Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

Published: May 22, 2020 doi: 10.3791/61237
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology, University of Colorado Denver School of Medicine

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Abstract

אינטראקציות חלבון בממשקים סלולריים מכתיבות שפע של תוצאות ביולוגיות החל מהתפתחות רקמות והתקדמות סרטן ועד היווצרות ותחזוקה של סינפסה. רבות מהאינטראקציות הבסיסיות הללו מתרחשות בטרנס ובדרך כלל נגרמות על ידי אינטראקציות הטרופיליות או הומופיליות בין תאים המבטאים זוגות כריכה מעוגנים בקרום. המבהיר כיצד מוטציות רלוונטיות למחלות משבשות את אינטראקציות החלבון הבסיסיות האלה יכול לספק תובנה על מספר עצום של תחומי ביולוגיה של התא. מבחני אינטראקציה רבים של חלבון-חלבון אינם מנטרלים בדרך כלל בין אינטראקציות cis ו- trans, מה שעלול להוביל להערכת יתר של היקף הכריכה המתרחשת ב- vivo וכרוכה בטיהור אינטנסיבי של חלבון ו/או ציוד ניטור מיוחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט אופטימיזציה המאפשר תצפית וכימות של אינטראקציות טרנס בלבד ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. מבחני צבירת תאי HEK כרוכים בערבוב של שתי אוכלוסיות עצמאיות של תאי HEK, שכל אחת מהן מבטאת ליגנדים קוגניאטים הקשורים לקרום. לאחר תקופת דגירה קצרה, הדגימות מסומנות והצטברויות המתקבלות מכמתות.

Introduction

אינטראקציות סינפטיות בהנחיית מולקולות הידבקות סינפטית הן הבסיס לפיתוח, ארגון, מפרט, תחזוקה ותפקוד של סינפסות ויצירת רשתות עצביות. הזיהוי של מולקולות הידבקות תאים טרנס-סינפטיות אלה גדל במהירות; לכן, חשוב ביסודו לזהות שותפים מחייבים ולהבין כיצד מולקולות הדבקה חדשות אלה אינטראקציה אחד עם השני. בנוסף, רצף הגנום זיהה מוטציות ברבים ממולקולות הידבקות אלה הקשורות בדרך כלל לשלל הפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירופסיכיאטריות והתמכרות1. מוטציות בגנים המקודדות למולקולות סינפטיות של הידבקות בתאים עלולות לשנות לרעה אינטראקציות טרנסג'נדריות ועשויות לתרום לשינויים פתופיזיולוגיים בהיווצרות סינפסה או תחזוקה.

מבחנים מרובים קיימים כדי להעריך כמותית אינטראקציות חלבון חלבון כגון קלורימטריה איזותרמית, dichroism מעגלי, תהודה פלסמון פני השטח2 ולמרות כמותי בטבע, יש להם מספר מגבלות. ראשית, הם דורשים חלבון רקומביננטי, לפעמים דורשים צעדי טיהור ארוכים ומייגעים. שנית, הם דורשים ציוד מיוחד מתוחכם ומומחיות טכנית. שלישית, הם יכולים להפרז בהיקף הכריכה כפי שהם מאפשרים הן אינטראקציות cis ו טרנס בין חלבונים הקשורים באופן טבעי קרום vivo. כאן אנו מציעים בדיקה פשוטה ומהירה יחסית הבדוקה באופן בלעדי אינטראקציות טרנסג'נדריות.

כדי לעקוף רבים מהסיבוכים הקשורים למטעני חלבון מטוהרים, יש לנו אופטימיזציה של בדיקת אינטראקציה חלבון מבוסס תאים כי recapitulates אינטראקציות טרנס במערכת תאים הטרולוגית מופחתת. מבחנים אלה שימשו בעבר בצורות שונות לחקר אינטראקציות טרנס-תאיות. בגישה זו, מולקולות הידבקות תאים מועמדים הם transfected לתוך תאי HEK293T. בתנאים פיזיולוגיים, תאי HEK293T אינם מפגינים צבירה עצמית, מה שהופך אותם למודלים למופת לבדיקה זו. עם זאת, כאשר אוכלוסיות בודדות של תאי HEK המביעים קולטן ו ligand משולבים, הכריכה של הקולטן ואת ligand כוחות צבירה של תאי HEK להתרחש. צבירה זו מתווכת אך ורק על ידי אינטראקציות טרנסג'נדריות ובדרך כלל ניתן לצפות בה בעשרות דקות. בשיטה זו אין צורך בצעדי טיהור חלבונים, ויעילות השיטה מסתמכת על הפרדיגמה לפיה משולבות אוכלוסיות של תאי HEK המבטאות מולקולות הידבקות קוגניציה ולאחר מכן מצולמות רק עשרות דקות לאחר מכן. בנוסף, שיטה זו זולה יחסית, שכן לא נדרשים נוגדנים ולא ציוד יקר. הציוד היחיד הנדרש לרכישת נתונים הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. יתרון נוסף למבחן מבוסס תא זה הוא היכולת לסנן במהירות את ההשפעה של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלות על אינטראקציות טרנסג'נדריות. זה יכול להתבצע על ידי transfecting תאי HEK עם cDNAs של גרסאות מוטציה של החלבון של עניין.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים דוגמה שבה אנו חוקרים אם מוטציה שגויה Neurexin3α (Neurexin3αA687T), זוהה בחולה שאובחן עם מוגבלות אינטלקטואלית עמוקה ואפילפסיה, משנה אינטראקציות טרנס עם חלבון טרנסממברן חוזר עשיר לאוצין 2 (LRRTM2). Neurexin3α הוא חבר במשפחה השמורה מבחינה אבולוציונית של מולקולות הידבקות תאים presynaptic ובעוד העבודה האחרונה זיהתה תפקידים מרובים בסינפסה3,4,5,6,7, ההבנה הסינפטית שלנו של מולקולה זו וכל בני משפחת neurexin נשאר שלם. LRRTM2 הוא חלבון הידבקות תאים פוסט-סינפטי מעורר המשתתף בהיווצרות סינפסה ותחזוקה8,9,10. חשוב לציין, LRRTM2 באופן בלעדי אינטראקציה עם isoforms neurexin שחסרים באתר splice 4 אקסון חלופי (SS4-) אבל לא עם isoforms neurexin המכיל את אתר splice 4 exon חלופי (SS4+). מוטציית ההחמצה האנושית (A687T) שזוהתה ב Neurexin3α ממוקמת באזור חוץ-תאי לא מתורבת השמור מבחינה אבולוציונית ושמור בין כל אלפא neurexins7. כמו האינטראקציהביןשתי מולקולות אלה הוקמה 8,9,11, אנו מציגים את השאלה: האם היכולת מחייבת של Neurexin3α SS4- כדי LRRTM2 השתנה על ידי מוטציה נקודת A687T? בדיקה זו גילתה כי מוטציית נקודת A687T שיפרה באופן בלתי צפוי את הצבירה של Neurexin3α ל- LRRTM2 מה שמרמז על כך שהאזור החוץ-תאי שבו נמצאת המוטציה הנקודתית, ממלא תפקיד בתיווך אינטראקציות טרנסינפטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות תאים ו transfection

  1. הפוך את המדיה הסלולרית HEK עם DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של הנשר בינוני) בתוספת 4.5 גרם / L גלוקוז, L-גלוטמין & נתרן פירובט ו 10% FBS. מסנן סטרילי.
  2. קבוע מראש ליגנדים מתאימים קולטנים לבדיקת צבירה.
    הערה: Neurexin3α SS4+/- ואחד הליגנדים הידועים שלה, LRRTM2, שימשו במחקר זה. ליגנדים קולטנים של עניין באו לידי ביטוי cDNAs ב pcDNA3.1. הרכבת גיבסון שימשה להכנסת Neurexin3α לתוך pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: טטאקטטאגקטגטגGGCGCGCGTCCGCCAקטגCTCTCTC /
    גאגג'גקטגאגאטקטאקאטקטקטקטגTTCCTT.
  3. הכן תאי HEK293T.
    1. לגדל תאי HEK293T לעיסוק בבקבוק T-75 אחד.
    2. לאחר המפגש, להשתמש 2 מ"ל של טריפסין ומניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. הוסף 6 מ"ל של מדיה HEK לבקבוק כדי resuspend תאים ולהעביר את כל 8 מ"ל לצינור חרוט 15 מ"ל.
    3. גלולה ב 500 x g במשך 5 דקות ו resuspend במדיה סלולרית HEK עבור סך של 8 מ"ל.
    4. לספור תאים ולהוסיף 735,000 תאים לתוך כל באר של צלחת 6-well. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 2 מ"ל עבור כל באר באמצעות מדיית תא HEK.
    5. מניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול בן לילה או עד שהם מגיעים 50-60% מפגש.
  4. Transfect HEK293T תאים באמצעות שיטת סידן פוספט13.
    1. להחליק היטב 1 עם 3 מיקרוגרם של החלבון של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- ו 1 מיקרוגרם של mCherry).
    2. תעביר היטב 2 כמו בשלב 1.4.1. אבל עם חלבון מוטציה של עניין (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
    3. חוצה היטב-3 עם 3 מיקרוגרם של ligand של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי אחר (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1 LRRTM2 ו 1 מיקרוגרם של GFP).
    4. להחדיר גם-4 ו- well-5 לשמש פקדים שליליים: גם 4 עם 1 מיקרוגרם של GFP ו well-5 עם 1 מיקרוגרם של mCherry.
    5. הכן צלחת נוספת (כמו בשלב 1.4.1-1.4.4) אם נדרשים תנאים או פקדים נוספים (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
      הערה: יעילות Transfection מנותחת 24 שעות לאחר transfection תחת מיקרוסקופ epifluorescence ו כימות כמו מספר התאים המבטאים את החלבון פלואורסצנטי הם היו transfected עם. גישה יעילה יותר תכלול את ההשתנות של תאי HEK עם קידוד וקטורי דו-יסטרי לחלבון פלואורסצנטי ואת הליגנד של עניין ומומלץ מאוד מעל שינוי-תיקון. במקרה של מחקר זה, אלפא Neurexins הם ~ 4.3 kb ועוצמת פלואורסצנטיות נמוכה נצפתה באמצעות מערכת bicistronic המחייבת שיתוף transfection.
  5. 48 שעות לאחר טרנס-פליטה, תאי קציר לצבירה.
    1. לשטוף כל באר פעמיים עם PBS.
    2. הוסף 1 מ"ל של EDTA 10 מ"מ ב PBS לתוך כל באר בעדינות לנתק אינטראקציות תא לתא צלחת דגירה ב 37 °C (70 °F) במשך 5 דקות.
      הערה: טריפסין אינו מומלץ לשלב 1.5.2 עקב מחשוף פרוטאוליטי פוטנציאלי של מולקולות הידבקות במחקר. בנוסף, לאחר הוספת EDTA ייתכן שהפרוטוקול לא יופסק עד להשלמתו מכיוון שהתאים ייחשפו כעת לתנאי הסביבה.
    3. הקישו בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים, וקצרו כל באר לצינורות חרוטים נפרדים של 15 מ"ל.
    4. צינורות חרוט צנטריפוגה ב 500 x גרם וטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  6. בעוד תאים הם pelleting, להכין 6 צינורות דגירה על ידי תיוג החלק העליון של כל צינור microcentrifuge עם כל מצב.
    הערה: יש להשתמש בכל תמורות של תנאי GFP ו- mCherry כדי להקיף את כל התנאים הניסיוניים והבקרות המתאימות. לדוגמה: 1. GFP/mצ'רי, 2.mצ'רי/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-–mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- – mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-- mCherry/LRRTM2 – GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- – mשרי / LRRTM2 - GFP. הפוך צינורות נוספים כדי להתאים תנאים נוספים ובקרות.
  7. הסר את התאים supernatant ו resuspend ב 500 μL של מדיה HEK עם 10 mM CaCl2 ו 10 mM MgCl2 מחומם ל 37 °C (69 °F).
    הערה: התוספת של CaCl2 ו- MgCl2 מאפשרת למולקולות הידבקות להקים מחדש את הכריכה ונדרשת רק אם שותפי האינטראקציה הטרנס-תאית המדוברים דורשים ציות דו-תאי להדבקה.
  8. לספור את התאים בכל צינור חרוט 15 מ"ל באמצעות hemocytometer ו aliquot 200,000 תאים של כל תנאי לתוך הצינור המתאים משלב 1.6.1 עבור 1:1 לערבב בנפח כולל של 500 μL.
    הערה: זה צריך לקחת רק 5 דקות לכל תנאי לספור כמויות aliquot.
  9. דגירה צינורות בטמפרטורת החדר במסובב צינור איטי.

2. רכישת תמונה

  1. מטב פרמטרי רכישת מיקרוסקופ עבור דגימות ספציפיות. בדוגמה זו, תמונות צולמו במיקרוסקופ רחב שדה. השתמש במטרת אוויר 5x (NA: 0.15; WD: 20000 מיקרומטר) כדי לקבל שדה גדול מספיק לניתוח.
  2. להעריך צבירה בסיסית מיד לאחר ערבוב שני התנאים של תאי HEK בשלב 1.8. אלה עכשיו תמונות 'זמן אפס'.
    1. פיפטה 40 μL של כל תערובת מדגם על שקופית מיקרוסקופ טעונה ותמונה תחת פלואורסצנטיות בשני ערוצי 488 ו 561.
    2. רכוש שלושה שדות תצוגה שונים במישור מיקוד אחד לכל טיפה לדוגמה.
  3. רכוש תמונות סופיות ב- 60 דקות כתמונה 'זמן 60'.
    1. כדי לקבל את התמונה 'זמן 60' של התערובת לאחר דגירה של 60 דקות, לקחת עוד 40 μL מדגם של כל תנאי מצינורות מסתובבים פיפטה כל מדגם על שקופית טעונה. תמונה כמו בשלב 2.2.2.
      הערה: יש לבדוק צבירת תאים כל 15 דקות עד שתתרחש רוויה. תזמון הצבירה יהיה תלוי בחלבונים הנבדקים.

3. ניתוח ImageJ/פיג'י

  1. כדי לכמת את היקף הצבירה באמצעות פיג'י/ImageJ, שמור קבצי ניתוח.
    1. שמור את קבצי הקידוד המשלימים שסופקו בתיקיה פקודות מאקרו של imageJ במחשב.
    2. התקן את מאקרו הצבירה שסופק (תוספים, פקודות מאקרו, התקן ובחר בקובץ "צבירהאי.txt").
  2. קבע ערכי סף.
    1. טען קובץ .tif 'זמן אפס' לתוך imageJ ופצל את הערוצים (תמונה | | צבע פיצול ערוצים).
      הערה: התמונה 'זמן אפס' משמשת לקביעת גודל הסף והפונקטה הקטן ביותר עבור הניסוי כולו.
    2. מסיכה כל ערוץ (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_MakeMask). החלון 'הפוך מסיכה מתמונה' יופיע. בתיבות הסימון לצד קבע סף לתמונה וקבע פארמים של אשכול מהיסטוגרמה ולחץ על אישור.
    3. קבע את סף התמונה באמצעות סרגל השקופיות, הקלט את המספר משמאל לסרגל השקופיות ולחץ על אישור.
    4. תופיע היסטוגרמה של גודל אשכול. בחר גודל אשכול מההיסטוגרמה המתאימה לניסוי, הקלד מספר זה בתיבה גודל אשכול מינימלי: ולחץ על אישור. אשכולות מתחת לגודל זה לא ינותח.
  3. תריץ את הניתוח.
    1. פתח את התמונה 'זמן 60' של תנאי 1 ב imageJ ולפצל את הערוצים כמו בשלב 3.2.1.
    2. מסיכה כל ערוץ (תוספים, פקודות מאקרו AggregationAssay_MakeMask). השתמש באותו סף ובאותו גודל שנקבעו בשלב 3.2.3 ובשלב 3.2.4. בטלו את הבחירה בתיבות שליד 'קביעת סף לתמונה' ו'קביעת תערוכי אשכול מהיסטוגרמה' והקלדו ידנית את הגודל והסף בשדות המתאימים ולחצו על הלחצן 'אשר'.
    3. חישוב אינדקס הצבירה (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_CalculateOverlap). בחר את הערוצים עם המסיכה שיש להשוות ואת הספריה שבה ישמרו הקבצים המתקבלים.
    4. חזור על שלבים 3.3.1-3.3.3 עבור כל תמונה 'זמן 60' בכל תנאי.
      הערה: אינדקס הצבירה מוגדר כאזור החפיפה הכולל חלקי הסכום של שני אזורי הערוצים פחות אזור החפיפה כפול 100 (אינדקס צבירה = אזור חפיפה/[אזור של ערוץ 1 + אזור של ערוץ 2 – אזור חפיפה] x 100). נורמליזציה זו היא פעולת 'OR' בין שני הערוצים עם המסיכה המייצגת את סך כל הפיקסלים בכל אחת מהמסכות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מוטציית A687T מגבירה את Neurexin3α SS4- מחייב LRRTM27
כדי לחקור כיצד אינטראקציות בין-תאיות של שני חלבונים סינפטיים ידועים מושפעות מהכנסת מוטציה נקודתית שנמצאה בחולה עם מוגבלות אינטלקטואלית ואפילפסיה, השתמשנו במדיין צבירת התאים הנ"ל HEK (איור 1). התאים הודבקו לפי סעיף 1 והוכנו להדמיה לפי סעיפים 1 ו-2 של הפרוטוקול. תאים צולמו בבסיס שבו לא נצפתה צבירה כצפוי (לא מוצג). תמונות שנרכשו ב 60 דקות נותחו כמו בסעיף 3 של הפרוטוקול. כדי למזער את הטיית הבחירה, התנאים היו אקראיים כדי לעוור את הנסיין. מסיבות דומות כל שדה התצוגה של כל תמונה נבחר כהו"ר.

תנאים שבהם תאים לא הביעו ליגנדים סינפטיים (GFP/mCherry) הראו צבירה מינימלית לאחר דגירה של 60 דקות (איור 2). באותה מידה, תנאים שבהם רק אחת משתי אוכלוסיות התאים הביעו ליגנדים סינפטיים (mCherry/LRRTM2-GFP או GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) הציגה צבירה מינימלית לאחר דגירה של 60 דקות (איור 2). כצפוי, תנאים שהכילו שתי אוכלוסיות של תאים עם מולקולות הידבקויות לא תואמות (Neurexin3αWT/A687T SS4+— mCherry/LRRTM2-GFP) לא הראו צבירה ב-60 דקות (איור 2B). תנאים אלה שימשו פקדים שליליים קריטיים כמו LRRTM2 ידוע לאגד אך ורק SS4 חסר isoforms (SS4-) של Neurexins ומדגיש את הספציפיות של מבחני צבירה זה.

תנאים עם מולקולות הידבקות תואמות8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- - mCherry / LRRTM2-GFP) הראו צבירה משמעותית לאחר דגירה של 60 דקות ( איור2C). ניתן לדמיין את הצבירה כצהובה והיא קיימת בחפיפה בין תאים (איור 1 ואיור 2). באופן מפתיע, המצב שבו Neurexin3α A687T SS4- היה דגירה משותפת עם LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- - mCherry / LRRTM2-GFP) הציג צבירה משמעותית יותר בהשוואה למקבילו סוג פראי (Neurexin3αWT SS4- - mCherry / LRRTM2-GFP). הדבר מצביע על כך שהמוטציה נקודת A687T ב Neurexin3α משפר את יכולות הכריכה של Neurexin3α SS4- כדי LRRTM2.

Figure 1
איור 1. זרימת עבודה של מבחני צבירה. (A)תאי HEK293T מודבקים באמצעות חלבון-1/mCherry, או חלבון-2/GFP. (B) הביטוי של Neurexin3α לוקח 48 שעות (C) תאים נקצרים באמצעות EDTA 10 mM ולאחר מכן גלולות (D). (E)תאים מעורבבים ביחס של 1:1 ו בשימוש חוזר ב 500 μL של מדיה HEK המכיל 10 mM CaCl2 ו MgCl2. (F)תאים הם דגירה בטמפרטורת החדר עד הצבירה מתרחשת תמונה סופית נרכשת ב 'זמן 60'. צבירה מוצגת באופן חזותי כמספר הניקוב הצהוב הגלוי בשדה הראייה. אין צבירה נצפתה כאשר התאים אינם מבטאים את זוגות ליגנד הקולטן הנכון ולכן נתפסים כמו נקבה אדומה או ירוקה בודדים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. Neurexin3αA687T SS4- שיפרה את הצבירה עם ליגנד סינאפסות LRRTM2 בהשוואה Neurexin3αWT SS4-. (A)תמונות מייצגות של פקדים שליליים לאחר דגירה של 60 דקות של mCherry עם GFP, mCherry עם LRRTM2, GFP עם Neurexin3αWT SS4+/-, ו- GFP עם Neurexin3αA687T SS4 +/-. צבירה נצפתה לאחר 60 דקות הן LRRTM2 עם Neurexin3αWT SS4-, ו LRRTM2 עם Neurexin3αA687T SS4-. (B)כימות מדד הצבירה בכל תנאי SS4+ לאחר 60 דקות. אינדקס צבירה = אזור חפיפה/(אזור של ערוץ 1 + אזור של ערוץ 2 – אזור חפיפה) x 100. (C)זהה ל-(B)אך SS4-. הנתונים המוצגים מייצגים את ממוצע ± SEM של מספר הניסויים (SEM: GFP/mCherry ± 0.0245, mCherry/LRRTM2 ± 0.02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0.02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0.0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0.0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0.0174; p = 0.0136). המספרים המוצגים בברים מייצגים את מספר הניסויים העצמאיים שבוצעו. קווים מנוקדים מייצגים צבירה בסיסית או ממוצעת מינימלית של תנאי בקרה. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי ANOVA חד כיווני, השוואות מרובות; *p<0.05; p<0.0001.איור זה שונה מ- Restrepo et al.7. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קבצי קידוד משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון המתרחשות טרנס במהלך הידבקות בתא יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים תאיים בסיסיים כולל היווצרות, פונקציה ותחזוקה של סינפסות במהלך התבגרות ושיפוץ. ההשלכות של אינטראקציות בין תא לתא מתרחבות מעבר לנוירוביולוגיה ויש להן תפקידים רחבים יותר בתמרת אותות, נדידת תאים ופיתוחרקמות 14. סטיות בהדבקת תאים יכולות לשבש תהליכים תאיים הכרחיים לתפקוד תקין של התא ויכולות בבסיס מגוון אטיולוגיות כגון סרטן, דלקת פרקים, התמכרות, אוטיזם וסכיזופרניה1,15,16. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט אופטימיזציה מעורבים צבירת תא HEK המאפשר בדיקת אינטראקציות הידבקות תאים בטרנס.

עם פרוטוקול צבירת תאי HEK זה, אנו יכולים לנתח את ההבדלים בצבירה ליכולת כריכה משוערת בין חלבון טרום-סינפטי לבין הליגנד הפוסט-סינפטי שלו. ככזה, אנו יכולים לשאול שאלות כגון: האם האינטראקציה בין שני חלבונים סינפטיים חיוניים מושפעת ממוטציה נקודתית? ליתר דיוק, האם האינטראקציה הטרנסית של Neurexin3α עם LRRTM2 מושפעת על ידי A687T? מוטציית ה-A687T missense שנחקרה כאן ממוקמת באזור מקשר שלא היה מוכר קודם לכן בתחום החוץ-תאי של Neurexin3α7. התוצאות ממחישות כי מוטציית A687T משפרת את הצבירה של תאים המכילים Neurexin3αA687T לתאים המכילים LRRTM2 (איור 2C). ממצא זה הוא משמעותי כי הוכח בעבר כי LRRTMs רק לאגד Neurexins באמצעות תחום Neurexin בשם LNS617, ועוד מציע כי רצפים במעלה הזרם של LNS6 יכול להפעיל השפעה עצמאית על אינטראקציות טרנס בין Neurexin3α SS4- ו LRRTM27.

התוצאות באיור 2 מציגות את הספציפיות של בדיקה זו כמו כל הפקדים השליליים (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- - mCherry / GFP או LRRTM-GFP / mCherry) לא היה צבירה נצפית לאחר 60 דקות. בקרה קריטית בשימוש במחקר זה, Neurexin3αWT / A687T SS4 + — mCherry / LRRTM-GFP, גם לא הפגינו צבירה לאחר 60 דקות כי LRRTM2 ידוע לאגד אך ורק SS4 חסר (SS4-) isoforms של Neurexin. פקד זה מדגים כי פשוט overexpression של מולקולות הקשורות לקרום אינו מספיק כדי לכפות צבירה במערכת זו, אשר ממחיש עוד יותר את הספציפיות של בדיקה זו.

הבדיקה הידבקות התא המתואר כאן כבר בשימוש נרחב כדי לבדוק את האינטראקציות של מולקולות הידבקות תא transsynaptic8,18,19; עם זאת, ניתן להשתמש בו כדי לבדוק אינטראקציות דבק בין תא לתא של חלבונים קשורים קרום. פרוטוקול זה, שהתפתח עם הזמן, עבר אופטימיזציה מהפרוטוקול המקורי שפורסם ומהווריאציות הבאות של הפרוטוקול על ידי שינוי שלושה פרמטרים ניסיוניים. אחד, טמפרטורת הדגירה של התאים השתנתה. הפרוטוקול המקורי קורא דגירה של תאים בשלב 1.9 ב 4 מעלות צלזיוס. טמפרטורה נמוכה זו יכולה לשמש כגורם לחץ סביבתי ויכולה להפחית את הכדאיות של התאים המובילים למוות של תאים ולתזה. במהלך תמוגה של התא, התאים מפרישים דנ"א גנומי ופסולת תאים למדיה שגורמת לתאים להתקבץ בתמיסה המובילה לחיוביות שגויות במהלך ההדמיה. שתיים, מספר התאים לכל תנאי הוגדל ל 200,000 לאוכלוסייה ואת הגודל האובייקטיבי השתנה 5x; זה מאפשר לחוקר לדמיין מספר גדול יותר של אינטראקציות לכל שדה תצוגה על מנת להגדיל את הכוח הסטטיסטי בתוך כל n. שלוש, מדד הצבירה נמדד אחרת. מדדי צבירה קודמים הוגבלו על ידי בחירת גודל האשכול על ידי הנסיין שהוביל להחרגת אשכולות "subthreshold". לעומת זאת, ספי הסף מוגדרים כעת לגודל תא בודד ב'זמן אפס', והצטברות מחושבת כעת כאזור החופף המחולק בסכום של שני אזורי הערוצים פחות אזור החפיפה כפול 100 ב-'time 60' המאפשר הכללה של אשכולות חיוביים קטנים יותר, מה שהופך את ההסמכה לרגישה יותר לזוגות אחרים של חלבון-ליגנד (איור 2B, C).

ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות ואופטימיזציה בהתאם לחלבונים הנמצאים באינטראקציה שנבדקו. למרות שתקופת הדגירה עד לרכישת התמונה הסופית תשתנה בהתאם לחלבונים שנבדקו, חיוני שלא תבונה צבירה ב'זמן אפס'. אם הצבירה נראית בזמן אפס, זה עשוי לרמוז כי התאים לא היו בריאים מלכתחילה. זה יכול להיות בגלל מספר גורמים כולל חשיפה פתאומית לטמפרטורות מתחת 37 מעלות צלזיוס או הליך ניסיוני איטי. חשוב לציין, אמצעי ההשעיה לשלב 1.7 צריך להיות ב 37 מעלות צלזיוס, אשר יאפשר לתאים להגיע בהדרגה לטמפרטורת החדר ללא ירידה קשה פתאומית בטמפרטורה. אחת הדרכים לבריאות אופטימלית של התאים לאורך כל הניסוי היא להבטיח ששלבים 1.7 עד 1.9 יושלמו בתוך פרק זמן של 25 דקות ללא הפסקות ביניהם. מומלץ כי המיקרוסקופ מוגדר ומוכן לשימוש לפני תאי קציר תאים בשלב 1.5; פעולה זו מבטיחה שניתן יהיה לצלם תמונת 'זמן אפס' אמיתית באופן מיידי בשלב 2.2.

אם הצבירה אינה נצפית לאחר 60 דקות של דגירה, מספר גורמים עשויים לתרום לחוסר הדבקה זה. ראשית, החלבונים המדוברים אינם שותפים מחייבים או עשויים לעסוק באינטראקציות זיקה נמוכות שאינן ניתנות לגילוי על ידי מבחנים אלה. במקרה זה, ייתכן שתידרש פעולה רגישה יותר.  שנית, חלבונים של עניין לא יכול להתאים את הממברנה כאשר לידי ביטוי לבד בתאי HEK. במקרה זה, לאשר כי החלבון הוא קרום מקומי באמצעות טכניקות ביוכימיות (biotinylation פני השטח) או ישירות לתייג את החלבון של עניין עם תג פלואורסצנטי ותמונה HEK293T תאים ב 40x או הגדלה גבוהה יותר כדי להעריך את ביטוי פני השטח. עם זאת, לאחר לוקליזציה קרום הוא אישר, אנו ממליצים להשתמש וריאנטים מתויגים עבור זה HEK תא צבירת מבחנים על מנת להעריך בצורה מדויקת יותר את יכולת הכריכה של החלבון המקומי. שלישית, בפרוטוקול זה אפשרנו Neurexin3α לבטא במשך 48 שעות; עם זאת, זמן ביטוי החלבון עשוי להשתנות בהתאם לחלבונים שנבדקו. רביעית, זה קריטי כדי להשלים את התקשורת בשלב 1.7 עם MgCl2 ו CaCl2 אם החלבונים המדוברים תלויים קטיונים דו-כיווניים כמו במקרה של הדוגמה של Neurexins ו LRRTM211. אם לא ידוע אם שותפי האינטראקציה דורשים תוסף דו-כיווני להדבקה, הוסף EDTA למצב אחד. EDTA צריך chelate קטיונים remining באופן טבעי נוכח DMEM הבטחת פתרון ללא סידן ומגנזיום. אם הידבקות נצפתה לאחר תוספת EDTA, החלבונים המדוברים אינם דורשים קטיונים דו-כיווניים להדבקה.

שיטות רבות קיימות כדי לבדוק אינטראקציות חלבון; עם זאת, רובם אינם ספציפיים לבדיקת רק אינטראקציות טרנס המתרחשות מתא לתא ודורשים צעדי טיהור חלבון מייגעים. למרות שבדיקת צבירת תאי HEK אינה מדד ישיר לזיקה ואין להשתמש בה כדי להחליף גישה כמותית יותר כדי לשחזר קבועי דיסוציאציה, למיטב ידיעתנו, בדיקה זו מייצגת גישה לבדיקת אינטראקציות טרנס אמיתיות באופן חצי כמותי ויעיל יחסית. יתר על כן, בשל הקלות היחסית של מבחני זה, ניתן להשתמש בצבירת תאי HEK בשילוב עם גישות כמותיות יותר אלה כדי להשיג אפיון רחב ומלא יותר של האינטראקציות המתרחשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש (R00MH103531 ו- R01MH116901 ל- J.A.), מענק הכשרה מוקדמת מהמכון הלאומי לרפואה כללית (T32GM007635 ל- S.R.), ומלגת לידה היל גיליאם למחקר מתקדם (GT11021 ל- S.R.). אנו מודים לד"ר קווין וולפרי על העזרה במיקרוסקופ, ד"ר K אולריך באייר על השימוש במיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי שלו, ותומס סודהוף (אוניברסיטת סטנפורד) על פלסמיד LRRTM2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL disposable microtubes with snap caps VWR 89000-028 Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane Thermo Fisher 567-0020 Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubes Ward’s Science 470224-998 Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture plates VWR 100062-892 culturing HEK cells
Calcium Chloride Sigma 223506-500G Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RT Kendro Laboratory Products 75004377 Harvesting HEK cells
CO2 cell incubator Thermo Scientific HERACELL 150i Incubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate Corning 10-013-CV HEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) Gibco 14190-144 Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma ED-500G Harvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area Corning 9381M26 Culturing HEK cells
Fetal Bovine Serum Sigma 17L184 HEK cell maintenance
HEK293T cells ATCC Model system
ImageJ NIH V: 2.0.0-rc-69/1.52p Image analysis
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma M9272-500G HEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher BioReagents BP332-500 Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) Solution GE Healthcare Life Sciences SH30042.01 Passaging HEK cells
Tube rotator Incubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged Denville Scientific Inc. M1021 Image acquisition
Wide-field microscope Zeiss Axio Vert 200M Image acquisition

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  2. Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
  3. Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
  4. Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
  5. Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
  6. Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
  7. Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
  8. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  9. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  10. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  11. Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
  12. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  13. Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
  14. Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
  15. Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
  16. Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
  17. Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
  18. Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
  19. Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).

Tags

מדעי המוח גיליון 159 צבירה ליגנדים סינפטיים HEK293T אינטראקציות חלבון טרנס Neurexin LRRTM הידבקות בתאים
מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Restrepo, S., Schwartz, S. L.,… More

Restrepo, S., Schwartz, S. L., Kennedy, M. J., Aoto, J. Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System. J. Vis. Exp. (159), e61237, doi:10.3791/61237 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter