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Biology

एक परिभाषित भेदभाव प्रणाली का उपयोग कर Pluripotent स्टेम सेल से हेपेटिक जनक विनिर्देश

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61256
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2, 2, 1
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Research & Development, STEMCELL Technologies Inc

Summary

इस लेख का लक्ष्य प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव हेपेटिक जनक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण प्रदान करना है। रेडी-टू-यूज मीडिया फॉर्मूलेशन के साथ इस प्रक्रिया का विकास उपयोगकर्ता को बायोमेडिकल अनुसंधान और अनुवाद के लिए मानव यकृत कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक फेसियल सिस्टम प्रदान करता है।

Abstract

जिगर की बीमारी एक बढ़ते वैश्विक स्वास्थ्य मुद्दा है । जबकि लिवर प्रत्यारोपण चिकित्सा का एक प्रभावी तरीका है, दाता अंग उपलब्धता में कमी के कारण रोगी मृत्यु दर में वृद्धि हुई है । अंग की कमी बुनियादी अनुसंधान और क्लिनिक के लिए मानव हेपेटोसाइट्स की नियमित आपूर्ति को भी प्रभावित करती है। इसलिए, मानव यकृत जनक कोशिकाओं के नवीकरणीय स्रोतों का विकास वांछनीय है और इस अध्ययन का लक्ष्य है। बड़े पैमाने पर मानव यकृत जनक को प्रभावी ढंग से उत्पन्न और तैनात करने में सक्षम होने के लिए, एक प्रजनन योग्य हेपेटिक जनक भेदभाव प्रणाली विकसित की गई थी। यह प्रोटोकॉल सेल कल्चरवेयर प्रारूपों की एक श्रृंखला में उपयोगकर्ताओं के बीच प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता को एड्स करता है और मानव भ्रूण और प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनों दोनों का उपयोग करके भेदभाव की अनुमति देता है। ये वर्तमान भेदभाव प्रणालियों पर महत्वपूर्ण लाभ हैं जो बुनियादी अनुसंधान को बढ़ाएंगे और नैदानिक उत्पाद विकास की दिशा में मार्ग प्रशस्त कर सकते हैं।

Introduction

जिगर की बीमारी एक वैश्विक स्वास्थ्य चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे दुनिया भर में प्रति वर्ष लगभग २,०,० मौतें होती हैं1। यद्यपि हेपेटिक रोगों का अध्ययन करने और चिकित्सकीय रूप से हस्तक्षेप करने के लिए कई मॉडल प्रणालियां मौजूद हैं, लेकिन सेल-आधारित प्रणालियों का नियमित उपयोग महत्वपूर्ण कमियों से सीमित है (समीक्षा के लिए Szkolnicka एट अल2देखें)। उन्नत मानव बहुलक स्टेम सेल (एचपीपीएससी) संस्कृति और दैहिक कोशिका भेदभाव विधियां क्लिनिक3,4के लिए बुनियादी जैव चिकित्सा अनुसंधान और विभेदित कोशिकाओं के नवीकरणीय स्रोतों के लिए उपकरण विकसित करने के लिए आशाजनक प्रौद्योगिकियों का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

आज तक, हेपेटोसिट-जैसे सेल (एचएलसी) भेदभाव के लिए कईप्रोटोकॉल5,6,7, 8विकसित किए गए हैं। ये प्रोटोकॉल छोटे अणुओं और विकास कारकों के संयोजन का उपयोग करके मानव यकृत के विकास के पहलुओं को फिर से बनाने का प्रयास करते हैं9,10. अधिकांश प्रोटोकॉल में एक स्टेपवाइज भेदभाव प्रक्रिया होती है, जहां एचपीएससी को निश्चित एंडोडर्म के लिए प्रिमेड किया जाता है, जिसके बाद हेपेटिक प्रोजेनिटर विनिर्देश11,12,13और एचएलसी विनिर्देश के साथ समाप्त होता है। इन प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित एचएलसी भ्रूण और वयस्क फेनोटाइप का मिश्रण प्रदर्शित करते हैं। इसमें अल्फा फेटोप्रोटीन (एएफपी) की अभिव्यक्ति शामिल है, जैसे एचएनएफ4α और एल्बुमिन (एएलबी) जैसे हेपेटोसिटे मार्कर, साथ ही दवा मेटाबोलाइजिंग क्षमता14,15,16। प्रयोगशालाओं के बीच, एचएलसी भेदभाव भिन्न हो सकता है; इसलिए, मानकीकृत प्रोटोकॉल का विकास आवश्यक है। इससे शोधकर्ता बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान के लिए बड़े पैमाने पर स्टेम सेल-व्युत्पन्न एचएलसी को प्रभावी ढंग से उत्पन्न और लागू करने में सक्षम होंगे ।

एक हेपेटिक जनक भेदभाव प्रणाली विकसित की गई थी जिसे आसान-से-पालन दिशानिर्देशों का उपयोग करके मानव भ्रूण और प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनों दोनों पर लागू किया जा सकता है। यह प्रक्रिया अलग-अलग कल्चरवेयर प्रारूपों में हेपेटिक जनकों की समरूप आबादी पैदा करती है, जिसमें सेल कल्चर फ्लास्क से लेकर 96 अच्छी प्लेटें होती हैं। नीचे प्रदान की 24 और ९६ अच्छी तरह से प्रारूपों में स्टेम सेल व्युत्पन्न हेपेटिक जनक का उत्पादन करने के लिए प्रोटोकॉल है ।

नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सेल घनत्व को क्रमशः 24 और 96 अच्छी प्लेट के एक कुएं के लिए निर्दिष्ट किया गया है (तालिका 1देखें)। विभिन्न सेल कल्चर प्लेट प्रारूपों और सेल लाइनों के लिए शुरुआती सेल नंबर का अनुकूलन आवश्यक है। प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए सेल घनत्व शुरू करने का सुझाव दिया 2 x 105 कोशिकाओं/सेमी2है । घनत्व अनुकूलन के लिए, एक समय में 50,000 कोशिकाओं/सेमी2 ± जोड़कर कई कोशिका घनत्व का परीक्षण किया जा सकता है।

Protocol

1. लैमिनिन-521 पर मानव pluripotent स्टेम सेल (एचपीएससी) रखरखाव

  1. लैमिनिन-521 (एलएन-521) पर 6 वेल प्लेट में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर मानव pluripotent कोशिकाओं (एचपीएससी) को बनाए रखें। कोशिकाओं को प्रतिदिन स्टेम सेल रखरखाव माध्यम (यानी mTeSR1 मध्यम) के 2 एमएल के साथ दैनिक फ़ीड करें, प्रति 6 अच्छी तरह से प्लेट के साथ भेदभाव के लिए चुने गए सीडिंग दिन तक (दिन 0)।
  2. सुनिश्चित करें कि सेल संचयन से पहले 70-80% की वांछित सेल पूर्णता प्राप्त की जाती है।

2. लैमिनिन-521 मल्टीवेल तैयारी और भेदभाव के लिए एचपीएससी सीडिंग

नोट: एलएन-521 (जैसे, मैट्रिक्स या फाइब्रोनेक्टिन) पर नहीं बनाए गएएचपीएससी के लिए, प्रक्रिया 15, 17, 18 की दक्षता में सुधार करने के लिए पास बढ़ने और भेदभाव को प्राप्त करने से पहले 1 सप्ताह के लिएएलएन-521और संस्कृति पर एचपीएससी को विभाजित करें।

  1. लैमिनिन-लेपित प्लेट तैयारी
    1. 2 घंटे या रात के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर recombinant LN-521 (100 μg/l) की एक शीशी गल।
    2. सीए 2 + //एमजी 2 + के साथ बर्फ-ठंडे 1x डीपीबीएस में गल गएएलएन-५२१को कमजोर करके8 माइक्रोन/एमएलसमाधान तैयार करें ।
    3. 8 μg/mL LN-521 समाधान के 0.25 एमएल जोड़ें एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के लिए एक 24 अच्छी तरह से या 0.05 एमएल के प्रत्येक कुएं के लिए। प्लेट को धीरे-धीरे साइड से रॉक करें ताकि एलएन-521 समाधान के साथ कुओं को समान रूप से कोट किया जा सके।
      नोट: 96 अच्छी प्लेट प्रारूप के लिए, वॉल्यूम वितरण, सेल सीडिंग और मध्यम परिवर्तन अर्ध-स्वचालित पाइपलाइन का उपयोग करके किए जा सकते हैं। विवरण के लिए Meseguer-Ripolles एट अल देखें ।19।
    4. उपयोग करने से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अर्द्ध पारदर्शी, लचीला फिल्म और स्टोर के साथ एलएन-521 लेपित प्लेटों को सील करें।
      नोट: एलएन-521 लेपित प्लेटों का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर 2 सप्ताह तक किया जा सकता है। लेमिनिन-लेपित कुओं के किसी भी सुखाने से बचें।
  2. सेल सीडिंग के दिन, सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्रीकोटेड प्लेटों को 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  3. एलएन-521 समाधान को एस्पिरेट करें।
    नोट: एलएन-521 कोटिंग को नुकसान से रोकने के लिए कुएं के नीचे के साथ एस्पिरेटर के सीधे संपर्क से बचें।
  4. एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए ताजा पूरक 10 μM Rho-संबद्ध kinase (रॉक) अवरोधक Y27632 के साथ स्टेम सेल रखरखाव माध्यम के 0.5 एमएल बांटना। सेल सीडिंग के लिए तैयार होने तक प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें।
  5. निर्धारित सीडिंग दिवस (दिन 0) पर और 70-80% के बीच एचपीएससी की ढुलमुलता के साथ, 6 अच्छी प्लेट के कुओं के तल पर सहज भेदभाव के किसी भी क्षेत्र को चिह्नित करें।
    नोट: सहज भेदभाव सेल आकार में एक सकल परिवर्तन और/या चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विभिंन सेल मॉर्फोलोजी की उपस्थिति से कल्पना की जा सकती है ।
  6. भेदभाव के चिह्नित क्षेत्रों और कुओं से खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और त्यागें। कमरे के तापमान (आरटी) पर सीए2 + /Mg 2 +के बिना डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छीतरह से धोएं ।
  7. एंजाइम मुक्त वियोजन अभिकर्ण के 1 मिलील जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक अच्छी तरह से और 8-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक कोशिकाओं को प्लेट से अलग दिख रहा है ।
  8. कुओं से कोशिकाओं को धीरे-धीरे अलग करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। एक एकल सेल निलंबन उपज के लिए एक P1000 पिपेट के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर और नीचे 2-4x की सामग्री पिपेट। प्रत्येक सेल लाइन के लिए, सभी रखरखाव कुओं से पूल कोशिकाओं को बाँझ 50 एमएल ट्यूब में।
  9. स्टेम सेल रखरखाव माध्यम के 1 मिलीएल के साथ प्रत्येक खाली अच्छी तरह से धो लें। उपयुक्त सेल लाइन से पूल्ड कोशिकाओं वाली संबंधित ट्यूब में वॉश जोड़ें।
  10. प्रत्येक सेल लाइन के लिए, पूल किए गए नमूनों पर तीन व्यवहार्य सेल मायने रखता है। प्रत्येक सेल लाइन के लिए औसत लाइव सेल काउंट (लाइव सेल/एमएल) की गणना करें।
  11. सेंट्रलाइज आरटी में 5 मिनट के लिए 250 x g पर पूल किए गए नमूने। सुपरनेट को एस्पिरेट करें, फिर आरटी स्टेम सेल मेंटेनेंस मीडियम के 1-3 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें, 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक Y27632 के साथ ताजा पूरक।
  12. प्रत्येक सेल लाइन के लिए, चरण 2.4 पर तैयार कुओं की संख्या के अनुसार आवश्यक सेल संख्या की गणना करें (तालिका 1देखें)। स्टेम सेल रखरखाव माध्यम के साथ आवश्यक सेल संख्या को फिर से खर्च करें ताजा 10 μM रॉक अवरोधक Y27632 के साथ पूरक।
  13. पहले जोड़े गए वॉल्यूम को हटाए बिना चरण 2.4 से तैयार और प्रीकोटेड प्लेटों के कुओं में गणना की गई मात्रा (ओं) जोड़ें। अच्छी तरह से प्रति कुल मात्रा एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए 1 एमसीएल और एक ९६ अच्छी तरह से थाली के लिए ०.१ एमएल होगा । धीरे-धीरे प्लेटों को साइड से साइड और आगे-पीछे रॉक करें ताकि कुएं में सेल फैलाव सुनिश्चित किया जा सके।
    नोट: समरूप सेल सीडिंग और सफल भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए कुएं में एक भी सेल वितरण महत्वपूर्ण है।
  14. वरीयता प्राप्त प्लेटों को इनक्यूबेटर में रखें और कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए धीरे - धीरे आगे और दूसरी ओर से बीज वाली प्लेटों को रॉक करें।

3. लेमिनिन-521 पर हेपेटिक जनकों के लिए एचपीएससी में अंतर करना

  1. सही एडिटिव्स के साथ पूरक एंडोडर्म बेसल मीडियम का उपयोग करके निश्चित एंडोडर्म इंडक्शन (चरण 1) के लिए मीडिया तैयार करें।
    1. 0 दिन में, एंडोडर्म बेसल मीडियम की बोतल को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर गल लें।
    2. आवश्यकतानुसार स्टेज 1 मध्यम 1 (1 दिन पर उपयोग के लिए) तैयार करें।
    3. बर्फ पर एमआर और पूरक सीजे गल पूरक।
    4. एंडोडर्म बेसल मीडियम में तनु सप्लीमेंट एमआर और सप्लीमेंट सीजे 1:100।
    5. जरूरत के अनुसार 2-4 दिन उपयोग के लिए स्टेज 1 मीडियम 2 तैयार करें।
    6. एंडोडर्म बेसल मीडियम में तनु सप्लीमेंट सीजे 1:100।
  2. हेपेटिक जनक माध्यम का उपयोग करके बाद में हेपेटिक जनक सेल विनिर्देश (चरण 2) भेदभाव के लिए मीडिया तैयार करें।
    1. 4 दिन, हेपेटिक प्रोजेनिटर माध्यम की बोतल को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर गल लें।
      नोट: इस प्रयोग के लिए क्रमशः 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० आईयू/एमएल और १०० माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता) का इस्तेमाल किया गया था । एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता नहीं है; एंटीबायोटिक का उपयोग उपयोगकर्ता के विवेक पर है।
  3. भेदभाव के दिन 1 पर, कुओं से 10 μM ROCKi Y-27632 माध्यम के साथ खर्च स्टेम सेल रखरखाव माध्यम को हटा दें और एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से पूरा चरण 1 मध्यम 1 के 0.5 मिलीएल के साथ बदलें और 0.1 एमएल प्रति अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से प्लेट।
  4. 2, 3 और 4 दिनों में, खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और प्रत्येक को 96 अच्छी प्लेट के 24 अच्छी तरह से प्लेट या 0.1 एमएल प्रति अच्छी तरह से स्टेज 1 मध्यम 2 के 0.5 एमएल के साथ अच्छी तरह से खिलाएं।
  5. 5 दिन पर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के माध्यम से निश्चित एंडोडर्म भेदभाव विश्लेषण के लिए कुओं को ठीक करें। शेष कुओं के लिए, खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और प्रत्येक को 96 अच्छी प्लेट की 24 अच्छी प्लेट या 0.1 एमएल प्रति अच्छी तरह से हेपेटिक प्रोजेनिटर विभेदन माध्यम के 0.5 एमएल के साथ अच्छी तरह से खिलाएं। 6, 7 और 9 दिनों पर फिर से माध्यम को ताज़ा करें।
  6. 10 दिन, हेपेटिक जनक भेदभाव विश्लेषण के लिए फसल कुओं या आगे हेपेटोसिटे की तरह सेल भेदभाव के साथ आगे बढ़ना।
    नोट: इस समय बिंदु पर, नमूनों को या तो इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री विश्लेषण के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया गया था या एलिसा के लिए सुपरनेट एकत्र किया गया था और प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के लिए कोशिकाओं को एकत्र किया गया था ।

4. लेमिनिन-521 पर एचपीएससी से उत्पन्न हेपेटिक प्रोजेनिटर भेदभाव संस्कृतियों का लक्षण वर्णन

  1. 5 दिन, इम्यूनोस्टेटिंग का उपयोग करके निश्चित एंडोडर्म-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
  2. 10 दिन, इम्यूनोस्टेटिंग का उपयोग करके हेपेटिक जनक-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
  3. 10 दिन पर, एलिसा के माध्यम से एएफपी और ALB स्राव को मापने के लिए एक किट का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों का पालन और प्रति मिलीग्राम प्रोटीन सामान्य के रूप में एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित ।
  4. एचएनएफ4α सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करके 96 अच्छी तरह से प्लेट की हेपेटिक जनक परिवर्तनशीलता का आकलन करें।

5. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और छवि अधिग्रहण

  1. भेदभाव के 5 और 10 दिनों में, 1x डीपीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं को धोएं, 0.5 एमएल प्रति कुएं के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेट और 96 अच्छी प्लेट के 0.1 एमएल प्रति कुएं। आरटी में 2-5 मिनट के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ थाली इनक्यूबेट ।
    नोट: इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए सीए2 +/एमजी2 + के बिना डीपीएसबी का उपयोग करें।
  2. 24 अच्छी तरह से प्लेट के लिए पीएफए के 0.3 एमएल और 96 अच्छी प्लेट के 0.1 एमएल प्रति कुएं के लिए 15-30 मिनट के लिए आरटी में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. चरण 5.1 में वर्णित 1x डीपीबीएस के साथ 3x धोएं।
  4. 0.1% ट्वीन, 1x डीपीबीएस और आरटी में 20 मिनट के लिए पीबीएसटी के 0.3 मिलीएल जोड़कर पीबीएसटी के साथ झिल्ली को पार करें।
  5. 1 घंटे के लिए PBST में 10% बीएसए के साथ कोशिकाओं इनक्यूबेटिंग द्वारा प्रोटीन ब्लॉक प्रदर्शन, एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से बीएसए के ०.३ एमएल जोड़ने और एक ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से बीएसए के ०.१ एमएल, धीरे एक थाली शेखर का उपयोग कर मिलाते हुए ।
  6. प्रोटीन अवरुद्ध होने के बाद, अवरुद्ध समाधान को पीबीएसटी में 1% बीएसए में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ बदलें और रात भर कोमल मिलाते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रोटीन ब्लॉक और एंटीबॉडी के अलावा के बीच न धोएं।
  7. 24 घंटे के बाद, पीबीएएसटी के साथ कुओं को 3x धोएं।
  8. पीबीएसए में 1% बीएसए में सेकेंडरी एंटीबॉडी डालें। कोमल मिलाते हुए के साथ अंधेरे में आर टी में 1 एच इनक्यूबेट ।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, 1x डीपीबीएस के साथ कुओं 3x धोने और कोमल मिलाते हुए के साथ अंधेरे में आरटी में 10 मिनट के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार Hoechst दाग बांटना ।
  10. 1x डीपीबीएस के साथ 3x धोएं। अब प्लेटें इमेजिंग के लिए तैयार हैं।
    नोट: इमेजिंग तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें स्टोर करें।
  11. इमेज मल्टीवेल प्लेट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के बाद हाई-कंटेंट इमेजिंग माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करते हुए। देखने के कई क्षेत्रों के छवि अधिग्रहण अच्छी तरह से एक सही प्रतिनिधित्व प्राप्त करने की सिफारिश की है । वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें)(चित्र 1)का उपयोग करके सेल विभाजन विश्लेषण के माध्यम से विभिन्न मार्कर की अभिव्यक्ति का आकलन किया गया था।
    नोट: सेल सेगमेंटेशन को सेलप्रोफिलर या फिजी20, 21जैसे छवि विश्लेषण ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके भी किया जासकताहै।

Representative Results

एचईएससी (एच 9) और एचआईपीसी (पी106) दोनों लाइनों से हेपेटिक जनक भेदभाव चित्रा 2में वर्णित स्टेपवाइज प्रोटोकॉल के बाद किया गया था। यहां, pluripotent स्टेम सेल एलएन-५२१-लेपित प्लेटों में एकल कोशिकाओं के रूप में वरीयता प्राप्त किया गया भेदभाव की शुरुआत से पहले । सेल मेंल्फ्यूलेंसी एक मजबूत और प्रजनन योग्य भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है। एक बार सही उदारता(चित्रा 2)हासिल हो जाने के बाद भेदभाव शुरू किया गया । 5 दिन में, Sox17 अभिव्यक्ति के माध्यम से निश्चित एंडोडर्म विनिर्देश का आकलन किया गया था। दोनों सेल लाइनों में, Sox17 को क्रमशः 80% ± 0.5% और 87.8% ± 0.5% एसईएम के साथ H9 और P106 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को क्रमशः व्यक्त किया गया था(चित्रा 3)। 10 दिन में, हेपेटिक जनकों ने एक कोबलस्टोन जैसी आकृति विज्ञान(चित्रा 2)प्रदर्शित किया। इसके अलावा, एचएनएफ4α, एएफपी, एएलबी, और साइटोकेराटिन-19 (सीके 19) अभिव्यक्ति के साथ-साथ एएफपी और एएलबी प्रोटीन स्राव10,15,22 (चित्रा 4)के लिए हेपेटिक जनक विनिर्देश का आकलन किया गया था। दोनों H9 और P106 हेपेटिक जनक संस्कृतियों ऐसे HNF4α (९१% ± ०.५% और ९०% ± ०.२%), एएफपी (८९.७% ± भ्रूण हेपेटिक मार्कर व्यक्त की 1.8% और 86% ± 1.2%), और सीके 19 (78.5% ± 3.2% और 83.6 ± 1.8%)(चित्रा 4)। एएफपी स्राव दोनों सेल लाइनों में 10 दिन में पाया गया था (३२.४ ± १.६ और ४७.८ ± ५.९ एनजी/mL/mg/24 h)(चित्रा 5)। एल्बुमिन संश्लेषण निचले स्तरों पर देखा गया (30.7% ± 1.8% और 27.2% ± 1.1%)(चित्रा 4)और एलिसा(चित्रा 5)के माध्यम से पता नहीं चला था।

प्रोटोकॉल ने 24 अच्छी तरह से 96 अच्छी प्लेटों तक हेपेटिक प्रोजेनिटर्स के मानकीकृत उत्पादन की अनुमति दी। एक अर्द्ध स्वचालित पाइपलाइन H9 और P106 सेल लाइनों से हेपेटिक जनकों की ९६ अच्छी तरह से प्लेटों का उत्पादन करने के लिए नियोजित किया गया था के रूप में पहले17वर्णित है । सेल संख्या परिवर्तनशीलता और हेपेटिक जनक भेदभाव दक्षता का आकलन एचएनएफ4α अभिव्यक्ति के मात्राकरण के माध्यम से किया गया था। उच्च सामग्री इमेजिंग उपकरण(चित्रा 1)का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के लिए सेल सेगमेंटेशन किया गया था। दिन 10 में, हेपेटिक जनकों ने HNF4α-सकारात्मक कोशिकाओं के >94% के साथ पंक्तियों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता नहीं दिखाई, जो एच 9 के लिए अच्छी तरह से और 97% HNF4α-सकारात्मक कोशिकाओं के लिए P106(चित्रा 6)के लिए है।

Figure 1
चित्र 1:सेल सेगमेंटेशन पाइपलाइन अवलोकन। (A)मूल छवि का उपयोग करके,(ख)नाभिक विभाजन के लिए परमाणु धुंधला का उपयोग किया गया था । (ग)आकार और आकार पर आधारित एक परमाणु विभाजन गुणवत्ता नियंत्रण कदम केवल स्पष्ट रूप से खंडित नाभिक की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था । (घ)इसके बाद सकारात्मक एचएनएफ4α-दाग नाभिक की मात्रा निर्धारित की गई । (ई)अंत में, HNF4α-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक तीव्रता आधारित सीमा नियोजित की गई थी । सी और ईमें, हरे नाभिक चयनित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं और मैजेंटा नाभिक त्याग कोशिकाओं का संकेत देते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2:एचपीएससी से हेपेटिक प्रोजेनिटर विभेदन। (ए)हेपेटिक जनक विभेदक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख)प्रतिनिधि छवियां भेदभाव के दौरान रूपात्मक परिवर्तनों को उजागर करते हुए । दिन 0 (डी0) में, एचपीएससी ने कोशिकाओं का एक पैक मोनोलेयर प्रस्तुत किया। इसके बाद, एचपीएससी को 5 दिन (D5) पर निश्चित एंडोडर्म में प्रिमेड किया गया था। इसके बाद 10 दिन (D10) पर हेपेटिक जनक भेदभाव हुआ । हेपेटिक जनकों ने एक कोबलस्टोन जैसी सेल आकृति विज्ञान प्रदर्शितकिया। स्केल बार = 75 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: निश्चित एंडोडर्म विनिर्देश का लक्षण वर्णन। 5 दिन में, कोशिकाओं Sox17, एक निश्चित एंडोडर्म मार्कर के लिए दाग थे । Sox17-सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत H9 के लिए 0.5% ± 80 और P106 के लिए 0.5% ± 87.8 था। प्रतिशत मात्राकरण 10 अलग कुओं पर आधारित था जिसमें 6 क्षेत्रों को अच्छी तरह से देखा गया था । डेटा को औसत ± एसईएम स्केल बार = 50 माइक्रोन के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4:हेपेटिक जनक चरित्र चित्रण। दिन 10 में, हेपेटिक जनकों को हेपेटिक मार्कर(ए)एचएनएफ4α,(बी)एएफपी, और(सी)एएलबी के लिए दाग दिया गया था। H9 के लिए, सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत 0.4%, 89.7% ± ± 1.8% और एचएनएफ4α, एएफपी और एएलबी के लिए क्रमशः 1.8% ± 91% था। P106 के लिए, सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत क्रमशः 0.2%, 86% +/- 1.2%, और 27.2% ± 1.1% के ± क्रमशः 90% थे। (घ)Cholangiocyte वंश क्षमता CK19 अभिव्यक्ति के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था; H9-व्युत्पन्न हेपेटिक जनकों ने 3.2% सीके19-पॉजिटिव कोशिकाओं ± 78.5% व्यक्त किया, जबकि पी106 हेपेटिक प्रोजेनर्स के लिए सीके19-पॉजिटिव कोशिकाओं के 1.8% ± 83.6% देखा गया। इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) धुंधला एक धुंधला नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । प्रतिशत मात्राकरण 10 अलग कुओं पर आधारित था जिसमें 6 क्षेत्रों को अच्छी तरह से देखा गया था । डेटा को औसत ± एसईएम स्केल बार = 50 माइक्रोन के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5:हेपेटिक जनक प्रोटीन स्राव विश्लेषण। अल्फा भ्रूण (एएफपी) और एल्बुमिन (ALB) के स्राव H9 और P109 में 10 दिन में हेपेटिक जनक संस्कृतियों में विश्लेषण किया गया था । डेटा तीन जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं और त्रुटि सलाखों एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्रावित प्रोटीन को 24 एच संस्कृति माध्यम से प्रोटीन प्रति मिलीग्राम प्रति एमएल स्रावित प्रोटीन के नैनोग्राम के रूप में निर्धारित किया गया था, एन = 3; ND = पता नहीं चला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:96 अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता का आकलन। (A)HNF4α के साथ दाग H9-व्युत्पन्न हेपेटिक जनकों के 96 अच्छी तरह से प्लेट दृश्य का दृश्य। (ख)एचएनएफ4α-पॉजिटिव कोशिकाओं का मात्राकरण । पंक्तियों में प्रति अच्छी तरह से सेल संख्या का औसत, देखने के छह क्षेत्रों से प्रति अच्छी तरह से मात्रा निर्धारित । प्लेट में औसत सेल संख्या 0.22 SEM HNF4α-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 94.81% ± थी। कुओं के बीच कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया । (ग)P106-व्युत्पन्न हेपेटिक जनकों के 96 अच्छी तरह से प्लेट दृश्य का दृश्य HNF4α के साथ दाग। (घ)HNF4α-सकारात्मक कोशिकाओं का मात्राकरण । पंक्तियों में प्रति कुओं औसत सेल संख्या, देखने के छह क्षेत्रों से प्रति अच्छी तरह से और मात्रा निर्धारित । प्लेट में औसत सेल संख्या 0.57 SEM HNF4α-सकारात्मक कोशिकाओं के ± 97.7% थी। पंक्तियों के बीच कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया । खैर H12 एक इम्यूनोग्लोबुलिन जी (IgG) धुंधला नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । स्केल बार = 1 मिमी। तुकी के पोस्ट-हॉक सांख्यिकीय परीक्षणों के साथ वन-वे इनोवा को नियोजित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्लेट प्रारूप सतह क्षेत्र (सेमी2) प्रति सेमी 2 कोशिकाएं कुल कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से डिस्पेंसिंग वॉल्यूम (एमएल) कोशिका एकाग्रता (कोशिकाएं/एमएल)
24-अच्छी तरह से थाली 1.9 210526 400000 0.5 800000
96-अच्छी थाली 0.32 187500 60000 0.05 1200000

तालिका 1:इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली एचपीपीएससी सेल लाइनों के लिए विभिन्न प्लेट प्रारूपों के लिए अनुशंसित सेल घनत्व।

Discussion

बड़े पैमाने पर बहुलिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव हेपेटिक जनक कोशिकाओं की पीढ़ी शव-व्युत्पन्न सामग्री के लिए एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकती है। जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए प्रौद्योगिकी अनुवाद और प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल मानकीकरण और प्रजनन क्षमता महत्वपूर्ण है। इसके समाधान के लिए, पिछले कार्य में परिभाषित एडिटिव्स और मैट्रिस15, 23, 24, 25,26,27,28का उपयोग करके एचईसी और आईपीएससी से स्टेपवाइज भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है। ऐसा करके, हेपेटोसिटे फेनोटाइप और प्रजनन क्षमता में सुधार किया गया है, जिससे भेदभाव प्रक्रिया19के अर्ध-स्वचालन की अनुमति दी गई है। प्रस्तुत प्रणाली ऑफ-द-शेल्फ सेल कल्चर मीडिया और एक फेसियल हेपेटोसाइट भेदभाव प्रणाली के साथ इसके संयोजन से मजबूत होती है।

इससे पहले, विभेदन प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले प्लुरिपोटेंट सेल घनत्व को हेपेटिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं की समरूप आबादी को प्राप्त करने के लिए एक प्रमुख चर के रूप में रेखांकित किया गया था26। इस अधिक परिष्कृत प्रक्रिया का उपयोग करके, सेल घनत्व(तालिका 1)शुरू करने की एक श्रृंखला का उपयोग करके स्टेल सेल-व्युत्पन्न हेपेटिक जनकों की बड़ी संख्या को स्टेपवाइज तरीके से उत्पन्न करना संभव है। 5 दिन में, निश्चित एंडोडर्म प्रेरण Sox17 धुंधला(चित्रा 3)द्वारा मान्य किया गया था । निश्चित एंडोडर्म में कुशल और मजबूत भेदभाव परीक्षण ईएससी और आईपीएससी दोनों लाइनों के साथ हासिल किया गया था, जिसमें 80% से अधिक Sox17(चित्रा 3)व्यक्त किया गया था। 10 दिन में, हेपेटिक जनकों ने एक समान कोबलस्टोन जैसी आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया, और यकृत स्टेम सेल मार्कर एएफपी और एचएनएफ4α (>86%, चित्रा 4)दोनों के लिए अत्यधिक समृद्ध थे। मैनुअल और अर्ध-स्वचालित प्रौद्योगिकियों के संयोजन का उपयोग करके कई प्लेट प्रारूपों19में भेदभाव करना संभव था।

इसके वर्तमान रूप में, सेल भेदभाव इन विट्रो आधारित प्रयोग के लिए उपयुक्त है। हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए नैदानिक आवेदन से पहले सेल संवर्धन की आवश्यकता होगी कि हेपेटिक जनकों की समरूप आबादी वितरण के लिए तैयार की जाती है।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर हेपेटिक जनकों का उत्पादन करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण के साथ क्षेत्र प्रदान करता है। भविष्य के काम के बाद एचएलसी भेदभाव, परिपक्वता, और रखरखाव के लिए एक नए माध्यम के उत्पादन पर ध्यान दिया जाएगा ।

Disclosures

डेविड सी घास एक सह संस्थापक और Stemnovate लिमिटेड के शेयरधारक है बाकी लेखक प्रमाणित करते हैं कि उनके पास इस लेख में चर्चा किए गए विषय या सामग्री में हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एमआरसी डॉक्टोरल ट्रेनिंग पार्टनरशिप (एमआर/K501293/1), यूके रिजेनरेटिव मेडिसिन प्लेटफॉर्म (एमआरसी एमआर/एल022974/1 और एमआर/के026666/1), मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (टीसीएस/16/37) के पुरस्कारों के साथ समर्थन दिया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies 7174
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent thermofisher R37165
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Human Serum Albumin ELISA Alpha Diagnostics 1190
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA Alpha Diagnostics 500
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 5850
Operetta High-Content Imaging System PerkinElmer HH12000000
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190250
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ STEMCELL Technologies
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR STEMCELL Technologies
STEMdiff Endoderm Basal Medium STEMCELL Technologies
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium STEMCELL Technologies
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416
Antibodies
Albumin Sigma-Aldrich A6684 1:200 (mouse)
Alpha-fetoprotein Sigma-Aldrich A8452 1:400 (mouse)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:400 (rabbit)
IgG DAKO 1:400
Sox17 R&D Systems, Inc. AF1924 1:200 (Goat)
Software
Columbus Image Data Storage and Analysis system PerkinElmer

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References

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जीव विज्ञान अंक 159 pluripotent स्टेम सेल निर्देशित भेदभाव हेपेटिक जनक निश्चित एंडोडर्म प्रक्रिया स्वचालन स्केल-अप और मानकीकरण।
एक परिभाषित भेदभाव प्रणाली का उपयोग कर Pluripotent स्टेम सेल से हेपेटिक जनक विनिर्देश
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