Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Machine Learning Algoritmer för tidig upptäckt av Ben metastaser i en experimentell Rat Model

Published: August 16, 2020 doi: 10.3791/61235
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 1, 1
1Department of Radiology, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, 2Department of Medical Physics in Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 3Department of Internal Medicine 3, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Detta protokoll har utformats för att träna en maskininlärningsalgoritm för att använda en kombination av bildbehandlingsparametrar som härrör från magnetisk resonanstomografi (MRI) och positronemissionstomografi/datortomografi (PET/CT) i en råttmodell av bröstcancerben metastaser för att upptäcka tidig metastaserande sjukdom och förutsäga efterföljande progression till makrometastaser.

Abstract

Maskininlärning (ML) algoritmer tillåter integrering av olika funktioner i en modell för att utföra klassificering eller regression uppgifter med en noggrannhet som överstiger dess beståndsdelar. Detta protokoll beskriver utvecklingen av en ML algoritm för att förutsäga tillväxten av bröstcancer ben macrometastases i en råtta modell innan några avvikelser är observerbara med standard bildframställning metoder. En sådan algoritm kan underlätta detektering av tidig metastaserande sjukdom (dvs. mikrometastasis) som regelbundet missas under mellanstationer undersökningar.

Den tillämpade metastasmodellen är platsspecifik, vilket innebär att råttorna utvecklar metastaser uteslutande i sitt högra bakben. Modellens tumör-take-hastighet är 60%–80%, med macrometastases blir synliga i magnetic resonance imaging (MRI) och positron emissions tomografi/datortomografi (PET/CT) i en delmängd av djur 30 dagar efter induktion, medan en andra delmängd av djur uppvisar ingen tumör tillväxt.

Med utgångspunkt från bild undersökningar som förvärvats vid en tidigare tidpunkt, beskriver detta protokoll extraktion av funktioner som indikerar vävnad vascularization detekteras av MRI, glukos metabolism av PET/CT, och den efterföljande bestämning av de mest relevanta funktionerna för förutsägelse av makrometastatisk sjukdom. Dessa funktioner matas sedan in i ett modellsnitt neuralt nätverk (avNNet) för att klassificera djuren i en av två grupper: en som kommer att utveckla metastaser och den andra som inte kommer att utveckla några tumörer. Protokollet beskriver också beräkningen av standarddiagnostiska parametrar, såsom total noggrannhet, känslighet, specificitet, negativa/ positiva prediktiva värden, sannolikhetsförhållanden och utvecklingen av en mottagaroperativ. En fördel med det föreslagna protokollet är dess flexibilitet, eftersom det lätt kan anpassas för att träna en uppsjö av olika ML algoritmer med justerbara kombinationer av ett obegränsat antal funktioner. Dessutom, Det kan användas för att analysera olika problem i onkologi, infektion, och inflammation.

Introduction

Syftet med detta protokoll är att integrera flera funktionella bildbehandlingsparametrar från MRI och PET/CT i en modellsnittad neuralt nätverk (avNNet) ML-algoritm. Denna algoritm förutspår tillväxten av makrometastaser i en råtta modell av bröstcancer ben metastaser vid en tidig tidpunkt, när makroskopiska förändringar inom benet är ännu inte synliga.

Före tillväxten av makrometastaser, en benmärg invasion av spridas tumörceller förekommer, vanligen kallad mikrometastatisk sjukdom1,2. Denna inledande invasion kan betraktas som ett tidigt steg i metastaserande sjukdom, men är vanligtvis missat under konventionella mellanstationerundersökningar 3,4. Även om de för närvarande tillgängliga bildhanteringsmodaliteterna inte kan detektera mikroinvasion av benmärg när den används ensam, har en kombination av bildframställningsparametrar som ger information om vaskularisering och metabolisk aktivitet visat sig presterabättre 5. Denna kompletterande fördel uppnås genom att kombinera olika avbildningsparametrar till en avNNet, som är en ML-algoritm. En sådan avNNet möjliggör tillförlitlig förutsägelse av ben macrometastases bildning innan några synliga metastaser är närvarande. Därför kan integrera imaging biomarkörer i en avNNet fungera som en surrogat parameter för benmärg microinvasion och tidig metastaserande sjukdom.

För att utveckla protokollet, en tidigare beskriven modell av bröstcancer benmetastaser i naken råttor användes6,7,8. Fördelen med denna modell är dess plats-specificitet, vilket innebär att djuren utvecklar beniga metastaser uteslutande i sitt högra bakben. Dock är tumör-ta andelen av detta tillvägagångssätt 60%–80%, så ett ansenligt antal av djuren inte utvecklar några metastaser under studien. Med hjälp av bildframställning modaliteter såsom MRI och PET / CT, förekomsten av metastaser är detekterbar från dag 30 postinjection (PI). Vid tidigare tidpunkter (t.ex. 10 PI) avbildning skiljer inte mellan djur som kommer att utveckla metastaserande sjukdom och de kommer inte (Figur 1).

En avNNet utbildad på funktionella bildframställning parametrar förvärvade dag 10 PI, som beskrivs i följande protokoll, tillförlitligt förutsäger eller utesluter tillväxten av makrometastaser inom följande ~ 3 veckor. Neural Networks kombinera konstgjorda noder inom olika lager. I studieprotokollet representerar de funktionella bildframställningsparametrarna för benmärgsblodtillförsel och metabolisk aktivitet det nedersta lagret, medan förutsägelsen av malignitet representerar det översta lagret. Ett ytterligare mellanlager innehåller dolda noder som är kopplade till både det övre och det nedersta lagret. Styrkan i sambanden mellan de olika noderna uppdateras under utbildningen av nätverket för att utföra respektive klassificeringsuppgift med hög noggrannhet9. Noggrannheten i ett sådant neuralt nätverk kan ökas ytterligare genom att medelvärdet av utgångarna av flera modeller, vilket resulterar i en avNNet10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla vård- och försöksförfaranden utfördes i enlighet med nationell och regional lagstiftning om djurskydd, och alla djurprocedurer godkändes av delstatsregeringen i Franken, Tyskland (referensnummer 55,2 DMS-2532-2-228).

1. Induktion av bröstcancer benmetastaser i högra bakbenet av nakna råttor

OBS: En detaljerad beskrivning av induktion av bröstcancer benmetastaser i nakenråttor har publicerats någon annanstans6,8. De mest relevanta stegen presenteras nedan.

  1. Kultur MDA-MB-231 mänskliga bröstcancerceller i RPMI-1640, kompletteras med 10% fetala kalv serum (FCS). Håll cellerna under standardförhållanden (37 °C, 5% CO2) och passage cellerna 2–3 gånger i veckan.
  2. Tvätta nästan-konfluent MDA-MB-231 celler med 2 mM EDTA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och sedan lossa cellerna med 0,25% trypsin. Bestäm cellkoncentrationen med en Neubauers kammare och återanvänd dem i 200 μL RPMI-1640 vid en koncentration på 1,5 x 105 celler/200 μL.
  3. Använd 6–8 veckor gamla nakenråttor och håll dem under patogenfria, kontrollerade förhållanden (21 °C ± 2 °C rumstemperatur, 60 % luftfuktighet och 12 h ljus-mörk rytm). Erbjud autoklaverad matning och vatten ad libitum.
  4. Innan operationen utfördes, injicera ett smärtstillande läkemedel (t.ex. Carprofen 4 mg/kg) subkutant. Söva råttor med en isofluran (1–1,5 vol. %)/syreblandning vid en flödeshastighet på 2 L/min. Kontrollera anestesetesdjupet genom att dra ihop sig till tå.
  5. För kirurgi, använd ett driftmikroskop med en 16x förstoring.
  6. Utför ett 2–3 cm snitt i råttans högra inguinalregion. Dissekera alla artärer i den högra inguinal regionen, inklusive lårbensartären (FA), den ytliga epigastric artär (SEA), den fallande genicular gatan (DGA), den popliteal artär (PA), och saphenous artär (SA). Placera två flyttbara klipp på FA: en proximal till början av SEA, och en annan direkt proximala till början av DGA.
  7. Ligate den distala delen av HAVET. Utför ett snitt av SEA:s vägg och sätt in en nål med 0,3 mm diameter i SEA. Anslut en spruta som innehåller cellupphängningen från steg 1.2 till nålen. Ta bort det distala klippet från den anl., och klipp i stället sa.000.
  8. Spruta långsamt in MDA-MB-231-cellupphängningen från steg 1,2 (1,5 x 105 celler/200 μL) i S HAVET. Ta bort nålen, ligate SEA, och ta bort artärklämmor. Stäng såret med hjälp av kirurgiska klipp och avsluta anestesi. Övervaka djuren dagligen för att bedöma tumörstorlek och eventuella tecken på smärta.

2. Magnetisk resonanstomografi (MRI)

OBS: För en detaljerad beskrivning av MRI-förfarandena, se Bäuerle et al.11.

  1. Utför MRI 10 dagar PI med hjälp av en dedikerad experimentell scanner (se Tabell över material) eller en mänsklig MR-system med en lämplig djur spole.
  2. Söva råttan med en isofluran (1–1,5 vol. %)/syreblandning enligt ovan. Placera en kateter i råttans svansven och tejpa fast den på svansen. Anslut en spruta som innehåller kontrastmedlet (0,1 mmol/kg Gd-DTPA i cirka 0,5 mL).
  3. Placera den sövda råttan i MR-systemet. Lokalisera det distala lårbenet och det proximala tibia i höger bakben i en anatomisk sekvens (t.ex. T2-viktad turbospinnkosekvens; TR = 8,654 ms; TE = 37 ms; matris 320 x 272; FOV = 65 mm x 55 mm; skiva tjocklek = 1 mm; avsökningstid 11:24 min).
  4. Bestäm skivorna som täcker det högra bakbenets distala lårben och proximala skenben och starta DCE-MRI-sekvensen (t.ex. snabb skottsekvens med låg vinkel; TR = 3,9 ms; TE = 0,88 ms; matris = 256 x 216; FOV = 65 x 54 mm2; skiva tjocklek = 1 mm; 8 skivor; 100 tidspunkter; avsökningstid = 8:25 min). Efter 30 s, börja injicera kontrastmedlet under en tidsperiod på 10 s.
    OBS: Den totala tiden för att utföra en MR-undersökning är cirka 20 min per djur.

3. Positronemissionstomografi/datortomografi (PET/CT)

OBS: För en detaljerad beskrivning av PET-förfarandena, se Cheng på al.12.

  1. Utför PET/CT-bildbehandling 10 dagar PI med hjälp av en dedikerad experimentell scanner (se Table of Materials).
  2. Håll djuren fastade före avbildning. Söva råttan enligt beskrivningen i steg 2.2 och för in en kateter i svansvenen enligt ovan.
  3. Injicera 6 MBq av 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) i svansvenen och vänta ~30 min för att låta spårämnet distribuera ordentligt.
  4. Utför ett CT-förvärv (rörspänning = 80 kV, rörström = 500 μA, isotropisk upplösning = 48,9 μm, varaktighet = 10 min).
  5. Utför ett statiskt PET-förvärv (nedre/övre diskriminerande nivå = 350/650 keV; tidsfönster = 3,438 ns; varaktighet = 15 min).

4. Alternativa bildframställningsstrategier

  1. För en tidig bedömning av MDA-MB-231 celler i bakbenet, inokulera 1,5 x 105 märkta celler /200 μL för bioluminescens (dvs. celler som uttrycker luciferin, MDA-MB-231-LUC13) eller 44.44 4444(44)440444444000-4440400 -138088800000004080000004 138000000 18888000000000000000000000000000 148000 och 1500000000000000000000 138000000000000 14844444 14.344.004.244.34.24.24.34.444444 2066 15.4.24.000.24.204.000.16.000 μL13 Använd systemet för preklinisk optisk avbildning för att upptäcka intraosseous MDA-MB-231 celler efter tumörcellsinympning14.
  2. Utför experimentellt ultraljud med hjälp av en dedikerad scanner efter intravenös injektion av mikrobubblor för att härleda morfologiska och funktionella parametrar för vaskularisering jämförbar med MRT7.

5. MR-analys

  1. Använd en DICOM-visningsbild15 med en DCE Plugin16 och ladda DCE-sekvensen i 4D-läge genom att klicka på knappen "Importera" i den övre menyn, välja DICOM-mappen som innehåller MR-bilderna från steg 2.4 och klicka på "4D Viewer" i den övre menyn.
  2. Placera en cirkulär 2-dimensionell region av intresse (ROI), med en målstorlek på 1,5 mm2, i den proximala tibial skaftets benmärg av höger bakben, helst med hjälp av bildnummer 4 eller 5 från sekvensen som består av 8 bilder, eftersom dessa centrum bilder ger mer stabila resultat.
  3. Starta DCE-plugin:t från den övre menyn, välj "Relativ förbättring" i fältet " Plot Type " och definierabaslinjeintervalletfrån tidspunkterna 1 till 5 genom att skriva in dessa siffror i respektive fält. Exportera analysen som en .txt-fil med respektive knapp och välj "DCEraw.txt" som filnamn.
  4. Öppna RStudio17 och ladda den tillhandahållna DCE-Script.R-filen via "Arkiv" -menyn genom att välja "Open File". Kör hela skriptet genom att välja "Kod", sedan "Kör region" och sedan "Kör alla" från menyn. Kopiera utdata till den förutsatt att mallfilen med namnet "ImagingFeatures.xlsx" (Bild 2).
  5. I DICOM-tittaren placerar du en andra ROI inom djurets ryggmuskel och upprepar steg 5.2–5.4 för att få muskel-DCE-mätningarna för normaliseringsändamål. Inom kalkylbladet "ImagingFeatures.xlsx" delas de respektive benmätningarna automatiskt av respektive muskelmätning för normaliseringsändamål.
  6. Upprepa steg 5.1–5.5 för alla djur och fyll i kalkylarket.

6. PET/CT-analys

  1. Öppna PET/CT-analysprogramvaran och importera de data som erhålls i steg 3 genom att klicka på "File", följt av "Manuell import". Märk ct.img.hd och pet.img.hdr-filerna. Klicka på" Öppna" och välj "Importera alla".
  2. Öppna datauppsättningarna genom att välja "Allmän analys", följt av "OK".
  3. Välj "ROI Quantification", följt av "Skapa"och sedan "Skapa en ROI från en mall". Placera en 2-dimensionell ROI cirka 4 mm x 6 mm i det proximala tibialskaftets benmärg av höger bakben.
  4. Välj "ROIs (Mål 1-övertäckning)" och skriv ner medelvärde, minimum och maxvärden i Bq/mL.
  5. Beräkna det maximala standardiserade upptagningsvärdet (SUVmax): Dividera det maximala värdet (Bq/mL) med den injicerade aktiviteten och multiplicera resultatet med djurets vikt i gram. För in resultatet i kalkylarket (bild 2).

7. Bestämma tumör-ta-frekvensen

  1. För att diagnostisera tumörtillväxt i höger bakben, upprepa MR och PET/CT imaging på dag 30 PI, som beskrivs ovan.
    OBS: Tumörer kommer att vara tydligt synlig på dag 30 PI och funktionen T2w-hyperintense skador och tydliga kontrast förbättring i MRI, tillsammans med en klart förhöjd SUVmax i PET / CT. Enligt tidigare experiment kommer 60%–80% av djuren att utveckla metastaser i sitt högra bakben.
  2. Fyll i kalkylbladet genom att lägga till ytterligare en "Tumör" kolumn och ange "1" för varje djur som presenterar metastaser, och "0" för varje djur utan synlig tumör börda (Figur 2). Spara kalkylbladet som "ImagingFeatures.xlsx" inom mappen Nedladdningar.

8. Val av funktion

  1. För att fastställa de mest relevanta funktionerna för förutsägelse av framtida tumörtillväxt, importera kalkylbladet till en datavisualisering med öppen källkod, maskininlärning ochdatautvinningsverktygslåda 18.
  2. Rita fil-subrutinen från Data-menyn till arbetsytan till höger och dubbelklicka på den. Ladda kalkylbladet genom att klicka på ikonen "Mapp" och välja filen "ImagingFeatures.xlsx". Välj kalkylbladet "Exportera" och tilldela mål-attributet till variabeln "Tumör". Tilldela funktionen "Hoppaöver " till djurnumret (bild 3).
  3. Rita insubrutinen" Rank " från Data-menyn i arbetsytan och koppla ihop subrutinerna "File" och "Rank" genom att rita en linje mellan dem.
  4. Öppnasubrutinen" Rank " genom att dubbelklicka på dess ikon, och välj "Information Gain" -algoritmen19.
  5. Från de fem förvärvade parametrarna, använd de tre bästa för ytterligare analyser (SUVmax, PE, och AUC).
    Obs: Dessa parametrar återspeglar metabolisk aktivitet (SUVmax) och vävnads vascularization (PE och AUC).

9. ML-analys

  1. Öppna RStudio 3.4.117 och ladda den tillhandahållna TrainModel.R-Script via " Arkiv "-menyn.
  2. Installera de bibliotek som krävs (detta måste bara göras en gång) genom att skriva: install.packages(c("caret", "readxl", "pROC", "RcmdrPlugin.EZR", "ggplot2"))
  3. Om du vill läsa in de bibliotek som krävs och ange mappen Nedladdningar som arbetskatalog väljer du raderna 3–5 inom TrainModel.R-skriptet.
  4. Kör den markerade koden genom att klickapå " Kod" inom menyn, och sedan " Kör Valdalinje(er)".

10. Utbildning av en avNNet ML-algoritm

  1. För att träna en avNNet-algoritm väljer du raderna 8–39 från TrainModel.R-Script (se steg 9.1).
  2. Kör den markerade koden genom att klickapå " Kod" inom menyn, och sedan " Kör Valdalinje(er)".

11. Analysera ML-algoritmens resultat

  1. För att bedöma standardparametrar för diagnostisk noggrannhet (känslighet, specificitet, positiva och negativa prediktiva värden och sannolikhetsförhållanden) väljer du raderna 41–50 från TrainModel.R-Script.
  2. Kör den markerade koden genom att klickapå " Kod" inom menyn, och sedan " Kör Valdalinje(er)".

12. Jämföra den slutliga modellens ROC-kurva (Receiver Operating Characteristic) med ROC-kurvorna för dess ingående parametrar

  1. Om du vill utföra DeLongs tester för att jämföra modellens ROC-kurva med ROC-kurvorna av dess ingående parametrar, väljer du raderna 52–62 från TrainModel.R-Script (se steg 9.1).
  2. Kör den markerade koden genom att klickapå " Kod" inom menyn, och sedan " Kör Valdalinje(er)".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Råttorna återhämtade sig snabbt från operationen och injektionen av MDA-MB-231 bröstcancerceller och utsattes sedan för MR- och PET/CT-avbildning dag 10 och 30 PI (Figur 1). En representativ DCE-analys av en råttas högra proximala skenben presenteras i figur 2A. DCE-råmåtten sparades genom att välja "Export" -knappen och välja "DCEraw.txt" som filnamn.

Efterföljande beräkningar av de dynamiska parametrarna, AUC, PE och washout utfördes i RStudio med respektive skript. Utdata från DCE-mätningarna måste sparas som "DCEraw.txt" inom mappen "Downloads", så att skriptet kunde köras direkt utan ytterligare konfigurationer för att ge en datatabell, som avbildas i figur 2B. Dessa data kopierades till det tillhandahållna kalkylarket (Bild 2C). På samma sätt bestämdes DCE-parametrarna för muskulär vävnad och överfördes till kalkylarket (Figur 2D,E). Dessa värden normaliserades genom att dividera benmätningarna med muskelmätningarna; detta utfördes automatiskt inom kalkylbladet. Från PET/CT överfördes därefter de beräknade SUVmax-värdena i tabellen (Figur 2F).

Dag 30 PI utvärderades alla djur för att avgöra om de utvecklade metastaser eller inte, och tabellen slutfördes genom kodning av positiv tumörbörda som "1" och friska djur som "0" inom kolumnen längst till höger i kalkylbladet (Figur 2C).

Kalkylbladet importerades till datavisualisering med öppen källkod, maskininlärning och verktygslåda för datautvinning, och funktionsrankning avslöjade SUVmax, PE och AUC som de tre bästa funktionerna för förutsägelse av metastaserande sjukdom (Figur 3). Dessa parametrar återspeglar metabolisk aktivitet (SUVmax) och vävnad vascularization (PE och AUC).

Köra TrainModel.R Script automatiskt importerat kalkylbladet och beräknat en avNNet. Den optimala hyperparameterkombinationen bestämdes (Figur 4A) och slutmodellen beräknades sedan med hjälp av den optimala hyperparameterkombinationen (Figur 4B). Därefter beräknades en uppsättning standarddiagnostiska parametrar (Figur 4C) och en ROC-kurva av modellen ritades (Figur 4D).

Det positiva resultatet visas i figur 4B–D. En jämförelse av modellens ROC-kurva med ROC-kurvan av dess tre beståndsdelar (dvs. AUC, PE och SUVmax) visade att modellen presterade betydligt bättre än alla dess tre beståndsdelar (p = 0,01 för AUC, p = 0,003 för PE, och p = 0,007 för SUVmax). Kombinationen av de tre valda parametrarna till en avNNet var känsligare, vilket gjorde att förutsägelse av makroskopisk sjukdom med en total noggrannhet på 85,7% (95% konfidensintervall = 67,3%–96,0%). Dessa resultat erhölls från en analys av 28 prover. Konfidensintervallen kan minskas ytterligare genom att antalet djur ökar.

De negativa resultaten skulle kunna erhållas enligt beskrivningen här. Noggrannhetsåtgärderna var mycket känsliga för specifika typer av maskininlärningsalgoritmer och för steg av dataförbearbetning. Särskilt neurala nätverk tenderade att prestera bättre när ingångsdata normaliserades. Detta uppnåddes genom "BoxCox"-funktionen i avsnitt 10 i protokollet (raderna 22 och 36 inom den förutsatt TrainModel.R-Script). Avstå från normalisering och använda en annan algoritm (t.ex., ett neuralt nätverk inte i genomsnitt), genom att ändra metoden till "nnet" (linjerna 21 och 35 inom den tillhandahållna TrainModel.R-Script), resulterade i ett område på 0,594 under ROC-kurvan (Kompletterande figur 1). En sådan modell misslyckades att överträffa sina tre beståndsdelar avsevärt (alla p > 0,15).

Eftersom skriptet var optimerat för RStudio 3.4.1 och paketet caret version 6.0-84, kanske med hjälp av olika programversioner ger olika resultat. Köra de tillhandahållna skript med programvaran versioner som används i detta manuskript kommer att ge liknande resultat. Men om läsarna syftar till att ändra skriptet, lägga till ytterligare variabler, ändra dokumentmappar eller filnamn, eller ändra maskininlärningsalgoritmerna i större detalj, kommer respektive justeringar av koden att vara nödvändiga. För dessa fall erbjuder handboken till caret-paketet djupgående förklaringar20.

Figure 1
Bild 1: Representativa MR- och PET/CT-bilder. MR- och PET/CT-bilder av höger bakben på ett djur som inte utvecklade metastaser under studiens gång (två kolumner längst till vänster, med bilder från dag 10 och dag 30 PI), och ett djur som utvecklade metastaser mellan dag 10 och dag 30 PI (två kolumner som ligger längst till höger, metastaser markerade med pilar). Notera den höga signalintensiteten hos metastaser i T2w-bilderna (övre raden), kontrastförbättringen som avbildas av det ökade området under kurvan (AUC; andra raden), och det ökade maximala standardiserade upptagningsvärdet i PET/CT (SUVmax; tredje raden). Observera att det inte finns några synliga skillnader i bilderna som förvärvats på dag 10 PI (första och tredje kolumnen) mellan djuret med metastaser på dag 30 PI och det djur som inte utvecklade några benmetastaser. Denna siffra modifierades från Ellmann et al.5. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Bedömning av bildåtergivningsfunktionerna och sammanställningen till ett kalkylblad. (A) Den dynamiska kontrastförbättringen av det proximala skenbenets benmärg analyserades med en gratisprogram DICOM-tittare15 med hjälp av en DCE plugin16. Respektive mätningar sparades, och (B) ytterligare analyseras med den medföljande DCE-Script.R-fil i RStudio17. (C) Utdata kopierades till ett kalkylblad (se tilläggsmaterial för en mall). (D) Likaså dce mätningen utfördes för intilliggande muskulös vävnad, analyseras med hjälp av RStudio (E), och sedan kopieras till kalkylbladet. Data normaliserades genom att dela upp resultaten av benmätningarna med resultaten från muskelmätningarna (C; laxskuggade celler). (F) PET/CT-mätningarna utfördes med leverantörens programvara. Det maximala standardiserade upptagningsvärdet beräknades genom att dividera respektive mätning med den injicerade aktiviteten och multiplicera det med djurets kroppsvikt. Resultatet kopierades därefter in i kalkylbladet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Rangordning av funktionen. Rangordning av de förvärvade bildfunktionerna utfördes inom en datavisualisering med öppen källkod, maskininlärning och verktygslåda för datautvinning18 genom att importera kalkylbladet via "File"-subruttin, och analysera det via "Rank"-subrutinen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Representativ RStudio-utgång. Maskininlärningsalgoritmen har utvecklats med hjälp av RStudio17 med den tillhandahållna TrainModel.R-Script-filen. (A) En grid sökning bland olika hyperparameter kombinationer för modell-genomsnitt neurala nätverket visade en storlek på tre nervceller och ett sönderfall av 0.0005 som en optimal. (B) Med hjälp av denna hyperparameterkombination utbildades ett fullständigt nät och korsvalferades, och nådde en total noggrannhet på 85,7 %. (C) Standardparametrar för diagnostisk noggrannhet, inklusive känslighet, specificitet, positiva och negativa prediktiva värden, och riskkvoter, beräknades från en förvirringsmatris. (D) En representativ ROC-plot av den korsvalserade modellen avslöjade ett område under kurvan (AUC) på 0,917. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Negativt resultat. Ändra ML algoritm till ett Neuralt nätverk utan att genomsnitt och avstå från normalisering av indataparametrarna ledde till en droppe av området under kurvan för ROC kurvan från 0,917 (Figur 4D) till 0,594. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 2: Alternativ funktionsrankning. I motsats till den standardmetod som avbildas i figur 3infördes också en slumpmässig variabel ("Random"; markerad i blått), med dess betydelse inkluderad i rangordningen. Detta tillvägagångssätt bekräftade det tillämpade urvalet av variablerna SUVmax, PE och AUC. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ML-algoritmer är kraftfulla verktyg som används för att integrera flera prediktiva funktioner i en kombinerad modell och få en noggrannhet som överstiger den hos dess separata beståndsdelar när de används ensam. Icke desto mindre beror det faktiska resultatet på flera kritiska steg. För det första är ML-algoritmen som används en avgörande faktor, eftersom olika ML-algoritmer ger olika resultat. Algoritmen som används i det här protokollet är en avNNet, men andra lovande algoritmer inkluderar Extreme Gradient Boosting21 eller Random Forests. Caret-paketet20 för RStudio ger en uppsjö av olika algoritmer (för närvarande >175), och det föreslagna protokollet är mycket flexibelt när det gäller att byta från en algoritm till en annan genom att helt enkelt ändra enstaka rader kod (t.ex. ändra metod = "avNNet" till metod ="rf") och anpassa TunedGrid-inställningarna till respektive ML-algoritm. För detaljer, se caret github-förvaret22. En utmärkt översikt över olika algoritmer och deras prestanda med avseende på olika klassifikationsproblem publicerades av Fernández-Delgado et al.23 och kunde fungera som utgångspunkt för andra experiment.

En annan avgörande faktor är valet av relevanta funktioner att inkludera i en ML-algoritm. Detta protokoll föreslår användning av filtermetoden, "Information Gain"19, för att rangordna de tillgängliga funktionerna i fallande ordning och använda de mest relevanta för att träna avNNet. Filtermetoderna baseras endast på allmänna antaganden, till exempel korrelation med variabeln att förutsäga, så forskare bör förvälja funktioner oberoende av klassificeraren somanvänds 24,25. Sådana metoder är särskilt effektiva i beräkningstid och robusta till överanpassning. Den cutoff som skiljer relevant från irrelevanta funktioner definieras dock av användaren, vilket gör det något godtyckligt. För det föreslagna protokollet användes funktionerna med den översta 75% informationsvinsten, motsvarande SUVmax, PE och AUC. Detta urval kan dock systematiskt stärkas genom att man inkluderar en slumpmässig variabel som inte har något samband med målet, beräknar dess informationsvinst, och sedan jämför den med den informationsvinst som de verkliga funktionerna ger (Kompletterande figur 2). Detta något mer sofistikerade tillvägagångssätt bekräftade dessutom valet av de tre ovannämnda funktionerna som den mest relevanta. Icke desto mindre finns flera olika filtermetoder, tillsammans med andra tillvägagångssätt som väljer funktioner med avseende på en viss klassificerare algoritm, såsom funktionen extrahering och metoder wrapper. Olika funktionsvalsansatser kan ge olika resultat.

För att säkerställa generalizability av ML-algoritmen och ytterligare förhindra överanpassning, det föreslagna protokollet gäller leave-one-out korsvalidering (LOOCV). Det bästa tillvägagångssättet skulle dock vara att slumpmässigt ta bort en delmängd från hela datamängden, och behandla den som en testuppsättning. ML-algoritmen tränas sedan på återstoden av data (dvs. träningsuppsättningen) för att därefter förutsäga utfallet av testuppsättningen. Detta tillvägagångssätt behöver dock en tillräckligt stor datamängd. För mindre urvalsstorlekar är applicering av LOOCV vanligt eftersom det ger en nästan förutsättningslös uppskattning av en modells verkliga generaliseringsförmåga26. I LOOCV tas den första datapunkten bort från datamängden, och avNNet tränas med de data som behålls. Sedan förutsags och sparas utfallet av den tidigare undanhållna datapunkten. Den här processen upprepas för alla datapunkter, så att slutligen varje utfall förutses med data som inte användes för utbildning av algoritmen. Andra valideringsmetoder inkluderar x-fold korsvalidering (oftast 10-faldiga) och kan enkelt tillämpas genom att respektive trainControl-parametern ändras inom koden till method="CV".

Från en kvantitativ point-of-view, medicinska bilder utvärderas vanligtvis på ett mycket grundläggande sätt, till stor del beroende av mätningar av storlek och form av potentiellt misstänkta skador ellerområden 27,28. Fördelen med standarden Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) är dock att den tillåter utvinning av många funktioner, kallad radiomik. Termen "radiomics" definierades ursprungligen som höggenomströmningsextraktion av stora mängder bildfunktioner29, men utvidgades därefter till att omfatta omvandling av bilder till högre dimensionella data30. De högre dimensionella uppgifterna används dock främst för att identifiera korrelationer snarare än orsaker30. De funktioner som beskrivs i detta protokoll falla i mellan klassiska radiologiska funktioner, såsom storlek och form, och radiomics, eftersom de liknar allmänt accepterade parametrar för vascularization och metabolisk verksamhet. Detta erbjuder en potentiell kausala förhållande till mikroinvasion av spridas tumörceller. Om användaren så önskar kan en utvinning av radiomiska funktioner utföras med olika programpaket31.

Det protokoll som tillhandahålls är inte begränsat till ett begränsat antal funktioner. Således kan den användas med stora radiomics datamängder. Den ovannämnda frågan om funktionsval blir dock allt viktigare med växande datamängder. Det presenterade protokollet kan också överföras till olika studieinställningar,t.ex.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Finansiärerna hade ingen roll i studiens utformning; i insamlingen, analyser, eller tolkning av uppgifter, i handstilen av manuskriptet, eller i beslutet att offentliggöra resultaten.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (DFG, Collaborative Research Centre CRC 1181, subproject Z02; Det prioriterade programmet μBone, projekten BA 4027/10-1 och BO 3811), inklusive ytterligare stöd för skanningsanordningarna (INST 410/77-1 FUGG och INST 410/93-1 FUGG), och av Initiativet för nya fält (EFI) "Big Thera" från Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular Operating Microscope Leica NA
ClinScan MR System Bruker NA
DICOM Viewer Horos NA www.horosproject.org
Excel: Spreadsheet Microsoft NA
FCS Sigma F2442-500ML
Gadovist Bayer-Schering NA
Inveon PET/CT Siemens NA
Inveon Research Workplace Software Siemens Healthcare GmbH NA
IVIS Spectrum PerkinElmer NA
MDA-MB-231 human breast cancer cells American Type Culture Collection N/A
Open-source data visualization, machine learning and data mining toolkit. Orange3, University of Ljubljana NA https://orange.biolab.si/
RPMI-1640 Invitrogen/ThermoFisher 11875093
Trypsin Sigma 9002-07-7
Vevo 3100 VisualSonics NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Oronzo, S., Brown, J., Coleman, R. The role of biomarkers in the management of bone-homing malignancies. Journal of Bone Oncology. 9, 1-9 (2017).
  2. Ellmann, S., Beck, M., Kuwert, T., Uder, M., Bäuerle, T. Multimodal imaging of bone metastases: From preclinical to clinical applications. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (4), 166-177 (2015).
  3. Braun, S., Pantel, K. Clinical significance of occult metastatic cells in bone marrow of breast cancer patients. The Oncologist. 6 (2), 125-132 (2001).
  4. Braun, S., Rosenberg, R., Thorban, S., Harbeck, N. Implications of occult metastatic cells for systemic cancer treatment in patients with breast or gastrointestinal cancer. Seminars in surgical oncology. 20 (4), 334-346 (2001).
  5. Ellmann, S., et al. Prediction of early metastatic disease in experimental breast cancer bone metastasis by combining PET/CT and MRI parameters to a Model-Averaged Neural Network. Bone. 120, 254-261 (2018).
  6. Bäuerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
  7. Merz, M., Komljenovic, D., Semmler, W., Bäuerle, T. Quantitative contrast-enhanced ultrasound for imaging antiangiogenic treatment response in experimental osteolytic breast cancer bone metastases. Investigative Radiology. 47 (7), 422-429 (2012).
  8. Bäuerle, T., et al. Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein. International Journal of Cancer. 115 (2), 177-186 (2005).
  9. Patel, J., Goyal, R. Applications of Artificial Neural Networks in Medical Science. Current Clinical Pharmacology. 2 (3), 217-226 (2008).
  10. Naftaly, U., Intrator, N., Horn, D. Optimal ensemble averaging of neural networks. Network: Computation in Neural Systems. 8 (3), 283-296 (1997).
  11. Bäuerle, T., Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W. Drug-induced vessel remodeling in bone metastases as assessed by dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging and vessel size imaging: A longitudinal in vivo study. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3215-3225 (2010).
  12. Cheng, C., et al. Evaluation of treatment response of cilengitide in an experimental model of breast cancer bone metastasis using dynamic PET with 18F-FDG. Hellenic Journal of Nuclear Medicine. 14 (1), 15-20 (2011).
  13. Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (6), 1256-1261 (2018).
  14. Sonntag, E., et al. In vivo proof-of-concept for two experimental antiviral drugs, both directed to cellular targets, using a murine cytomegalovirus model. Antiviral Research. 161, 63-69 (2019).
  15. Horos - Free DICOM Medical Image Viewer | Open-Source. , Available from: https://www.horosproject.org/ (2015).
  16. DCE Tool Plugin. , Available from: http://kyungs.bol.ucla.edu/software/DCE_tool/DCE_tool.html (2020).
  17. RStudio Team RStudio: Inteegrated Development for R. , Available from: https://rstudio.com (2015).
  18. Demšar, J., et al. Orange: Data Mining Toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
  19. Saeys, Y., Inza, I., Larrañaga, P. A review of feature selection techniques in bioinformatics. Bioinformatics. 23 (19), 2507-2517 (2007).
  20. Kuhn, M. CRAN - Package caret. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/caret/index.html (2016).
  21. Chen, T., et al. CRAN: Package xgboost - Extreme Gradient Boosting. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/xgboost/ (2019).
  22. Available Models | The caret Package. , Available from: http://topepo.github.io/caret/available-models.html (2020).
  23. Fernández-Delgado, M., Cernadas, E., Barro, S., Amorim, D., Fernández-Delgado, A. Do we Need Hundreds of Classifiers to Solve Real World Classification Problems. Journal of Machine Learning Research. 15, 3133-3181 (2014).
  24. Hira, Z. M., Gillies, D. F. A Review of Feature Selection and Feature Extraction Methods Applied on Microarray Data. Advances in Bioinformatics. 2015, 198363 (2015).
  25. Sánchez-Maroño, N., Alonso-Betanzos, A., Tombilla-Sanromán, M. Filter methods for feature selection - A comparative study. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). 4881, 178-187 (2007).
  26. Cawley, G. C., Talbot, N. L. C. C. Fast exact leave-one-out cross-validation of sparse least-squares support vector machines. Neural Network. 17 (10), 1467-1475 (2004).
  27. Forghani, R., et al. Radiomics and Artificial Intelligence for Biomarker and Prediction Model Development in Oncology. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 995-1008 (2019).
  28. Jaffe, C. C. Measures of response: RECIST, WHO, and new alternatives. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 24 (20), 3245-3251 (2006).
  29. Lambin, P., et al. Radiomics: Extracting more information from medical images using advanced feature analysis. European Journal of Cancer. 48 (4), 441-446 (2012).
  30. Gillies, R. J., Kinahan, P. E., Hricak, H. Radiomics: Images are more than pictures, they are data. Radiology. 278 (2), 563-577 (2016).
  31. Nioche, C., et al. Lifex: A freeware for radiomic feature calculation in multimodality imaging to accelerate advances in the characterization of tumor heterogeneity. Cancer Research. 78 (16), 4786-4789 (2018).
  32. Ellmann, S., et al. Application of machine learning algorithms for multiparametric MRI-based evaluation of murine colitis. PLOS ONE. 13 (10), 0206576 (2018).

Tags

Cancerforskning maskininlärning neurala nätverk benmetastaser spridas tumörceller bröst-neoplasmer multiparametrisk avbildning
Machine Learning Algoritmer för tidig upptäckt av Ben metastaser i en experimentell Rat Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ellmann, S., Seyler, L., Gillmann,… More

Ellmann, S., Seyler, L., Gillmann, C., Popp, V., Treutlein, C., Bozec, A., Uder, M., Bäuerle, T. Machine Learning Algorithms for Early Detection of Bone Metastases in an Experimental Rat Model. J. Vis. Exp. (162), e61235, doi:10.3791/61235 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter