Artigo de método

Um sistema de neuronação estereática guiada por imagem de alta produtividade e sistema de ultrassom focado para abertura de barreira hemencefálica em roedores

DOI:

10.3791/61269

⸱

16 de julho de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, Pediatric Oncology, Cancer Center Amsterdam, 2Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 3Imaging Division, Utrecht University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A barreira hemencefálica (BBB) pode ser temporariamente interrompida com ultrassom focado (ME) mediado por microbolhas. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para abertura BBB de alto rendimento in vivo usando um sistema de FUS modular acessível para especialistas em não-ultrassom.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A barreira hemencefálica (BBB) tem sido um grande obstáculo para o tratamento de várias doenças cerebrais. As células endoteliais, conectadas por junções apertadas, formam uma barreira fisiológica impedindo que grandes moléculas (>500 Da) entrem no tecido cerebral. O ultrassom focado (FUS) mediado por microbolhas pode ser usado para induzir uma abertura de BBB local transitória, permitindo que drogas maiores entrem no parenchyma cerebral.

Além de dispositivos clínicos em larga escala para tradução clínica, a pesquisa pré-clínica para avaliação de resposta terapêutica de candidatos a medicamentos requer configurações dedicadas de ultrassom animal para abertura de BBB direcionada. De preferência, esses sistemas permitem fluxos de trabalho de alto rendimento com alta precisão espacial, bem como monitoramento integrado de cavitação, enquanto ainda são econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução.

Aqui, apresentamos um sistema de FUS ANIMAL de pequeno animal bioluminescência e raios-X guiado que se baseia em componentes disponíveis comercialmente e preenche os requisitos acima mencionados. Uma ênfase particular foi colocada em um alto grau de automação facilitando os desafios tipicamente encontrados em estudos de avaliação de medicamentos pré-clínicos de alto volume. Exemplos desses desafios são a necessidade de padronização para garantir a reprodutibilidade de dados, reduzir a variabilidade intra-grupo, reduzir o tamanho da amostra e, assim, cumprir com os requisitos éticos e diminuir a carga de trabalho desnecessária. O sistema BBB proposto foi validado no âmbito da abertura do BBB facilitou testes de entrega de medicamentos em modelos de xenoenxerto derivados do paciente de glioblastoma multiforme e glioma médio difuso.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A barreira hematoencefálica (BBB) é um grande obstáculo para a entrega de drogas no cérebro. A maioria das drogas terapêuticas desenvolvidas não atravessam o BBB devido aos seus parâmetros físico-químicos (por exemplo, lipoficidade, peso molecular, aceitadores de vínculos de hidrogênio e doadores) ou não são retidos devido à sua afinidade com transportadores efflux no cérebro1,2. O pequeno grupo de drogas que podem atravessar o BBB são tipicamente pequenas moléculas lipofílicas, que só são eficazes em um número limitado de doenças cerebrais1,2. Como consequência, para a maioria das doenças cerebrais, as opções de tratamento farmacológico são limitadas e novas estratégias de entrega de medicamentos são necessárias3,4.

O ultrassom terapêutico é uma técnica emergente que pode ser usada para diferentes aplicações neurológicas, como ruptura BBB (BBBD), neuromodulação e ablação4,5,6,7. Para conseguir uma abertura BBB com um emissor de ultrassom extracorpórea através do crânio, o ultrassom focado (FUS) é combinado com microbolhas. O MEC mediado por microconstrução resulta no aumento da biodisponibilidade de drogas no cérebro parenchyma5,8,9. Na presença de ondas sonoras, os microbolhas começam a oscilar iniciando a transcitose e a interrupção das junções apertadas entre as células endoteliais do BBB, permitindo o transporte paracelular de moléculas maiores10. Estudos anteriores confirmaram a correlação entre a intensidade da emissão acústica e o impacto biológico na abertura do BBB11,12,13,14. O FUS em combinação com microbolhas já tem sido utilizado em ensaios clínicos para o tratamento de glioblastoma usando temozolomide ou doxorubicina liposômica como agente quimioterápico, ou para terapia da doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica5,9,15,16.

Uma vez que a abertura do BBB mediado pelo ultrassom resulta em possibilidades totalmente novas para farmacoterapia, é necessária pesquisa pré-clínica para tradução clínica para avaliar a resposta terapêutica de candidatos a medicamentos selecionados. Isso normalmente requer um fluxo de trabalho de alto rendimento com precisão espacial elevada e, preferencialmente, uma detecção integrada de cavitação para monitoramento da abertura do BBB com uma alta reprodutibilidade. Se possível, esses sistemas precisam ser econômicos tanto no investimento inicial quanto nos custos de execução, para serem escaláveis de acordo com o tamanho do estudo. A maioria dos sistemas de FUS pré-clínicos são combinados com ressonância magnética para orientação de imagem e planejamento de tratamento15,17,18,19. Embora a ressonância magnética dê informações detalhadas sobre a anatomia e o volume do tumor, é uma técnica cara, que geralmente é realizada por operadores treinados/qualificados. Além disso, a ressonância magnética de alta resolução pode nem sempre estar disponível para pesquisadores em instalações pré-clínicas e requer longos tempos de varredura por animal, tornando-o menos adequado para estudos farmacológicos de alto rendimento. Destaca-se que, para pesquisas pré-clínicas no campo da neuro-oncologia, em especial modelos de tumores infiltrados, a possibilidade de visualizar e atingir o tumor é essencial para o sucesso do tratamento20. Atualmente, essa exigência só é cumprida por ressonância magnética ou por tumores transduzidos com fotoproteína, possibilitando visualização com bioluminescência de imagem (BLI) em combinação com a administração do substrato de fotoproteína.

Os sistemas de FUS guiados por ressonância magnética frequentemente usam um banho de água para garantir a propagação de ondas de ultrassom para aplicações transcranianas, em que a cabeça do animal está parcialmente submersa na água, os chamados sistemas ''bottom-up''15,17,18. Embora esses projetos funcionem geralmente bem em estudos em animais menores, eles são um compromisso entre os tempos de preparação animal, portabilidade e padrões higiênicos realisticamente mantidos durante o uso. Como alternativa à ressonância magnética, outros métodos de orientação para navegação estereotática abrangem o uso de um atlas anatômico de roedores21,22,23, ponteiro laser assistido ao avistamento visual24, dispositivo de varredura mecânica assistido por pinhole25, ou BLI26. A maioria desses desenhos são sistemas "de cima para baixo" em que o transdutor é colocado em cima da cabeça do animal, com o animal em uma posição natural. O fluxo de trabalho ''top-down'' consiste em um banho de água22,25,26 ou um cone cheio de água21,24. O benefício de usar um transdutor dentro de um cone fechado é a pegada mais compacta, menor tempo de configuração e possibilidades de descontaminação direta simplificando todo o fluxo de trabalho.

A interação do campo acústico com os microbolhas é dependente da pressão e varia de oscilações de baixa amplitude (chamada de cavitação estável) ao colapso transitório da bolha (referido como cavitação inercial)27,28. Há um consenso estabelecido de que o ultrassom-BBBD requer uma pressão acústica bem acima do limiar de cavitação estável para alcançar o sucesso do BBBD, mas abaixo do limiar de cavitação inercial, que geralmente está associado a danos vasculares/neuronais29. A forma mais comum de monitoramento e controle é a análise do (back-)sinal acústico disperso utilizando detecção passiva de cavitação (PCD), conforme sugerido por McDannold et al.12. O PCD baseia-se na análise dos espectros fourier de sinais de emissão de microbolhas, nos quais a força e o aparecimento de marcas de cavitação estáveis (harmônicas, subharmônicas e ultraharmônicas) e marcadores de cavitação inercial (resposta de banda larga) podem ser medidos em tempo real.

Uma análise de PCD "de um tamanho" para controle preciso de pressão é complicada devido à polidispersidade da formulação de microbolhas (a amplitude de oscilação depende fortemente do diâmetro da bolha), as diferenças nas propriedades da casca de bolha entre as marcas e a oscilação acústica, que depende fortemente da frequência e da pressão30,31,32. Como consequência, muitos protocolos diferentes de detecção de PCD foram sugeridos, que foram adaptados a combinações particulares de todos esses parâmetros e têm sido usados em vários cenários de aplicação (que vão desde experimentações in vitro sobre pequenos protocolos animais até PCD para uso clínico robusto) para detecção robusta de cavitação e até mesmo para controle retroativo de feedback da pressão11,14,30,31,32,33,34,35. O protocolo PCD empregado no escopo deste estudo é derivado diretamente de McDannold et al.12 e monitora a emissão harmônica para a presença de cavitação estável e ruído de banda larga para detecção inercial de cavitação.

Desenvolvemos um sistema de ME FUS de neuronavigção guiado por imagem para abertura transitória do BBB para aumentar a entrega de drogas no parênquim cerebral. O sistema é baseado em componentes disponíveis comercialmente e pode ser facilmente adaptado a diversas modalidades de imagem diferentes, dependendo das técnicas de imagem disponíveis na instalação animal. Como exigimos um fluxo de trabalho de alto rendimento, optamos por usar raio-X e BLI para orientação de imagem e planejamento de tratamento. As células tumorais transduzidas com uma fotoproteína (por exemplo, luciferase) são adequadas para a imagemBLI 20. Após a administração do substrato de fotoproteína, as células tumorais podem ser monitoradas in vivo e o crescimento e localização do tumor podem ser determinados20,36. A BLI é uma modalidade de imagem de baixo custo, permite acompanhar o crescimento do tumor ao longo do tempo, tem tempos de varredura rápidos e se correlaciona bem com o crescimento do tumor medido com ressonância magnética36,37. Optamos por substituir o banho de água por um cone cheio de água ligado ao transdutor para permitir flexibilidade para mover livremente a plataforma em que o roedor é montado8,24. O design é baseado em uma plataforma destacável equipada com integração de (I) marcadores fiduciais de plataforma estereustática (II) de pequena animal com máscara de compatibilidade de imagem x e óptica (III) de alta destastésia rápida e (IV) sistema de aquecimento animal regulado pela temperatura integrada. Após a indução inicial da anestesia, o animal é montado em uma posição precisa na plataforma onde permanece durante todo o procedimento. Consequentemente, toda a plataforma passa por todas as estações do fluxo de trabalho de toda a intervenção, mantendo um posicionamento preciso e reprodutível e anestesia sustentada. O software de controle permite a detecção automática dos marcadores fiduciais e registra automaticamente todos os tipos de imagens e modalidades de imagem (ou seja, micro-CT, raio-X, BLI e imagem de fluorescência) no quadro de referência da plataforma estereotática. Com a ajuda de um procedimento de calibração automática, a distância focal do transdutor de ultrassom é precisamente conhecida dentro, o que permite a fusão automática do planejamento intervencionista, entrega acústica e análise de imagem de acompanhamento. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2,esta configuração fornece um alto grau de flexibilidade para projetar fluxos de trabalho experimentais dedicados e permite o manuseio intercalado do animal em diferentes estações, o que, por sua vez, facilita experimentos de alto rendimento. Usamos esta técnica para a entrega bem sucedida de drogas em xenoenxertos de rato de glioma de alto grau, como glioma midline difuso.

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Protocolo

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Todos os experimentos in vivo foram aprovados pelo comitê de ética holandês (número de licenças AVD114002017841) e pelo Corpo de Bem-Estar Animal da Vrije Universiteit Amsterdam, nos Países Baixos. Os investigadores foram treinados no básico do sistema de FUS, a fim de minimizar o desconforto dos animais.

1. Sistema de ultrassom focado

NOTA: A configuração descrita é um sistema de disrupção BBB construído em casa com base em componentes disponíveis comercialmente e inclui um cone personalizado impresso em 3D e uma plataforma estereotática destacável. O sistema é projetado modular, o que facilita modificações de acordo com equipamentos disponíveis e uso específico. O protocolo descreve o procedimento para a sonoporação de uma área maior na região pontina do cérebro do camundongo. Ajustando o local alvo, diferentes partes do cérebro podem ser alvo. Neste estudo foi utilizado um transdutor mono-elemento de 1 MHz com distância focal de 75 mm, abertura de 60 mm e área focal de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pressão máxima). O plano focal do transdutor é posicionado através do crânio do animal no plano horizontal cruzando com as barras de ouvido.

  1. Selecione um transdutor apropriado para abertura BBB em roedores.
    NOTA: Com base nas propriedades dos microbolhas e na frequência empregada, as configurações acústicas, em especial o índice mecânico (MI), estão sujeitas a alterações13,38.
  2. Coloque o transdutor no cone impresso em 3D.
  3. Empregue uma membrana mylar acústicamente transparente na extremidade inferior do cone para obter o acoplamento acústico do caminho de propagação do feixe, e encha o cone com água desgassada.
  4. Monte o transdutor acima do animal em um estágio linear motorizado, como mostrado na Figura 1 permitindo o posicionamento vertical automático do transdutor.
  5. Projete uma plataforma estereotática destacável com base nos requisitos do estudo, que inclui aquecimento regulado pela temperatura, barras de mordida e ouvido, anestesia e marcadores fiduciais multi-modalidade, como mostrado na Figura 1 e Figura 2. A montagem da plataforma estereotática consiste em um sistema de estágio linear 2D, que permite um posicionamento automático preciso (< 0,1 mm) do animal sob o feixe.
  6. Conecte o transdutor à cadeia de emissão acústica mostrada na Figura 1, composta por um transdutor, um gerador de função e um amplificador de energia.
  7. Crie um pipeline de processamento de imagem para detectar os marcadores fiduciais multi-modalidade que permitem a sonoraporção precisa visando a área de interesse do cérebro e coleta dos dados de cavitação detectados pelo hidrofone da agulha.
  8. Calibrar o sistema e determinar o ponto de foco do transdutor em correspondência ao posicionamento vertical do animal na plataforma estereotática.

2. Preparação animal

NOTA: O seguinte protocolo é especificado para ratos, mas pode ser adaptado para ratos. Para esses experimentos, foram utilizados ratos nus atímicos foxn1-/- ratos (6-8 semanas de idade).

  1. Permita que o animal se aclimata por pelo menos uma semana na instalação animal e pese o animal regularmente.
  2. Administre a injeção de buprenorfina (0,05 mg/kg) através de injeção subcutânea (s.c.) 30 min antes do tratamento de FUS para iniciar o tratamento analgésico.
  3. Anestesiar o animal com 3% de isoflurane, 2 L/min O2 e verificar se o animal está profundamente anestesiado. Mantenha os animais anestesiados durante todo o procedimento e monitore a frequência respiratória e a frequência cardíaca para ajustar a concentração de isoflurane conforme necessário.
  4. Aplique pomada ocular para evitar olhos secos e evite possíveis lesões.
  5. Retire o cabelo na parte superior da cabeça com uma navalha e creme depilatório e lave depois com água para remover quaisquer resíduos para evitar irritação na pele.
  6. Para experimentos com modelos de tumor BLI, injete 150 μL de D-luciferin (30 mg/mL) intraperitoneal (i.p.) com uma seringa de insulina de 29 G para orientação de imagem BLI.
  7. Insira um cateter de veias traseiras de 26-30 G e lave o cateter e a veia com um pequeno volume de solução de heparina (5 UI/mL). Encha o cateter com solução de heparina para evitar a coagulação sanguínea.
    NOTA: Um bom cateterismo é visto quando há um refluxo de sangue no cateter. Evite bolhas de ar no cateter para evitar embolias. Para evitar pressão excessiva de injeção, certifique-se de que o comprimento do cateter seja o mais curto possível.
  8. Coloque o animal na plataforma estereotática regulada pela temperatura para evitar hipotermia.
    NOTA: A hipotermia reduz a circulação sanguínea, o que pode afetar a injeção/circulação de microbolhas e a farmacocinética dos medicamentos39.
  9. Imobilize e conserte a cabeça do animal na plataforma estereotática usando barras de ouvido e uma barra de mordida. Fixar o corpo com uma alça e amarrar a cauda do animal na plataforma.

3. Ultrassom focado em imagem in vivo

NOTA: Para este protocolo foi utilizado um transdutor mono-elemento de 1 MHz com pulso de explosão de tom com duração de 10 ms, um MI de 0,4 e uma frequência de repetição de pulso de 1,6 Hz com 40 ciclos para 240 s. O protocolo é otimizado para microbolhas estabilizadas por fosfolipídios contendo hexafluoreto de enxofre (SF6) como um gás inócuo, pelo qual o diâmetro médio da bolha é de 2,5 μm e mais de 90% das bolhas são menores que 8 μm.

  1. Coloque a plataforma estereotática com o animal montado na modalidade de imagem (porexemplo, BLI ou raio-X) e tire a imagem do animal.
  2. Use os marcadores fiduciais multi-modalidade em combinação com o pipeline de processamento de imagem para marcar a posição do animal de acordo com o ponto de foco do transdutor.
  3. Determine a área alvo colocando um contorno cerebral sobre a imagem de raio-X adquirida ou usando imagens BLI para determinar o centro do tumor (Figura 2). A posição de partes específicas do cérebro são especificadas no Paxinos Brain Atlas40 usando as marcas do crânio bregma e lambda como pontos de referência. Por exemplo, os pons estão localizados x=-1.0, y=-0,8 e z=-4,5 de lambda.
  4. Proteja as narinas e a boca do animal com fita adesiva para evitar que o gel de ultrassom interfira na respiração.
  5. Aplique gel de ultrassom em cima da cabeça do animal.
  6. Retraia a pele do pescoço dos animais, lubrifica o hidrofone da agulha com gel de ultrassom e coloca o hidrofone da agulha nas proximidades diretas do osso occipital.
  7. Guie o transdutor até a posição correta usando o pipeline de processamento de imagem e o ponto de foco.
  8. Aplique as configurações pré-configuradas em todos os dispositivos conectados e direja a região do cérebro de interesse.
    NOTA: Dependendo da questão da pesquisa, as regiões tumorais ou cerebrais podem ser sonoporadas como um único ponto focal ou como forma volumosa, como mostrado na Figura 2.
  9. Ative microcompletos conforme descrito pelo fabricante. Injete um bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbolhas.
  10. Lave o cateter da veia da cauda com soro fisiológico para verificar a abertura do cateter.
  11. Injete os microbolhas e inicie a insstilação.
  12. Registo de microbolhas com o hidrofone da agulha.
  13. Administre um agente de contraste intravascular ou uma droga após a sonoporação. A dose, o tempo e o planejamento dependem da finalidade do estudo e da droga.
    NOTA: O azul evans é um agente de cores comum para avaliar a abertura do BBB41.
  14. Monitore o animal até o ponto de tempo predeterminado ou antes do ponto final humano.

4. Análise da cavitação de microbolhas

NOTA: Aqui está descrito o procedimento aplicado, que é adequado para experimentação in vivo para microbolhas SF6-fosfolipid com diâmetro médio de 2,5 μm (80% das bolhas abaixo de 8 μm) animado com um pulso de tom de explosão de 10 ms de duração em uma frequência de 1 MHz, como originalmente sugerido por McDannold et al.12.

  1. Transforme o sinal PCD gravado do domínio de tempo para o domínio de frequência.
  2. Integre a potência espectral resultante para detecção estável de cavitação em torno da harmônica2ª e3ª (± 50 kHz), como mostrado na Figura 3 (caixa verde a 2 e 3 MHz).
  3. Integre a potência espectral para detecção de cavitação inercial, entre a frequência principal, a2ª, a3ª harmônica, a1ª ea 2ª ultraarmônica e a primeira sub-harmônica (± 150 kHz), como mostrado na Figura 3 (caixas vermelhas).
  4. Integre a potência espectral em torno da frequência principal (1 MHz ± 50 kHz) para a normalização de ambos os sinais PCD obtidos anteriormente.
    NOTA: O sinal PCD, para microbolhas SF6-fosfolipid in vivo experimentos a 1 MHz, não exibe ultraharmônicas ou subharmônicas antes que a cavitação inercial se instale, como mostrado na Figura 3.

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Resultados

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O sistema fus descrito (Figura 1 e Figura 2) e o fluxo de trabalho associado têm sido usados em mais de 100 animais e produziram dados reprodutíveis em camundongos saudáveis e tumores. Com base na cavitação registrada e na densidade espectral nos harmônicos no momento de pico da injeção de bolus de microbolhas, o poder espectral de cada frequência pode ser calculado utilizando-se a análise de Fourier, conforme explicado na etapa 4 do Protocolo. Com base no proto...

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Discussão

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Neste estudo, desenvolvemos um sistema de FUS baseado em imagem econômico para interrupção transitória do BBB para o aumento da entrega de medicamentos no parênquim cerebral. O sistema foi construído em grande parte com componentes comercialmente disponíveis e em conjunto com raio-X e BLI. A modularidade do projeto proposto permite o uso de diversas modalidades de imagem para planejamento e avaliação em fluxos de trabalho de alto rendimento. O sistema pode ser combinado com modalidades de imagem 3D de alta resolução mais...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este projeto foi financiado pelo KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrínsic Pontine Glioma and High-grade Glioma). Agradecemos a Ilya Skachkov e Charles Mougenot por sua contribuição no desenvolvimento do sistema.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa luer-lock de 1 mLBecton Dickinson309628Plastipak
19 G agulhaTerumo Agani8AN1938R1
23 G agulhaTerumo Agani8AN2316R1
3M Transpore fita cirúrgicaCiência aplicada à vida7000032707ou similar
Gerador de forma de onda arbitráriaSiglentn.a.SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Stereotact automatizadoconstruído internamenten.a.Stereotactcom todos os elementos foram construídos internamente
Bruker In-Vivo XtremeBrukern.a.Incluisoftware
Solução de NaCl tamponadoB. Braun Melsungen AG220/12257974/110
Cloridrato de buprenorfinaIndivior UK limitadon.a.0.324mg
Enriquecimento de gaiola: papel-polpa casa inteligenteBio serviçosn.a.Filtro
de carbonoBickfordNC0111395Omnicon f/air
Colher de cerâmican.an.a.Cotonetes
algodão
, sal de potássioOuro BiotecnologiaLUCK-1
EtanolVUmc farmácian.a.70%
Evans BlueSigma AldrichE2129
Fresenius NaCl 0,9%Fresenius Kabin.a.NaCl0,9%, 1000 mL
HistoacrylBraun Surgicaln.a.Histoacryl0,5 mL
HydrophonePrecision Acousticsn.a.Seringa
insulinaBecton Dickinson324825/3248260,5 mL e 0,3 mL
IsofluranoTEVA Pharmachemie BV8711218013196250 mL
CetaminaAlfasann.a.10%, 10 mL
Alimento para ratos: Teklad global 18% proteína dieta para roedoresEnvigo2918-11416M
Cateter NeoflonBecton Dickinson39134926 GA 0,6 x 19 mm
Osciloscópio TecnologiasKeysightn.a.InfiniiVisionDSOX024A
Tubos de plásticoGreiner bio-one210261de 50 mL
Eletrônica e Innovation Ltd210LModelo 210L
Pré-amplificador DC Acoplador PrecisionAcousticsn..Número de série: DCPS94
TesouraSigma AldrichS3146-1EAou similar
SedazineAST Farman.a.2%
SonoVue microbolhasBraccon.a.8µ l/ml
Água estérilFresenius Kabin.a.1000mL
Seringan.a.a.váriasseringas podem ser usadas
TemgesicIndivior UK limitdn.a.0.3mg/ml
TransdutorPrecision Acousticsn.a.1MHz
PinçasSigma AldrichF4142-1EAou
similar Gel de ultrassomLaboratórios Parker Inc.01-02Aquasonic 100
Vidisic gelBausch + Lombn.a.10g
de n.a.n.a.D-luciferina de amplificador de potência

Referências

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