Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.
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Artigo de método
Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os polímeros de proteína neurofilamental movem-se ao longo dos axônios no componente lento do transporte axonal a velocidades médias de ~0,35-3,5 mm/dia. Até recentemente, o estudo desse movimento in situ só era possível utilizando rotulagem de pulso radioisotópica, que permite a análise do transporte axonal em nervos inteiros com resolução temporal de dias e resolução espacial de milímetros. Para estudar o transporte de neurofilamento in situ com maior resolução temporal e espacial, desenvolvemos um camundongo transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa proteína de neurofilamento M marcada com GFP fotoativatável em neurônios. Aqui descrevemos os métodos de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso e difusão de pulso para analisar o transporte de neurofilamento em axônios mieliados únicos de nervos tibiais desses camundongos ex vivo. Segmentos nervosos isolados são mantidos no estágio do microscópio por perfusão com soro fisiológico oxigenado e imageados por microscopia de fluorescência confocal de disco giratório. A luz violeta é usada para ativar a fluorescência em uma janela axonal curta. A fluorescência nas regiões ativadas e flanqueadas é analisada ao longo do tempo, permitindo o estudo do transporte de neurofilamento com resolução temporal e espacial na ordem de minutos e mícrons, respectivamente. A modelagem matemática pode ser usada para extrair parâmetros cinéticos do transporte de neurofilamento, incluindo a velocidade, viés direcional e comportamento de pausa dos dados resultantes. Os métodos de fuga de pulso e difusão de pulso também podem ser adaptados para visualizar o transporte de neurofilamento em outros nervos. Com o desenvolvimento de camundongos transgênicos adicionais, esses métodos também poderiam ser usados para imagem e análise do transporte axonal de outras proteínas citoesqueletal e citosóica em axônios.
Introdução
O transporte axonal de neurofilamentos foi demonstrado pela primeira vez na década de 1970 pela rotulagem de pulso radioisotópica1. Essa abordagem tem gerado uma riqueza de informações sobre o transporte de neurofilamento in vivo,mas tem resolução espacial e temporal relativamente baixa, tipicamente na ordem dos milímetros e dias, no máximo2. Além disso, a rotulagem de pulso radioisotópica é uma abordagem indireta que requer a injeção e o sacrifício de vários animais para gerar um curso único. Com a descoberta de proteínas fluorescentes e os avanços na microscopia de fluorescência na década de 1990, tornou-se po....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio.
1. Preparação da solução salina nervosa
- Faça 100 mL de soro fisiológico de Breuer10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glicose, 23,8 mM NaHCO3 em água duplamente destilada.
- Bolha 95% de oxigênio/5% dióxido de carbono (carbogen) através da solução salina por pelo menos 30 minutos antes do uso. As sobras de soro fisiológico podem ser reutilizadas dentro de uma semana; n....
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Resultados
A Figura 3 mostra imagens representativas de experimentos de fuga de pulso e propagação de pulso. Publicamos diversos estudos que descrevem dados obtidos utilizando o método pulse-escape e nossos métodos para a análise desses dados5,,6,7,,8,,17. Abaixo, mostramos como os dados de difusão de pulso podem produzir informações sobre a.......
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Discussão
Deve-se tomar cuidado na análise de experimentos de fuga de pulso e difusão de pulso, pois há um potencial significativo para a introdução de erros durante o pós-processamento, principalmente durante a correção de campo plano, alinhamento de imagem e correção de alvejante. A correção em campo plano é necessária para corrigir a não uniformidade na iluminação, o que resulta em uma queda de intensidade em todo o campo de visão do centro para a periferia. A extensão da não uniformidade é dependente do comprimento de onda e, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer paula Monsma por instrução e assistência com microscopia confocal e dissecção do nervo tibial e Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger e Sana Chahande pela assistência com a criação de ratos. Este trabalho foi apoiado em parte pela Colaborativa National Science Foundation Grants IOS1656784 to A.B. e IOS1656765 a P.J., e Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde R01 NS038526, P30 NS104177 e S10 OD010383 a A.B. N.P.B. foi apoiado por uma bolsa do Programa de Pós-Doutorado do Presidente da Universidade estadual de Ohio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Junta retangular 14 x 22 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | junta interna |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| Junta redonda de 30 mm com furos | Bioptechs | 1907-08-750 | junta externa |
| 35 x 10 mm prato | Thermo Fisher | 153066 | pratos de dissecação |
| 40 mm lamínulas redondas | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| Seringa de 60mL - Ponta Luer-lock | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD sistema confocal de disco giratório | Andor | equipado com sistemas Perfect Focus e FRAPPA | |
| Cloreto de cálcio | Fisher | C79 | |
| Lamínulas | Fisher | 12-541-B | lâmina de fluoresceína |
| Sigma | G8769 | ||
| Pinos de dissecação | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Pinça de dissecação | Fine Science Tools | 11251-30 | pinça de ponta fina |
| Microscópio de dissecção | Zeiss | 47 50 03 | |
| Panela de dissecação com cera | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Tesoura de dissecação | Fine Science Tools | 14061-09 | inicial tesoura de dissecção |
| FCS2 câmara de perfusão | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluoresceína sódica | Fluka | 46960 | |
| Aquecedor de solução em linha | Warner Instruments | SH27-B | |
| Pinça de laminectomia | Fine Science Tools | 11223-20 | pinça de dissecção inicial |
| Sulfato de magnésio | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Lâmina de microaqueduto | Bioptechs | 130119-5 | |
| Lâminas de microscópio | Fisher | 12-544-3 | para lâmina de fluoresceína |
| Inserção de platina de microscópio | Instrumentação Científica Aplicada | I-3017 | |
| Sistema de aquecimento de objetiva | Okolab | Oko Touch com colar de objetiva | |
| Óleo de objetiva - tipo A | Nikon | descontinuado | |
| Plano Apo VC 100x 1.40 NA objetiva | Nikon | MRD01901 | |
| Cloreto de potássio | Fisher | P217 | |
| Fosfato de potássio | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sódio iodoacetato | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Bomba de seringa | Sage Instruments | Modelo 355 | |
| Adaptador de tubulação - fêmea | Small Parts Inc. | ||
| Adaptador de tubulação - macho | Small Parts Inc. | ||
| Tygon tubulação | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" espessura de parede | |
| Tesoura de mola Vannas | Fine Science Tools | 15018-10 | tesoura fina |
Referências
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport.
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Reimpressões e permissões
