 2D de células para matriz extracelular, aglomerados de células 2D serão observados durante as primeiras 24 h. Após 48 h, as folhas de células devem começar a se auto-organizar em estruturas esferoides 3D mais compactadas, inicialmente pequenas (Figura 4A) e aumentar gradualmente em tamanho e complexidade ao longo de 7-10 dias de cultura (Figura 4B e Figura 4C). Os organoides não devem ser passados até que tenham atingido uma morfologia organoide/esferoide clara com epitélio óbvio com o lúmen voltado para o centro do organoide/esferoide (Figura 4D). Nessa fase, a imunocitoquímica pode ser utilizada para confirmar a expressão de marcadores intestinais como vilina e CDX2 (Figura 5). Nem todos os aglomerados de células 2D se desenvolverão em organoides e haverá algumas células mortas contaminantes dentro da matriz extracelular. Essas folhas mortas de células devem ser ignoradas até que as células sobreviventes tenham formado grandes organoides e estejam prontas para a passagem.

Para modelar a inflamação, o TNFα pode ser adicionado ao meio de cultura de tecidos por 24-48 h. Após a incubação com moléculas pró-inflamatórias, os organoides são colhidos usando a mesma técnica usada para seu isolamento e passagem e, em seguida, lisados usando uma aplicação compatível com tampão celular, como QPCR ou western blotting. Se forem necessárias exposições mais curtas, os organoides devem primeiro ser removidos da matriz extracelular e expostos ao TNFα em suspensão com um tubo de 1,5 mL. O tratamento de organoides intestinais com TNFα por 48 h tipicamente induz a expressão de marcadores pró-inflamatórios (TNFα, IL1B, IL8, IL23) enquanto afeta negativamente a expressão de marcadores epiteliais intestinais (LGR5, VIL) (Figura 6).

Endoderme média basal		50 mL
RPMI 1640 |		48,5 mL
Suplemento B27		1 mL
1% NEAA		0,5 mL

Tabela 1: Composição do meio basal endodérmico para diferenciação endodérmica.

Média Intestinal Basal		50 mL
DMEM/F12 avançado		46,5 mL
Tampão HEPES		0,5 mL
GlutaMAX		0,5 mL
Nicotinamida		0,5 mL
Suplemento N2		0,5 mL
Suplemento B27		1,0 mL
Caneta/Strep		0,5 mL

Tabela 2: Composição do meio basal intestinal para cultura de organoides intestinais

Figura 1: Alterações morfológicas durante a diferenciação da hiPSC via endoderme definitiva para a linhagem do intestino posterior.
(A) Visão geral esquemática do protocolo de diferenciação intestinal. Esta linhagem celular de hiPSC forma colônias soltas de pequenas células com uma alta relação núcleo/citoplasma. À medida que a diferenciação prossegue, as células sofrem alterações consistentes com a transição do fenótipo epitelial para o mesenquimal e por DE D3 formam uma monocamada uniforme. Uma vez que os sinais apropriados são entregues, as células DE se alongam e formam uma monocamada mais densamente compactada com esferoides 3D aparecendo assim que HD D3, mas isso depende da linhagem celular usada e não é um requisito para a transição para a cultura 3D (B). Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A diferenciação das hiPSCs com a endoderme HG induz a expressão de genes endodérmicos.
A imunomarcação da hiPSC diferenciando-se da endoderme definitiva mostra alterações na expressão de FTs em nível proteico. Os marcadores de pluripotência (NANOG e OCT4) são regulados negativamente pelo DE D3 (A). A expressão do marcador mesendodérmico BRA(T) está presente em D1 do protocolo (B) e os FTs específicos para DE SOX17 e FOXA2 aparecem em D2 (B & C). Barra de escala: 200 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Alterações na expressão gênica por qPCR durante a diferenciação da hiPSC para endoderme do intestino posterior (HG).
Os genes associados à pluripotência são downregulated (OCT4, NANOG, SOX2), seguidos pela expressão transitória de genes mesendodérmicos (T, EOMES, MIXL1) e, finalmente, expressão de genes DE (SOX17, FOXA2, CXCR4) e genes do intestino posterior (CDX2, GATA4, HNF4a). Dados apresentados como média ±DP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A endoderme HG se auto-monta para formar organoides intestinais 3D em cultura de matriz extracelular 3D.
A endoderme HG é transferida para uma cultura de matriz extracelular 3D adequada e inicialmente forma pequenos aglomerados sólidos de células (A). Os aglomerados de endoderme HG expandem-se ao longo de 7-10 dias de cultura (B) e então tornam-se assimétricos e começam a formar um epitélio mais complexo (C), eventualmente dando origem a organoides com morfologia epitelial clara e uma superfície luminal voltada para o centro do organoide (D). Barras de escala = 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Os organoides intestinais derivados da hiPSC estabelecidos expressam marcadores intestinais.
Imunocitoquímica mostrando expressão de CDX2 e Villin. Barras de escala = 100 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Efeito do TNFα sobre o perfil inflamatório e expressão de células intestinais de organoides intestinais saudáveis.
Perfil inflamatório de organoides colônicos saudáveis após tratamento de 48 horas com TNFα (40 ng/mL). A expressão de marcadores pró-inflamatórios (TNFα, IL-8 e IL-23) aumenta após a exposição ao TNFα, enquanto ao mesmo tempo a expressão de marcadores epiteliais intestinais (LGR5, VIL) é regulada para baixo. As análises estatísticas foram realizadas pelo teste t de Student bicaudal. Os dados foram expressos como média ± DP de cada grupo. *P < .01; **P < .001; P < .0001. (n=3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais humanos. Demonstramos seu uso para estudar a inflamação; no entanto, isso pode ser aplicado a vários contextos e, juntamente com abordagens de edição genética CRISPR/Cas9¹⁴, em qualquer background genético. Uma vez diferenciados, seguindo a sequência natural de diferenciação do desenvolvimento da endoderme definitiva, endoderme do intestino posterior e, em seguida, do epitélio intestinal, os organoides resultantes podem ser continuamente cultivados e passados por mais de 12 meses.

Um aspecto crítico deste protocolo é a densidade inicial de plaqueamento de células-tronco indiferenciadas antes da diferenciação da endoderme. Se isso não for otimizado o suficiente, as células provavelmente morrerão durante a etapa inicial de diferenciação de DE (se as células forem muito esparsas) ou reduzirão a eficiência da diferenciação de DE (se as células forem muito densas). A densidade de partida correta precisa ser otimizada para a linha celular que está sendo usada, e a densidade correta deve gerar uma monocamada até o final do DE D3. A citometria de fluxo deve ser usada para determinar a eficiência da especificação de DE e tipicamente vemos >80% de células positivas para SOX17 e/ou CXCR4. Quando o número de células positivas para SOX17 é inferior a 60%, a eficiência da padronização de HG é afetada, o que resulta em menos organoides se formando quando transferidos para a matriz extracelular. Isso acabará fazendo com que as culturas organoides resultantes falhem. Para determinar se a padronização de DE para HG foi bem-sucedida, avaliamos o número de células CDX2 positivas por citometria de fluxo e normalmente esperamos ver >80% de células positivas. Novamente, se o número de células CDX2 positivas cair abaixo de 50%, isso terá um efeito adverso sobre o número de organoides intestinais que são gerados quando transferidos para cultura de matriz extracelular 3D.

Após a transferência de monocamadas 2D para a cultura 3D, pequenas esferas compactas devem aparecer 24-48 h após a transferência. Grandes folhas de células mortas podem aparecer dependendo da eficiência de diferenciação para a linhagem celular utilizada. Em vez de passar imediatamente culturas para remover esses detritos, permitimos que os organoides se formem e desenvolvam completamente sua estrutura mais complexa e dobrada. Esperar 7-10 dias antes de tentar a primeira passagem garante que células em divisão suficientes estão presentes para gerar muitos novos organoides intestinais. Qualquer detrito que ainda esteja presente na cultura pode ser facilmente removido durante o processo de passagem girando lentamente as misturas organoides/detritos dissociados em um tubo com velocidade suficiente para pellet os organoides, mas deixar folhas de células flutuando no meio. Os detritos médios e celulares podem então ser aspirados para que apenas a pastilha de organoides permaneça.

A limitação dessa abordagem é que os tipos celulares derivados da hiPSC não estão frequentemente totalmente maduros em termos de expressão gênica e perfis funcionais. Para determinar se o tecido intestinal derivado da hiPSC é adequado para aplicações específicas, os organoides devem ser caracterizados para diferentes tipos celulares, incluindo enterócitos (VIL), células enteroendócrinas (neurog3), células caliciformes (MUC2), células amplificadoras transitórias (CD133), células paneth (FZD5) e células-tronco LGR5⁺ (LGR5) para determinar a composição celular organoide.

De modo geral, a grande vantagem desse protocolo sobre muitos outros protocolos de diferenciação de organoides é que essa plataforma de cultura é muito custo-efetiva devido à substituição de várias proteínas recombinantes e preparações de meios condicionados por pequenas moléculas^15,16. A diferenciação em HG é muito simples e rápida e pode ser aplicada tanto a células-tronco embrionárias humanas quanto a células-tronco pluripotentes induzidas com resultados idênticos. Quando seguido rigorosamente e otimizado para as linhagens celulares em uso, fornece uma plataforma modelo relativamente simples, livre de células mesenquimais contaminantes, que pode então ser aplicada para estudar o epitélio intestinal em uma variedade de contextos, incluindo inflamação, interações do patógeno do hospedeiro⁷. A modelagem da fibrose intestinal pode ser investigada fornecendo estímulos pró-fibróticos e, em seguida, avaliando a expressão de proteínas da matriz extracelular, como colágeno, laminina e fibronectina, por QPCR, western blot e ELISA. O uso de técnicas de edição gênica CRISPR/Cas9 em linhagens de células-tronco indiferenciadas antes da diferenciação permite a criação de organoides de nocaute gênico ou superexpressão de proteínas que poderiam ser usados para criar organoides específicos de doenças e modelos de doenças mais complexos 14,17,18.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
A83-01	Tocris	2939
Activin A	R& D	338-AC
Advanced DMEM/F12 (1X)	Life Technologies	12654-010
Suplemento B27	Gibco	17504044
CHIR99021	Sigma	SML1046-5MG
Fator de Crescimento Epidérmico	R& D Systems	236-EG-01M
Gastrin	Sigma Aldrich	G9145
GlutaMAX (100X)	Life Technologies	15630-056
Fator de crescimento reduzido Matrigel	BD
HEPES Buffer solution (1M)	Life Technologies	15630-080
N2 Suplemento (100X)	Gibco	17502-048
N-acetil-cisteína	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamida	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	R & D Systems	6057-NG
Aminoácidos não essenciais	Gibco	11140-050
Paraformaldeído	VWR	9713.5
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122
Fosfato Tampolado Salino	Gibco	14190-094
Ácido Retinóico	Sigma	302-79-4
Inibidor de ROCK	Tocris	1254/1
inibidor de ROCK Y-27632	Tocris	1254
RPMI	Sigma	R8758-500ml
R-Spondin-1	Peprotech	120-38
SB202190	Tocris	1264
TrypLe Express	Gibco	12604-021
Wnt 3a	R& D	5036-WN