Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.
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Artigo de método
Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os mosquitos representam um problema significativo de saúde pública como vetores de vários patógenos. Para aqueles estudos que exigem uma avaliação dos parâmetros de aptidão do mosquito, em particular a produção de ovos e as taxas de escotilha no nível individual, os métodos convencionais têm colocado uma carga substancial sobre os pesquisadores devido à alta intensidade de trabalho e aos requisitos de espaço laboratorial. Descrito é um método simples usando 24 placas de cultura de tecido de poço com agarose em cada poço e imagem digital de cada poço para determinar números de ovos e taxas de escotilha em um nível individual com requisitos de tempo e espaço substancialmente reduzidos.
Introdução
O controle de mosquitos para proteger os humanos de patógenos transportados por vetores é um importante objetivo de saúde pública, principalmente devido à falta de vacinas eficazes para a maioria dos patógenos transportados por mosquitos. Muitos estudos visam reduzir o condicionamento físico do mosquito em conjunto com uma estratégia de redução populacional aplicável em campo1,2,3. Isso inclui estudos extensivos para criar mosquitos transgênicos e/ou linhas de nocaute CRISPR/Cas9. Tais abordagens de modificação populacional requerem uma avaliação detalhada dos parâmetros de a....
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Protocolo
1. Preparação da placa
- Furos em 24 tampas de placa de cultura de tecido bem (4-6 furos por poço) usando uma broca doméstica com um bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2).
NOTA: Esses orifícios evitam que a condensação da água se acumule na tampa, onde os mosquitos podem colocar ovos. O tamanho padrão do Ae. aegypti feminino (estirpe "Liverpool") é ~3,11 mm de envergadura. A redução do tamanho dos orifícios é recomendada ao usar mosquitos menores para evitar escapar da placa. - No dia anterior ao experimento de oviposição, lave e enxágue as placas completamente e mergulhe-as em 1-5% de alvejante por 30-60 min em temp....
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Resultados
Os mosquitos foram injetados com dsRNA visando um transportador de ferro candidato (FeT) ou gene de controle (EGFP), alimentado por sangue, e medidos para fecundidade e produção de fertilidade usando o método de placa EAgaL, seguindo o procedimento descrito acima.
Mosquitos em que a expressão fet foi silenciada após a injeção de dsRNA apresentaram uma redução significativa tanto no número de ovos quanto na taxa de escotilha (Figura 11A−C). Todos o.......
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Discussão
A placa EAgaL reduz drasticamente o trabalho, o tempo e o espaço para realizar ensaios individuais de fecundidade e fertilidade no Aedes aegypti quando comparado com o método FT. A comparação preliminar entre o método FT e a placa EAgaL resultou em tempos mais curtos para todas as etapas (a técnica de imagem foi aplicada ao método FT) (Tabela 1). Como referência, uma estimativa de inicialização e por ensaio (uma placa EAgaL de 24 poços versus 24 FTs) são fornecidas na Tabela 2
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse para este estudo.
Agradecimentos
Agradecemos ao Programa de Subvenção de Doenças Vetoriadas de Insetos da Texas A&M Agrilife Research pelo financiamento. Agradecemos também aos membros do laboratório Adelman pela ajuda no desenvolvimento deste método e sugestões na elaboração do manuscrito, bem como aos membros do laboratório de Kevin Myles. Agradecemos também aos revisores e editores por sua ajuda para tornar este manuscrito melhor.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,6 mm Φ broca | alternativamente pregos aquecidos podem ser usados | ||
| 1000 μ Pontas de pipeta L (longas) | Plásticos Olympus | 24-165RL | |
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Thermo Scientific | 930186 | transparente, fundo plano com placas de tampa em anel |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Câmara digital compacta | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computador (Windows, Mac ou Linux) | |||
| Água deionizada | |||
| Fiji (imageJ) download do software | de: https://fiji.sc/ | ||
| Fórceps | Dumont | fórceps afiado pode quebrar o corpo do mosquito | |
| Placas de Petri de vidro | VWR | ||
| Alvejante | |||
| Iluminador de broca | |||
| para estereomicroscópio (pescoço de ganso) | |||
| P-1000 pipeta | Pincéis Gilson | ||
| Bandas | |||
| de borracha Cartão | para gravar imagens de câmeras digitais (DSHC, SDXC deve ser melhor) | ||
| Software de planilha (Microsoft Excel) | Microsoft | Qualquer software de planilha funciona | |
| TetraMin comida para peixe | Tetra | moída com moedor de café, liquidificador ou argamassa e pilão | |
| Pipetas de transferência | VWR | 16011-188 |
Referências
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti....
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Reimpressões e permissões
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