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Artigo de método

Avaliação dos efeitos do estresse na flexibilidade cognitiva usando um paradigma de mudança de estratégia operante

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DOI:

10.3791/61228

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4 de maio de 2020

 ,  , 
1Department of Psychology, Bryn Mawr College

Neste artigo

Resumo

Eventos de vida estressantes prejudicam a função cognitiva, aumentando o risco de transtornos psiquiátricos. Este protocolo ilustra como o estresse afeta a flexibilidade cognitiva usando uma estratégia de operante automatizada que muda paradigma em ratos de Sprague Dawley masculino e feminino. Áreas cerebrais específicas subjacentes a comportamentos particulares são discutidas, e a relevância translacional dos resultados é explorada.

Resumo

O estresse afeta a função cognitiva. Se o estresse aumenta ou prejudica a função cognitiva depende de vários fatores, incluindo o tipo 1, intensidade e duração do estressor; 2) tipo de função cognitiva em estudo; e 3) tempo do estressor em relação à aprendizagem ou execução da tarefa cognitiva. Além disso, as diferenças sexuais entre os efeitos do estresse na função cognitiva têm sido amplamente documentadas. Descrita aqui é uma adaptação de uma estratégia de operante automatizada que muda paradigma para avaliar como as variações no estresse afetam a flexibilidade cognitiva em ratos de Sprague Dawley masculinos e femininos. Especificamente, o estresse de contenção é usado antes ou depois do treinamento nesta tarefa baseada em operantes para examinar como o estresse afeta o desempenho cognitivo em ambos os sexos. Áreas cerebrais específicas associadas a cada tarefa neste paradigma automatizado foram bem estabelecidas (ou seja, o córtex pré-frontal medial e o córtex orbitofrontal). Isso permite manipulações direcionadas durante o experimento ou a avaliação de genes e proteínas específicos nessas regiões após a conclusão do paradigma. Esse paradigma também permite a detecção de diferentes tipos de erros de desempenho que ocorrem após o estresse, cada um dos quais definiu substratos neurais. Também são identificadas diferenças sexuais distintas em erros perseverativos após um paradigma de estresse de contenção repetido. O uso dessas técnicas em um modelo pré-clínico pode revelar como o estresse afeta o cérebro e prejudica a cognição em transtornos psiquiátricos, como transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) e transtorno depressivo maior (DMD), que apresentam diferenças sexuais acentuadas na prevalência.

Introdução

Em humanos, eventos de vida estressantes podem prejudicar a função cognitiva (ou seja, flexibilidade cognitiva1), que denota a capacidade de adaptar estratégias de processamento cognitivo para enfrentar novas condições no ambiente2. O comprometimento na cognição precipita e exacerba muitos transtornos psiquiátricos, como Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT) e Transtorno Depressivo Maior (DMD)3,4. Esses transtornos são duas vezes mais prevalentes nas fêmeas5,6,7,8, mas a base biológica para essa disparidade permanece desconhecida. Aspectos do funcionamento executivo em humanos podem ser avaliados usando a Tarefa de Classificação de Cartões de Wisconsin, uma demonstração de flexibilidade cognitiva2. O desempenho nesta tarefa é prejudicado em pacientes com TEPT9 e MDD10,mas a base neural dessa mudança só pode ser examinada por imagem cerebral11.

Avanços na compreensão de como o estresse afeta o cérebro têm sido feitos através do uso de modelos animais, particularmente roedores. Como a flexibilidade cognitiva é afetada em doenças relacionadas ao estresse, é um fenótipo excepcionalmente relevante para examinar em roedores. Até o momento, a maioria da literatura de neurobiologia do estresse tem utilizado um paradigma alternativo de flexibilidade cognitiva (às vezes referido como tarefa de escavação)12,13,14,15. Embora esta tarefa tenha sido extensivamente examinada, requer mais tempo e esforço do experimentador para treinar roedores. Adaptado e descrito aqui é um protocolo de mudança automatizada bem estabelecido16 para avaliar a flexibilidade cognitiva em ratos de Sprague Dawley masculino e feminino usando vários modelos de estresse17,18. O procedimento requer supervisão mínima do experimentador e permite que vários ratos sejam testados simultaneamente. Além disso, ao contrário de outras versões desta tarefa automatizada19,a adaptação desse paradigma requer apenas 3 dias de treinamento e inclui uma análise eficiente de dados programados.

Se o estresse melhora ou prejudica a função cognitiva depende do tipo, intensidade e duração do estressor, bem como do tempo do estressor em relação à aprendizagem ou execução de uma tarefa cognitiva20,21. Assim, o protocolo incorpora procedimentos de estresse antes e depois do treinamento operante. Também examina resultados representativos de estudos de estresse. Além disso, as regiões cerebrais subjacentes a aspectos particulares da mudança de conjunto foram bem estabelecidas2,16,22; assim, o relatório também descreve como direcionar e avaliar determinadas regiões cerebrais durante ou após os procedimentos de mudança de estresse e estratégia.

Tem havido pesquisas limitadas sobre o exame direto das diferenças sexuais na flexibilidade cognitiva18,23.  O protocolo descreve como 1) incorporar ratos machos e fêmeas no paradigma experimental, então 2) rastrear ciclos estrous antes e durante os procedimentos no ciclismo livre feminino. Estudos anteriores indicaram que o estresse antes do treinamento operante pode levar a déficits específicos do sexo na flexibilidade cognitiva em ratos17. Particularmente, ratos fêmeas exibem interrupções na flexibilidade cognitiva após o estresse, enquanto a flexibilidade cognitiva melhora em ratos machos após o estresse17. Curiosamente, uma das principais marcas de transtornos psiquiátricos relacionados ao estresse, que têm uma incidência sexual em humanos, é a inflexibilidade cognitiva. Esses resultados sugerem que as fêmeas podem ser mais vulneráveis a esse tipo de comprometimento cognitivo do que os homens. O uso dessas técnicas em modelos animais lançará luz sobre os efeitos do estresse no cérebro e como prejudica a cognição em transtornos psiquiátricos em humanos.

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Protocolo

Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Bryn Mawr College. Obtenha IACUC ou aprovação regulatória aplicável antes de encomendar animais de laboratório e iniciar a experimentação.

1. Preparação animal

  1. Adquira ratos adultos e masculinos Sprague Dawley.
    NOTA: Os ratos podem ser entregues antes dos 65 dias de idade, mas não iniciam os procedimentos até depois deste ponto para garantir que tanto os machos quanto as fêmeas estejam totalmente maduros.
  2. Pares de ratos do mesmo sexo pelo maior tempo possível, já que o isolamento a longo prazo é um estressor24. Para restrição alimentar, ratos de casa singly pouco antes do protocolo de mudança de estratégia operante.
  3. Após 1 semana de aclimatação, comece suavemente a manusear ratos por 3-5 minutos por dia. Colete o peso corporal de cada rato. Além disso, se estiver interessado em avaliar como os hormônios gonadal podem afetar os resultados, colete lavage vaginal para ratos fêmeas (descrito na seção 2).
  4. Restringir (de alimentos) animais que serão executados na estratégia operante mudando paradigma pelo menos 3 dias antes do treinamento começar para que eles aprendam com sucesso a tarefa. Certifique-se de que a água está sempre disponível livremente. Os registros escritos devem ser mantidos para cada animal documentar o consumo diário de alimentos e fluidos, o estado de hidratação e quaisquer alterações comportamentais e clínicas utilizadas como critério para a remoção temporária ou permanente de um animal de um protocolo (Morton 2000; NRC 2003b).
    1. Se utilizar um procedimento de estresse por mais de 3 dias antes do treinamento, ajuste a restrição alimentar para corresponder ao número de dias de estresse (por exemplo, 5 dias de restrição mais restrição alimentar25).
    2. Todos os dias, entregam 80% da ingestão alimentar diária normal (ou seja, 4 g de alimentos por 100 g de peso corporal)26. Use a coleta diária de peso para o rato para calcular quanto alimento dar por dia.
    3. Continue a restrição alimentar através dos dias de treinamento e teste. No entanto, não coloque comida na gaiola de casa até que o rato tenha concluído o treinamento ou testes para o dia, ou então eles não serão motivados a realizar as tarefas para uma recompensa de pelotas de alimentos. Certifique-se de que o tempo de entrega de alimentos aos ratos após a conclusão da tarefa é bastante imprevisível, uma vez que isso ajuda a evitar a redução da motivação para se apresentar na câmara operante (em favor de simplesmente esperar por comida na gaiola de casa depois).
      NOTA: Os animais submetidos ao paradigma de estresse de contenção não apresentam perda de peso significativamente maior do que o controle, sujeitos não estressados. No entanto, vários procedimentos de estresse podem induzir a perda de peso, resultando em ratos recebendo menos alimentos do que contrapartes não estressadas durante a restrição alimentar baseada em peso corporal. Isso pode apresentar um estressor adicional e confuso. Se esse for o caso, use alternativamente uma quantidade fixa de alimento dada a cada sujeito, independentemente do peso27.

2. Lavage vaginal

NOTA: Os hormônios gonadal (ou seja, estrogênio e progesterona) são conhecidos por afetar a resposta ao estresse e cognição28,29,30. Esses hormônios flutuam sobre o ciclo estrous de ratos fêmeas31. Se estiver interessado em acompanhar o ciclo estrous de roedores fêmeas livremente ciclistas para se correlacionar com dados de estresse ou flexibilidade cognitiva, colete o lavage vaginal conforme descrito abaixo. Os dados representativos considerando o estágio de ciclo estrous não são fornecidos.

  1. Para obter amostras de lavage vaginal de fêmeas, reúna água morna em um béquer limpo, um conta-gotas de vidro, um escorregador "lavage" (deslizamento de microscópio com círculos de tinta acrílica para segurar a amostra de lavage), e um béquer vazio.
  2. Encha o conta-gotas com uma pequena quantidade de água morna (~0,5 mL), depois insira a ponta na vagina do rato fêmea (levantando pela cauda). Expulse a água estéril 2x-3x e expulse o fluido coletado em uma lâmina microscópica. Não transborde o círculo de deslizamento de lavage.
  3. Expulse qualquer excesso de líquido no béquer vazio. Rotule o slide de lavagem com números de ratos e coloque as amostras de cada rato nessa ordem para que fique claro qual amostra pertence a cada rato.
  4. Enxágue completamente o conta-gotas, canalizando água quente limpa e distribuindo-a no béquer "excesso" várias vezes antes de encher o conta-gotas para provar o próximo rato.
  5. Leve cuidadosamente o slide de lavage para um microscópio de campo brilhante para imagem da amostra de lavagem e classifique o dia dentro do ciclo estrous como descrito em Becker et al31.
    NOTA: Idealmente, o lavagem deve ser feito por algumas semanas para acompanhar adequadamente o ciclo de uma fêmea e deve ser realizado em uma hora muito semelhante todos os dias para controlar os ritmos circadianos. Preferencialmente, este procedimento deve ser realizado antes dos procedimentos de mudança de estratégia estressante e de estratégia. O uso de cotonetes de algodão e soro fisiológico estéril também pode ser usado como alternativa a esta técnica de conta-gotas. Os dados para ratos do sexo feminino podem ser analisados pós-hoc de acordo com o dia do ciclo estrous (considere dias de ciclo em que o estresse é realizado e/ou dia de ciclo quando o teste ocorre).

3. Equipamentos e software

  1. Use câmaras operantes para treinamento comportamental e testes.
    1. Certifique-se de que as câmaras contenham pelo menos duas alavancas retráteis com duas luzes de estímulo acima, uma luz da casa e um dispensador para reforço para essas tarefas.
    2. Verifique se as alavancas estão em ambos os lados da área central de entrega de reforços com uma luz de estímulo acima de cada alavanca.
    3. Use a luz da casa para iluminar a câmara sem interferir na detecção do estímulo de luz (é melhor se a luz da casa estiver na parede traseira da câmara, em frente às alavancas e luzes de estímulo).
  2. Use pelotas de alimentos sem poeira (aqui, são utilizadas pelotas de 45 mg: 18,7% de proteína, 5,6% de gordura e 4,7% de fibra) para reforço em ratos restritos a alimentos. Não use pelotas altas em sacarose ou gordura (a menos que haja interesse em como o estresse afeta a ingestão de alimentos palatáveis).
  3. Controle a apresentação de estímulos, operação de alavanca e coleta de dados de um computador com software capaz de operar a câmara (Tabela de Materiais).
    NOTA: Para obter informações relacionadas à codificação de programas que utilizam este software, entre em contato com os autores. Os scripts MED-PC são incluídos como arquivos suplementares. Este software coleta informações sobre as respostas do animal para cada ensaio (qual alavanca é pressionada, se é correta/incorreta/nenhuma resposta e latência para fazer a escolha). A partir dessas informações, os usuários podem calcular várias medidas no paradigma comportamental, conforme descrito na seção de análise comportamental.
  4. Realizar treinamento/teste ao mesmo tempo todos os dias para controlar os ritmos circadianos nos hormônios do estresse32 (e outras medidas relevantes).
  5. Encha a bandeja inferior de cada caixa operante com roupas de cama frescas para coletar fezes/resíduos. Após cada sessão, despeje cada bandeja, limpe bandejas e interior de câmara com lenços umedecidos ou um desinfetante aprovado pela IACUC, e substitua por roupas de cama frescas antes de colocar um novo animal na câmara.

4. Procedimentos de estresse

  1. Decida se o procedimento de estresse deve ser realizado antes, durante e/ou após o treinamento sobre o paradigma de mudança de estratégia operante (por exemplo, 5 dias de estresse de contenção antes de 3 dias de treinamento operante versus 3 dias de treinamento operante seguido de uma única contenção e teste).
  2. Execute o procedimento de estresse ao mesmo tempo diariamente no que diz respeito ao treinamento operante. (por exemplo, 30 min de estresse de contenção a partir de 9 A.M., seguido de colocação na câmara operada).
  3. Realizar os procedimentos de estresse em uma sala separada tanto da sala da colônia quanto das salas de paradigma de mudança de estratégia (para garantir que não haja fatores de confusão associados ao estresse das testemunhas)33. Brevemente, coloque o rato em um tubo de contenção transparente estilo Broome e sele a abertura, tomando cuidado para não beliscar os membros ou cauda. Entre cada assunto, use um desinfetante aprovado pela IACUC para limpar o tubo estilo Broome. A higienização inadequada pode deixar feromônios para trás que podem afetar negativamente o protocolo de teste.
    NOTA: Estime quanto tempo o primeiro grupo de ratos passará nas câmaras operísticas. Isso vai variar dependendo do treinamento versus dia do teste; no entanto, depois de executar várias coortes, um tempo médio para concluir cada tarefa para estimar tarefas futuras pode ser calculado.
  4. Dependendo de quantas câmaras operadas estão disponíveis, escalone o procedimento de estresse para os sujeitos. Por exemplo, quatro ratos sofrem estresse de contenção e são colocados em quatro câmaras operísticas. Uma hora depois, mais quatro animais passam por procedimentos de estresse a serem seguidos pela câmara operante.

5. Treinamento

NOTA: Este paradigma é modificado a partir do procedimento de mudança de conjunto operante desenvolvido por Floresco et al. de tal forma que possa ser concluído em 3 dias19.  Os procedimentos de treinamento para ratos exigem 3 dias (1 dia para aprender cada tarefa conforme descrito abaixo). É raro que um rato não aprenda essas tarefas. Se um rato não aprender cada tarefa, ele deve ser excluído do estudo final. Consulte a Figura 1A para uma representação visual do paradigma de treinamento descrito abaixo.

  1. Antes de colocar o rato na câmara, certifique-se de que há pelotas de alimento suficientes no dispensador e que as caixas operantes estejam funcionando corretamente. Para isso, carregue e inicie um programa de treinamento ou dia de teste em uma câmara vazia, testando manualmente que a alavanca correta oferece adequadamente uma recompensa por prensa de alavanca.
  2. Treinando o rato para pressionar cada alavanca
    1. Antes de colocar o rato na caixa para o primeiro dia de treinamento, coloque manualmente uma recompensa de pelota de alimento na alavanca correta, conforme designado ao carregar o procedimento de treinamento dentro de cada câmara.
    2. Treine o rato usando um cronograma de razão fixa (FR-1), de tal forma que cada prensa de alavanca correta seja recompensada com um reforço. Contrabalancear a alavanca correta por dia entre os sujeitos e/ou condições experimentais (moldando apenas uma alavanca de cada vez) designando a alavanca correta ao carregar o procedimento de treinamento no computador que opera as câmaras.
    3. Deixe o rato pressionar a alavanca até atingir o critério pressionando a alavanca correta 50x, geralmente completando a tarefa entre 30-45 min.
    4. No dia seguinte, force o rato a realizar esta tarefa na alavanca oposta usando o mesmo programa do primeiro dia de treinamento, mas designe a alavanca oposta como a correta. Não há necessidade de "moldar" a alavanca com uma pelota de comida neste dia de treinamento. Normalmente, esse critério é rapidamente adquirido depois que os ratos aprenderam a pressionar a primeira alavanca.
  3. Treinando o rato para responder à luz
    1. No terceiro dia de treinamento, ilumine a luz acima de ambas as alavancas para ensaios de 15 s, durante os quais o rato pode pressionar uma das alavancas para potencialmente receber uma recompensa de pelotas de alimentos. Durante a tarefa de discriminação leve, este programa selecionará aleatoriamente qual alavanca está correta em uma base de teste por tentativa.
    2. Se o rato pressionar a alavanca correta, certifique-se de que as luzes permaneçam acesas por 3 s e a recompensa seja entregue, seguida de um período de 5 s, durante o qual as luzes são desligadas antes do próximo teste. Se o rato pressionar a alavanca incorreta, certifique-se de que nenhuma recompensa seja entregue e que as luzes sejam desligadas por 10 s antes do próximo teste.
    3. Após este último dia de treinamento, calcule o "viés lateral" para determinar se o rato tem preferência pela alavanca esquerda ou direita, dividindo o número de prensas de uma alavanca dividida pelo número total de prensas de alavanca. No dia do teste, o rato começará pelo seu lado menos preferido para garantir que está aprendendo a contingência específica de resposta-recompensa, em vez de responder a uma alavanca preferida.

6. Teste

NOTA: Consulte a Figura 1B para uma representação visual do paradigma de teste descrito abaixo.

  1. No dia 4 (dia do teste), coloque o rato na câmara operante após procedimentos de estresse e teste-os em discriminação lateral, reversão lateral e tarefas de discriminação leve em série. Certifique-se de que a tarefa de discriminação de luz só ilumina a luz acima da alavanca "correta". Em cada tarefa, os ratos devem alcançar consecutivamente oito ensaios corretos para completar cada discriminação sem pressionar a alavanca incorreta e não recompensada. Uma prensa de alavanca incorreta reiniciará esta cadeia de ensaios.
    1. Teste ratos usando a tarefa de discriminação lateral. Usando o programa de discriminação lateral, recompense o rato por pressionar a alavanca do seu lado menos preferido, conforme determinado a partir do terceiro dia de treinamento, independentemente da deixa leve. A tarefa termina ao pressionar a alavanca correta 8x consecutivamente (excluindo omissões).
    2. Realize o teste de reversão lateral executando ratos usando o programa de discriminação lateral novamente, mas desta vez designando a alavanca oposta à correta da tarefa de discriminação lateral como correta. Certifique-se de que o rato é recompensado por pressionar esta alavanca, independentemente da sinalização de luz. A tarefa termina ao pressionar a alavanca correta 8x consecutivamente (excluindo omissões).
    3. Realize a tarefa de discriminação leve, que recompensa o rato por pressionar a alavanca com a luz iluminada acima. Cada teste operante é completo ao pressionar a alavanca correta 8x consecutivamente (excluindo omissões).
      NOTA: Com base em estudos anteriores, essas tarefas codificam um mínimo de 30 ensaios, independentemente de prensas consecutivas, para garantir que os ratos tenham tempo suficiente para aprender as regras de cada tarefa18. Assim, se o rato conseguir consecutivamente oito ensaios corretos antes de 30 ensaios terem ocorrido, a tarefa permanecerá engajada até que 30 ensaios sejam concluídos.

7. Análise comportamental

NOTA: Os dados adquiridos para cada animal no dia do teste são automaticamente registrados e salvos pelo computador, desde que um script MED-PC para cada tarefa tenha sido iniciado e autorizado a ser concluído (consulte materiais suplementares para scripts MED-PC).

  1. Abra os dados para cada tarefa do dia do teste (discriminação lateral, reversão lateral e discriminação leve) usando o programa de computador. As principais medidas registradas pelo programa são ensaios ao critério, erros de critério e tempo de critério. Essas medidas estão descritas em detalhes abaixo.
    NOTA: Os autores geraram um script MATLAB que permite a automação do processo de análise, bem como a análise de erros perseverativos versus regressivos (autores de contato para informações de código para agilizar a análise de dados).
    1. Use ensaios para critério (que se refere ao número total de ensaios [sem incluir omissões] necessários para que o rato complete consecutivamente oito ensaios corretos, incluindo esses oito ensaios) como o principal indicador de precisão. Esses dados estão localizados na primeira coluna no array B em um arquivo de dados gerado pelo script MED-PC para qualquer uma das tarefas no dia do teste.
    2. Examine os erros totais cometidos durante cada tarefa. Esses dados estão localizados na terceira coluna do array B em um arquivo de dados gerado pelo script MED-PC para qualquer uma das tarefas no dia do teste. Esses erros também são categorizados em erros perseverantes ou regressivos. Erros perseverantes são cometidos quando o rato continua a seguir a regra anterior da tarefa anterior. Erros regressivos são cometidos após o desengativo da regra anterior, mas continuam tentando adquirir a nova regra (para mais detalhes sobre como esses tipos de erros são calculados, consulte o método publicado18).
    3. Se o rato não respondeu a uma leve sinalização dentro de 15 s, o julgamento é categorizado como uma omissão, e não contará para o número total de ensaios para critério. Calcule isso primeiro adicionando o número de respostas corretas (localizadas na segunda coluna do array B no arquivo de dados) e o número de erros (localizado na terceira coluna do array B no arquivo de dados). Em seguida, subtraia esse número do número total de ensaios para critério (este é o último número na primeira coluna do array B em um arquivo de dados, diferente dos ensaios ao critério).
    4. Use os tempos de início e término registrados pelo programa (localizados na parte superior de um arquivo de dados gerado pelo script MED-PC para qualquer uma das tarefas no dia do teste) para calcular o tempo para critério. A latência para a primeira prensa de alavanca também pode ser calculada a partir do arquivo de dados subtraindo a variável K (tempo decorrido em segundos da primeira prensa da alavanca) do tempo ao critério.
    5. Média dos dados para cada medida comportamental para ratos dentro do mesmo grupo de tratamento. Realizar análises estatísticas adequadas (dependendo de quantas variáveis estão sendo examinadas).

8. Substratos cerebrais

  1. Determine uma área cerebral interessada e/ou aspecto da flexibilidade cognitiva. Por exemplo, se o estresse aumenta erros perseverativos na tarefa de reversão lateral, o córtex orbitofrontal (OFC) pode ser de particular interesse, pois estudos anteriores de lesão indicaram que essa região cerebral desempenha um papel em muitas formas de aprendizado de reversão (ou seja, reversão espacial testada na tarefa de reversão lateral)34,35,36. Neste exemplo, os ratos de sacrifício após o paradigma de mudança de estratégia são concluídos e examinam c-fos (medida de ativação neural37) no OFC usando métodos imunohistoquímicos descritos25 e descritos brevemente aqui.
    1. Primeiro, extrair cérebros de animais e cortar em fatias de 40 μm.
    2. Lave o tecido em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) 4x por 5 min cada, depois incuba em peróxido de hidrogênio de 0,3% por 10 minutos para saciar peroxidases endógenas.
    3. Lave o tecido em PBS 2x por 5 min cada, depois incubar em anticorpo primário anti-c-fos do rato (1:500), 3% de soro normal de burro (NDS) e 0,3% Triton X durante a noite.
    4. No dia seguinte, lave o tecido em PBS 3x por 5 min cada, depois incuba em anticorpo anti-rato de jumento conjugado por biotina-SP (1:500) por 2 h.
    5. Lave o tecido em PBS 3x por 5 min cada, depois incubar no complexo avidin-streptavidin AB por 1 h.
    6. Lave o tecido em PBS 3x por 5 min cada, em seguida, incubar em solução DAB por até 10 minutos à medida que o tecido sofre uma reação cromogênica oxidação.
    7. Lave o tecido em PBS 3x por 5 min cada, em seguida, monte as fatias cerebrais em lâminas de microscópio de vidro.
    8. Cubra o tecido usando meio de montagem à base de tolueno e imagem usando um microscópio de campo brilhante.
      NOTA: Aqui, como refletido nos resultados representativos, os ratos são sacrificados 30 min após o fim do paradigma de mudança de estratégia, cerca de 60-90 min após a tarefa de reversão ter sido concluída (dependendo do desempenho de cada rato na tarefa de luz). Isso deve representar o tempo ideal para a expressão c-fos38,refletindo o desempenho na tarefa de reversão.
  2. Alternativamente, cannulate uma área cerebral específica para injeção de drogas ou injeção viral antes da execução do estresse ou da estratégia operante mudando paradigma.
    NOTA: Os pesquisadores podem querer examinar como a manipulação de substratos neurais altera os efeitos do estresse na flexibilidade cognitiva. Por exemplo, os pesquisadores podem bloquear um receptor de neurotransmissor específico no córtex pré-frontal antes do teste.

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Resultados

O paradigma de mudança de estratégia automatizada adaptada delineado acima foi usado para determinar se o estresse de contenção repetida afeta a cognição em ratos de Sprague Dawley masculinos e femininos. Os dados comportamentais representativos estão descritos na Figura 2 abaixo. Em suma, o controle e os ratos repetidamente contidos realizaram este teste de mudança de estratégia operante, que consistia em uma série de tarefas: discriminação lateral, reversão lateral e discriminação leve.

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Discussão

O protocolo demonstra como medir os efeitos do estresse na função cognitiva. Especificamente, um paradigma de mudança de estratégia operante modificado é usado em roedores, que mede a flexibilidade cognitiva (análoga à Tarefa de Classificação de Cartões de Wisconsin em humanos)1. A flexibilidade cognitiva denota a capacidade de adaptar estratégias de processamento cognitivo para enfrentar novas condições no ambiente, e é crucial para o funcionamento diário normal2. Como os ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer Hannah Zamore, Emily Saks e Josh Searle por sua ajuda no estabelecimento desta estratégia operante que muda paradigma no laboratório Grafe. Eles também gostariam de agradecer Kevin Snyder por sua ajuda com o código MATLAB para análise.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Conta-gotas de vidro de pipeta de 3 polegadasAmazon4306-30-012LCPara lavagem vaginal
Toalhetes com álcoolVWR15648-990Para limpar bandejas em caixas de deslocamento entre ratos
AffiniPure Donkey conjugado com biotina e SP anti-rato lgG (H + L), reação cruzada mínima a bovinos, frangos, cabras, porquinhos-da-índia, hamsters, cavalos, humanos, coelhos, proteínas de soro de ovelhasJackson ImmunoResearch715-065-150Todos os outros materiais de coloração do protocolo DAB são tampões / DAB padrão e não são especificados aqui, pois este não é o foco principal do papel de métodos
Anticorpo primário monoclonal de camundongo C-fosAbCamab208942Para colorir a ativação neural em áreas do cérebro após o deslocamento definido
Pellets de alimentos sem poeiraBio ServF0021Para caixas de deslocamento definidas (dispensador de recompensa)
GraphPad PrismUsado para análise de dados
Leica DM4 B Microscópio e software de imagem associadoLeicaMuitas peças diferentes para o microscópio e a estação de trabalho, para lavagem de imagens e/ou cfos
MatLabSoftware; código para ajudar a analisar os dados de deslocamento definidos, disponível mediante solicitação.
Med-PC Software SuiteMed AssociatesSOF-736Software; usa códigos para operar câmaras
operantes Câmaras operantesMed PCMED-008-B2Muitas peças diferentes para a configuração da câmara e software para trabalhar com ela; também escrevemos um código separado para mudança de conjunto, disponível mediante solicitação.
Roupa de cama para ratosEnvigoT.7097
Rat ChowEnvigoT.2014.15
Dispositivos de contençãoBryn Mawr CollegeFeito por nossa lojaPara exposição ao estresse; especificações disponíveis mediante solicitação.
Rabiscos 3d tinta para tecidoAmazon54139Para lavagem vaginal
Sprague Dawley RatsEnvigoPelo menos D65 Machos e Fêmeas
VWR Superfrost Plus Micro SlideVWR48311-703Para lavagem vaginal e/ou fatias/coloração de cérebro para c-fos

Referências

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