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Artigo de método

Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

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DOI:

10.3791/61242

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20 de junho de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

O objetivo desta técnica é a visualização ex vivo de redes arteriais pulmonares de camundongos pós-natais e adultos precoces através da inflação pulmonar e injeção de um composto radio-opaco à base de polímero através da artéria pulmonar. Também são discutidas possíveis aplicações para tecidos fundidos.

Resumo

Vasos sanguíneos formam redes intrincadas no espaço tridimensional. Consequentemente, é difícil apreciar visualmente como as redes vasculares interagem e se comportam observando a superfície de um tecido. Este método fornece um meio de visualizar a complexa arquitetura vascular tridimensional do pulmão.

Para isso, um cateter é inserido na artéria pulmonar e a vasculatura é simultaneamente lavada de sangue e quimicamente dilatada para limitar a resistência. Os pulmões são então inflados através da traqueia a uma pressão padrão e o composto de polímero é infundido no leito vascular a uma taxa de fluxo padrão. Uma vez que toda a rede arterial é preenchida e permitida a cura, a vasculatura pulmonar pode ser visualizada diretamente ou visualizada em um scanner micro-CT (μCT).

Quando realizado com sucesso, pode-se apreciar a rede arterial pulmonar em camundongos que variam de idades pós-natal precoces a adultos. Além disso, enquanto demonstrado no leito arterial pulmonar, este método pode ser aplicado em qualquer leito vascular com colocação otimizada de cateter e pontos finais.

Introdução

O foco desta técnica é a visualização da arquitetura arterial pulmonar usando um composto à base de polímero em camundongos. Embora tenha sido realizado um trabalho extensivo em leitos vasculares sistêmicos como cérebro, coração e rim1,2,,3,4,5, há menos informações sobre a preparação e o preenchimento da rede arterial pulmonar. O objetivo deste estudo, portanto, é expandir o trabalho anterior6,,7,8 e fornecer uma referência escrita e visual detalhada que os pesquisadores podem facilmente seguir para produzir imagens de alta resolução da árvore arterial pulmonar.

Enquanto existem inúmeros métodos para rotulagem e vasculatura pulmonar de imagem, como ressonância magnética, ecocardiografia ou angiografia ct9,10, muitas dessas modalidades não conseguem preencher adequadamente e/ou capturar os pequenos vasos, limitando o escopo do que pode ser estudado. Métodos como secção serial e reconstrução fornecem alta resolução, mas são tempo/trabalho intensivo11,,12,13. A integridade do tecido mole circundante está comprometida na fundição tradicional de corrosão10,13,14,15,16. Mesmo a idade e o tamanho dos animais tornam-se fatores ao tentar introduzir um cateter ou, falta resolução. A técnica de injeção de polímero, por outro lado, preenche as artérias ao nível capilar e, quando combinada com μCT, permite uma resolução incomparável5. Amostras de pulmões de camundongos tão jovens quanto o pós-natal 14 foram lançadas com sucesso8 e processadas em questão de horas. Estes podem ser rescandados indefinidamente, ou mesmo enviados para preparação histológica/microscopia eletrônica (EM) sem comprometer o tecido mole existente17. As principais limitações para este método são o custo inicial do equipamento/software ct, desafios com o monitoramento preciso da pressão intravascular e a incapacidade de adquirir dados longitudinalmente no mesmo animal.

Este artigo baseia-se no trabalho existente para otimizar ainda mais a técnica de injeção da artéria pulmonar e empurrar os limites relacionados à idade/tamanho até o pós-natal 1 (P1) para produzir resultados impressionantes. É mais útil para equipes que desejam estudar redes vasculares arteriais. Assim, fornecemos novas orientações para a colocação/estabilização do cateter, maior controle sobre taxa/volume de preenchimento e destacamos armadilhas notáveis para o aumento do sucesso de fundição. Elencos resultantes podem então ser usados para caracterização futura e análise morfológica. Talvez mais importante, esta é a primeira demonstração visual, pelo nosso conhecimento, que orienta o usuário através deste procedimento intrincado.

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Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Pulmão e Sangue do Coração.

1. Preparação

  1. Injete o mouse intraperitonealmente com heparina (1 unidade/g de peso corporal do rato) e deixe-o ambulatório por 2 minutos.
  2. Eutanize o animal em uma câmara de CO2.
  3. Disponha o mouse em uma posição supina em uma placa cirúrgica e fixe todos os quatro membros na placa com fita. Use a ampliação para dissecção fina.

2. Expondo pulmões e traqueia

  1. Pulverize o lado ventral do mouse com 70% de etanol para minimizar a interferência capilar.
  2. Segure a pele abdominal com fórceps e faça uma pequena incisão com uma tesoura na região umbilical. Deslize as pontas da tesoura para a camada fascial entre a musculatura abdominal e a pele e comece a separar as duas camadas. Trabalhe rostrally, removendo a pele do abdômen, costela e pescoço.
  3. Abra a musculatura abdominal com uma tesoura e corte lateralmente em ambos os lados até que o diafragma seja exposto.
  4. Segure suavemente o processo xifoide e levante ligeiramente a caixa torácica maximizando a visão dos pulmões caudais através do diafragma fino e semitransparente. Faça cuidadosamente uma pequena incisão no diafragma logo abaixo do processo xifoide. Os pulmões entrarão em colapso e se retirarão do diafragma. Disseque o diafragma longe da caixa torácica, tomando cuidado para não cortar o parenchyma pulmonar.
  5. Localize e corte a veia cava inferior (IVC) e o esôfago por onde passam pelo diafragma. Use gaze para limpar qualquer sangue de poça na cavidade torácica, evitando contato com os pulmões.
  6. Segure o xifoide mais uma vez e levante suavemente. Corte a caixa torácica bilateralmente (aproximadamente na linha midaxillary) evitando o contato com os pulmões. Remova a caixa torácica anterior completamente, fazendo o corte final ao longo do ângulo severo pouco antes do manúbrio.
  7. Usando uma seringa pré-enchida, molhe liberalmente os pulmões com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS, pH 7.4) para evitar a secagem. Continue essa rotina durante todo o procedimento.
  8. Usando fórceps, segure o manúbrio e levemente se eleve do corpo. Usando uma tesoura, corte 1-2 mm lateralmente para o manúbrio, cortando clavículas e retire. Isso vai expor o timo por baixo.
  9. Segure cada lóbulo do timo, se separe e remova. Repita este procedimento com a glândula submandibular. Por fim, remova o tecido muscular que sobrepõe a traqueia.
    NOTA: Após a dissecção, o coração, a aorta ascendente (AA), tronco arterial pulmonar (PAT) e traqueia devem ser visíveis. Certifique-se de que os ramos arteriais primários do tronco não estão divididos ou feridos.

3. Cateterismo de PA e perfusão sanguínea

  1. Para montar a Unidade 1, rosca de 15 cm de tubo PE-10 sobre o cubo de uma agulha de 30 G e anexar a uma seringa de 1 mL pré-enchido com 10-4 M de nitroprusside de sódio (SNP) em PBS. Prime a tubulação avançando o êmbolo até que todo o ar seja purgado desta unidade (Figura 1).
    ATENÇÃO: O SNP é tóxico se engolido. Evite contato com a pele e os olhos. Lave bem a pele após o manuseio. Use equipamentos de proteção individual apropriados.
    1. Alternativamente, monte a Unidade 2. Para ratos pós-natal dia 7 (P7) e mais jovem, use um hemostat para separar uma agulha adicional de 30 G de seu hub e enfiar a agulha na extremidade aberta da tubulação da Unidade 1 (Figura 1).
  2. Em vez de uma agulha, use fórceps afiados curvos para agarrar uma extremidade de um comprimento de 10 cm de seda 7-0. Penetrar o ápice do coração entrando de um lado e passando as pontas dos fórceps através do músculo e para fora do outro lado. Segure a seda com outro conjunto de fórceps e puxe aproximadamente 2 cm de comprimento e amarre. Pegue a extremidade restante de 8 cm da sutura, puxando o coração caudally, e tape a extremidade para a placa cirúrgica.
    NOTA: Isso criará tensão, expondo ainda mais os grandes vasos e amarrando o coração no lugar, permitindo uma colocação mais fácil do cateter na artéria pulmonar.
  3. Enganque as pontas dos fórceps curvos sob o AA e o PAT. Puxe um comprimento de 3 cm de seda de 7-0 de volta através da abertura e crie uma sutura solta de um único arremesso.
  4. O uso de tesouras faz uma incisão de 1-2 mm em direção ao ápice do coração, penetrando no ventrículo direito de parede fina (RV), para permitir a inserção do cateter (Unidade 1). Antes da inserção, confirme que não há ar no sistema. Introduza a tubulação preparada no ventrículo direito e avance suavemente para o PAT semitransparente de paredes finas.
    1. Verifique visualmente se o cateter não avançou nos ramos pulmonar esquerdo ou direito e não se encaixa no ponto de ramificação da artéria pulmonar. Usando fita, fixe a porção distal da tubulação na placa cirúrgica.
      NOTA: Para identificar o RV, use fórceps para beliscar o lado direito do coração. Ao contrário do ventrículo esquerdo, a parede livre relativamente fina do trailer deve ser facilmente apreendida.
    2. Para camundongos mais jovens que P7, conecte a Unidade 2 a um micromanipulador e introduza a extremidade da agulha da unidade no PAT como descrito acima usando o manipulador.
  5. Aperte suavemente a sutura solta em torno de ambos os vasos grandes e corte o comprimento de 8 cm de sutura criado na etapa 3.2 para devolver o coração a uma posição de repouso natural. O cateter está agora firmemente fixado dentro do PAT.
  6. Corte a aurícula esquerda do coração para permitir que o perfusato saia do sistema.
  7. Fixar seringa contendo SNP (Unidade 1 ou Unidade 2, tamanho dependente) na bomba de seringa e perfundir a solução a uma taxa de 0,05 mL/min para lavar o sangue e dilatar a vasculatura. O sangue/perfusado sairá através da auricle cortada. Continue a perfusão até que o perfusato seja claro (~200 μL em um rato adulto, menos para animais mais jovens).
    NOTA: Ao perfundir a baixa viscosidade PBS/SNP, uma taxa de infusão relativamente maior foi usada no interesse de economizar tempo. O composto polímero mais viscoso é infundido a uma taxa mais lenta para evitar o excesso de escoamento, ruptura e maximizar o controle sobre os pontos finais distais.

4. Traqueostomia e inflação pulmonar

  1. Construir a unidade de inflação pulmonar(Figura 2).
    1. Conecte um cateter intravenoso de plástico flexível de 24 G (IV) (agulha removida)/infusão de borboleta situada em uma torneira, presa a uma seringa aberta de 50 mL (sem êmbolo). Pendure a seringa de uma banca de anéis.
    2. Adicione 10% de formalina tamponada à seringa. Abra a torneira, permitindo que a formalina entre na tubulação e purigue todo o ar do sistema. Feche a torneira e levante a seringa até que o menisco esteja 20 cm acima da traqueia8.
      ATENÇÃO: A formalina é inflamável, cancerígena, agudamente tóxica quando ingerida, e causa irritação na pele, danos graves nos olhos, sensibilização da pele e mutagenicidade das células germinativas. Evite a ingestão e o contato com a pele e os olhos. Evite a inalação do vapor ou da névoa. Mantenha-se longe de fontes de ignição. Use equipamentos de proteção individual apropriados.
  2. Coloque duas suturas soltas inferiores à cartilagem cricoide de 2-4 mm de distância.
  3. Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão no ligamento cricothiroide superior às suturas.
  4. Insira o cateter IV na abertura e avance a ponta além das duas suturas soltas.
  5. Aperte as suturas ao redor da traqueia e abra a torneira. Permita que a formalina entre nos pulmões pela gravidade e espere 5 minutos para que os pulmões inflem completamente. Se os pulmões aderirem à caixa torácica durante a inflação, segure o lado de fora da caixa torácica com fórceps de ponta sem cortes e mova-se em todas as direções para ajudar na libertação dos lóbulos. Não faça contato direto com os pulmões.
  6. Depois de 5 min, volte o cateter IV além da primeira sutura e ligadura. Repita para a segunda sutura. Os pulmões estão agora inflados em um estado fechado e pressurizado.

5. Lançando a vasculatura

  1. Em um tubo de 1,5 mL, prepare 1 mL de uma solução 8:1:18 de polímero:diluente:agente de cura e inverta suavemente várias vezes para garantir uma boa mistura.
  2. Retire o êmbolo de uma seringa de 1 cc, cubra a extremidade oposta com um dedo enluvado e despeje o composto de polímero na seringa. Reinserir cuidadosamente o êmbolo, inverter e avançar o êmbolo para remover todo o ar e formar um menisco na ponta da seringa.
  3. Remova a seringa SNP/PBS do cubo da agulha e gotejar PBS adicionais no cubo para criar um menisco. Verifique cuidadosamente o hub quanto ao ar preso, desaloja se necessário, e reforme o menisco. Junte-se ao hub para a seringa cheia com o composto polímero.
    NOTA: Criar um menisco em ambas as extremidades reduz significativamente a chance de o ar entrar no sistema.
  4. Conecte a seringa preenchida do composto polímero à bomba de seringa e infundir a 0,02 mL/min.
    NOTA: Para pulmões menores, uma taxa mais lenta pode ser útil para evitar o excesso de estoque, mas não é essencial.
  5. Monitore o composto à medida que ele se move livremente para baixo da tubulação pe e observe o volume da seringa à medida que entra no PAT. Continue enchendo até que todos os lóbulos sejam preenchidos completamente até o nível capilar e pare a bomba de seringa. Verifique novamente o volume da seringa.
    NOTA: Após várias corridas, um volume estimado pode ser usado para medir um ponto final aproximado (~35 μL para um mouse adulto e ~5 μL para um filhote P1). Depois que a bomba for interrompida, a pressão residual no sistema continuará empurrando o composto polímero para as artérias pulmonares. Todos os lóbulos pulmonares devem encher a uma taxa semelhante.
  6. Cubra os pulmões com um lenço de limpeza de fibra óptica, aplique liberalmente PBS e permita que a carcaça fique intacta por 30-40 min em temperatura ambiente. Durante este período, o composto polímero irá curar e endurecer.
  7. Retire o cateter, corte os braços/metade inferior do mouse e coloque a cabeça/tórax em uma cônica de 50 mL preenchida com formalina tamponada de 10% durante a noite.
  8. Após a fixação, segure a traqueia e separe suavemente a unidade coração/pulmão da caixa torácica e tórax restantes. Coloque o bloco coração/pulmão em um frasco de cintilação preenchido com formalina. Descarte o resto.

6. Leitos vasculares alternativos para fundição (Tabela 1)

NOTA: Cada cama vascular alvo pode exigir diferentes colocações de cateter, taxas de infusão e tempos de enchimento ideais. Assim, vários animais serão necessários para lançar múltiplos órgãos.

  1. Para leitos vasculares sistêmicos superiores ou inferiores ao diafragma siga as etapas 1.1-2.5 conforme acima. Veja notas adicionais no sistema portal e diafragma (Tabela 1).
  2. Segure o processo xifoide com um hemosta e corte a caixa torácica bilateralmente (aproximadamente na linha midaxillary) pouco antes das artérias torácicas internas.
  3. Dobre a caixa torácica ainda conectada sobre tal forma que ela está descansando sobre o pescoço/cabeça do animal, expondo totalmente a cavidade torácica.
  4. Siga o passo 3.1 acima e, em seguida, remova os pulmões. Uma vez que a aorta torácica (TA) é visível, engancha as pontas de fórceps curvas por baixo dele, ~10 mm superior ao diafragma. Segure um comprimento de 3 cm de seda 7-0, puxe para trás através da abertura sob o TA, e crie uma sutura solta de um único arremesso. Repita este procedimento ~8 mm acima do diafragma.
  5. Para estruturas superiores ao diafragma, use uma tesoura de mola para criar um pequeno orifício (~30% da circunferência total) na porção ventral do TA, ~2 mm inferior às suturas soltas colocadas na etapa 6.4.
    1. Para estruturas inferiores ao diafragma, em vez disso, crie um pequeno orifício ~2 mm superior às suturas soltas.
  6. Dependendo do tamanho do animal, introduza a Unidade 1 ou 2 no vaso, avance além das suturas soltas e liga o vaso suavemente.
  7. Siga o passo 3.7, definindo a bomba de seringa a uma taxa de 1,0 mL/min e perfundando um mínimo de 5 mL. Perfusate sairá através do IVC.
  8. Siga os passos 5.1 - 5.4 ajustando a taxa de infusão para 0,05 mL/min, monitorando visualmente o tecido alvo em tempo real.
    NOTA: O volume de infusão será específico da idade dos órgãos e animais. O volume pode ser ainda limitado ligando ramos arteriais que levam a leitos vasculares não-alvo (ou seja, cérebro, fígado, rim, intestino).
  9. Siga 5.6, em seguida, remova o tecido alvo e coloque em formalina.

7. Montagem, varredura e reconstrução de microcsição

  1. Usando filme de parafina, crie uma superfície plana na cama de varredura e centrale a amostra molhada nesta superfície(Figura 3A).
    NOTA: Se o artefato de movimento for detectado, a amostra pode exigir estabilização adicional.
  2. Amostra levemente tenda/capa com filme adicional de parafina para evitar a desidratação. Tome cuidado especial para não descansar o filme de parafina na amostra causando deformação ao tecido(Figura 3B).
  3. Escaneie a amostra usando configurações descritas na Tabela 2 e padronize esses parâmetros dentro de um determinado experimento.
    NOTA: Este é dependente de experimento/ponto final. Padronize os parâmetros escolhidos para a facilidade de comparação entre as amostras.
  4. Transfira os scans reconstruídos para pós-processamento e análise.

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Resultados

Um elenco bem sucedido exibirá o preenchimento uniforme de toda a rede arterial pulmonar. Demonstramos isso em camundongos C57Bl/6J variando em idade: Dia pós-natal P90 (Figura 4A),P30(Figura 4B),P7(Figura 4C)e P1(Figura 4D). Controlando a taxa de fluxo e monitorando visualmente o preenchimento em tempo real, foram alcançados pontos finais confiáveis da vasculatura mais ...

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Discussão

Executado corretamente, este método produz imagens marcantes de redes arteriais pulmonares, permitindo comparação e experimentação em modelos de roedores. Vários passos críticos ao longo do caminho garantem o sucesso. Primeiro, os investigadores devem heparinizar o animal na fase preparatória para evitar que coágulos sanguíneos se formem na vasculatura pulmonar e câmaras do coração. Isso permite o trânsito arterial completo do composto polímero. Em segundo lugar, ao perfurar o diafragma e remover a caixa torácica, tome c...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramuros da NHLBI (DIR HL-006247). Gostaríamos de agradecer ao NIH Mouse Imaging Facility por orientação em aquisição e análise de imagens.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de 1ccBecton Dickinson309659
20ml Frascos de cintilação de vidroFisher03-340-25P
30G AgulhaBecton Dickinson305106
Tubos cônicos de 50mLCornin352098Para armazenamento e digitalização de amostras
Seringa de 60ccBecton Dickinson309653
7-0 seda Teleflex103-S
Analyze 12.0 SoftwareAnalyzeDirect Inc.N / ASoftware Primário
Amira 6.7 SoftwareThermo ScientificN / ASofware Alternativo
CeramaCut Tesouras 9cmFerramentas de Ciências Finas14958-09
Pinça Curva Revestida de CerâmicaFerramentas de Ciências Finas11272-50
Tanque de CO2 Robert'sOxygen Co.n / a
Bomba de seringa duplaCole ParmerEW-74900-10
Dumont Mini-FórcepsFerramentas de ciências finas11200-14
EtanolPharmco111000200
FormalinaSigma - Ciências da vidaHT501128
GazeCovidien441215
HemostatFerramentas de ciências finas13013-14
Heparina (1000USP Unidades/ml)HospiraNDC 0409-2720-01
Horos SoftwareHoros ProjectN/Ade software alternativo
n/a n/a
KimwipeFisher06-666lenço de limpeza de fibra óptica
Fita de rotulagemFisher15966
Base magnéticaKanetecN/A
Sistema Micro-CTPerkinElmerQuantum GX
Microfil (Composto Polimérico)Flowech Inc.Kit B - MV-1228 onças de composto MV; 8 onças de diluente; Agente de cura MV
MicromanipuladorStoelting56131
Monoject 1/2 ml Seringa de insulinaCovidien1188528012
Octagon Fórceps Dentes retosFerramentas de ciências finas11042-08
ParafilmBemis company, Inc.
Tubulação PE-10InstechBTPE-10
Phospahte tampolado com solução salinaBioRad#161-0780
Suporte de anelFisherS13747Altura 24in.
Nitroprussiato de Sódiosigma71778-25G
Placa de AçoN/AN/A16 x 16 pol. de área, 1/16 pol de espessura
Tesoura de Mola RetaFerramentas Fine Science15000-08
Cateter I.V. de Teflon SURFLO 24GCruz Biotechnology360103
Placa CirúrgicaFisher12-587-20Este é um suporte de slide convertido
Grampo universal de 3 pinos Conjunto deFisherS24280
25X3/4, Tubulação de 12"NiproPR25G19
Zeiss Stemi-508 Escopo de DissecçãoZeissn/a
Câmara de indução #PM999 Santa Inf. Alado

Referências

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