Lesão Neuronal Direcionada para a Desconexão Não Invasiva do Circuito Cerebral

Resumo

O objetivo do protocolo é fornecer um método para produzir lesões neuronais não invasivas no cérebro. O método utiliza o Ultrassom Focalizado guiado por Ressonância Magnética (MRgFUS) para abrir a Barreira Cerebral sanguínea de forma transitória e focal, a fim de fornecer uma neurotoxina circulante para o parenchyma cerebral.

Resumo

A intervenção cirúrgica pode ser bastante eficaz para o tratamento de certos tipos de doenças neurológicas medicamente intratáveis. Essa abordagem é particularmente útil para distúrbios nos quais circuitos neuronais identificáveis desempenham um papel fundamental, como epilepsia e distúrbios de movimento. Atualmente, as modalidades cirúrgicas disponíveis, embora eficazes, geralmente envolvem um procedimento cirúrgico invasivo, que pode resultar em lesão cirúrgica em tecidos não-alvo. Consequentemente, seria de valor expandir a gama de abordagens cirúrgicas para incluir uma técnica que não seja invasiva e neurotóxica.

Aqui, é apresentado um método para produzir lesões focais e neuronais no cérebro de forma não invasiva. Esta abordagem utiliza ultrassom focado em baixa intensidade, juntamente com microbolhas intravenosas para abrir transitoriamente e focalmente a Barreira Cerebral de Sangue (BBB). O período de abertura do BBB transitório é então explorado para fornecer focalmente uma neurotoxina administrada sistematicamente em uma área cerebral direcionada. O ácido neurotoxina quinolínico (QA) é normalmente impermeável ao BBB, e é bem tolerado quando administrado intraperitoneal ou intravenosamente. No entanto, quando a QA ganha acesso direto ao tecido cerebral, é tóxica para os neurônios. Este método tem sido usado em ratos e camundongos para atingir regiões cerebrais específicas. Imediatamente após o MRgFUS, a abertura bem sucedida do BBB é confirmada usando imagens ponderadas t1 aprimoradas em contraste. Após o procedimento, a imagem T2 mostra lesão restrita à área alvo do cérebro e a perda de neurônios na área alvo pode ser confirmada após a morte utilizando técnicas histológicas. Notavelmente, os animais injetados com soro fisiológico em vez de QA demonstram abertura do BBB, mas não apresentam lesão ou perda neuronal. Este método, denominado Cirurgia Guiada Não Invasiva Não Invasiva Precisa (PING) poderia fornecer uma abordagem não invasiva para o tratamento de distúrbios neurológicos associados a distúrbios em circuitos neurais.

Introdução

O objetivo deste método é fornecer um meio para produzir lesões neuronais não invasivas em uma região alvo do cérebro. A lógica para desenvolver tal abordagem é desconectar circuitos neuronais que contribuem para distúrbios neurológicos. Por exemplo, a cirurgia pode ser bastante eficaz no tratamento de certos distúrbios neurológicos medicamente intratáveis, como epilepsia resistente a medicamentos (DRE)¹. No entanto, cada uma das modalidades cirúrgicas disponíveis possuem limitações em termos de produzir danos colaterais indesejáveis ao cérebro. A cirurgia resetiva tradicional pode ser altamente invasiva com o risco de sangramento, infecção, coágulos sanguíneos, derrame, convulsões, inchaço do cérebro e danos nos nervos². Alternativas à cirurgia resegtiva que são minimamente invasivas ou não invasivas incluem terapia térmica intersticiacional a laser e radiocirurgia, que também se mostraram eficazes na supressão de convulsões em DRE. Mais recentemente, lesões térmicas produzidas por ultrassom focado em alta intensidade (HIFU) têm se mostrado promissoras na redução das convulsões. HIFU não é invasivo; no entanto, sua janela de tratamento está atualmente limitada a áreas mais centrais do cérebro devido ao risco de lesão térmica ao tecido não-alvo localizado nas proximidades do crânio. Apesar dessas limitações, os benefícios da cirurgia muitas vezes superam os riscos potenciais. Por exemplo, embora a cirurgia para DRE possa produzir danos cerebrais colaterais, seus efeitos benéficos na supressão de convulsões e na melhoria da qualidade de vida normalmente prevalecem sobre os riscos cirúrgicos.

O método descrito aqui, Precise Intracerebral Non-invasivo Cirurgia Guiada (PING), foi desenvolvido com o propósito de desconectar circuitos neurais, limitando os danos cerebrais colaterais. O método utiliza ultrassom focado em baixa intensidade combinado com injeção intravenosa de microbolhas para abrir o BBB, a fim de entregar uma neurotoxina. Esta abordagem não produz lesões térmicas no cérebro^3,4,5,,6,7, e o período de abertura do BBB pode ser explorado para fornecer compostos bbb-impermeáveis ao cérebro parenchyma. A abertura do BBB é transitória, podendo ser produzida de forma direcionada usando orientação de ressonância magnética. Em nossos estudos, o período de abertura do BBB tem sido utilizado para fornecer uma neurotoxina circulante para uma área alvo do parênquim cerebral em ratos e camundongos^8,9. O ácido quinolínico é uma neurotoxina bem tolerada quando administrada por via intravenosa¹⁰, intraarterially¹⁰, ou intraperitoneally^8,9,11. A falta de toxicidade do QA deve-se à sua baixa permeabilidade BBB, que tem sido relatada como insignificante¹⁰. Em contraste, a injeção direta de QA no parênquim cerebral produz lesões neuronais que poupam os axônios vizinhos^12,13. Assim, quando a QA circulante ganha acesso ao parênquim cerebral na área alvo da abertura do BBB, a morte neuronal é produzida^8,9. O presente método produz, assim, perda neuronal focal de forma precisamente direcionada e não invasiva.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia.

1. Preparação de reagentes

1. No dia da cirurgia, prepare 6,0 mL de ácido quinolínico injetável (QA). Dissolver 450 mg de QA em 4,0 mL de 1.0 N NaOH. Adicione 0,6 mL de PBS de 10x, pH a 7,4, e leve a um volume final de 6,0 mL com dH₂O. Filtre através de 0,22 μm filtro de seringa. A solução é estável por 2 semanas a 4 °C.
2. Prepare uma dispersão aquosa de microbolhas em soro fisiológico normal por sônica de sonda a partir de gás decafluorobutano e estabilize com a concha de monocamado de estearato DSPC/PEG¹².
3. O tamanho microboliza por flutuação em gravidade normal. Determine a concentração e o tamanho da microbolhas por sensor de eletrozona usando o contador Multisizer III. A concentração de microbolhas e a distribuição de tamanho devem ser de 6 x 10⁸/mL e ~2 μm (diâmetro médio de partículas), respectivamente. As maiores bolhas são removidas por exclusão/separação de flutuação.
4. Alternativamente, compre microbolhas disponíveis comercialmente.

2. Preparação de animais

1. Aclimatar o animal (rato ou rato) por 3 dias após o parto. Os experimentos descritos aqui usaram ratos Sprague-Dawley (5-6 semanas de idade) ou ratos estruturais internos telencéceicos (tish) (colônia local).
2. Abrigar os animais sob uma luz de 12 horas: ciclo escuro de 12 horas.
3. Grave os pesos dos animais. Essas informações são importantes durante todo o procedimento.
4. Obtenha imagens de Mr ponderadas t2 no dia anterior ao procedimento de FUS, a fim de estabelecer imagens de linha de base pré-operatórias. Use os seguintes parâmetros para imagem T2: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] =3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão=29 x 45 mm², tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm.
5. Anestesiar o animal com isoflurane (4% de indução, 2% de manutenção). Confirme a profundidade adequada da anestesia usando uma pitada de dedo do dedo do sol. Aplique uma pomada oftálmica aos olhos.
6. Raspe o couro cabeludo do animal e remova o cabelo restante com creme depilatório.
7. Use um cateter de veias da cauda para a infusão de microbolhas, agente de contraste e QA. Os cateteres consistem em um comprimento de tubo PE10 equipado com uma agulha de 30 G x 1/2 polegada. Deixe uma seringa de 1 mL com soro fisiológico heparinizado na linha, para ser removida e recolocado quando a linha for usada para infusões.

3. Procedimentos de ressonância magnética e ping

1. Realize a ressonância magnética em uma unidade de 7 T MR com uma força gradiente de 600 mT/m/ms(Figura 1 e Figura 2). Realize aquisições de ressonância magnética utilizando uma bobina de superfície incorporada no sistema FUS.
   NOTA: O sistema de FUS utilizado para os experimentos compreende três partes: (i) o sistema de sônica é um pré-focalização compatível com MR, Matriz anular de 8 elementos, transdutor de 1,5 MHz (raio esférico = 20 mm ± 2 mm, diâmetro ativo = 25 mm (f-número = 0,8), com eficiência elétrica-acústica de 80%, que está conectada a um gerador de matriz em fases e amplificador de energia RF; (ii) um estágio de posicionamento motorizado compatível com MR para mover o transdutor na direção anterior-posterior e sentido medio-lateral; (iii) uma estação de trabalho Termoguide para controlar a entrega da sônicação, incluindo foco eletrônico através da modulação de fase para ajustar a profundidade focal(Figura 2).
2. Coloque o animal anestesiado no conjunto de trenó da bobina(Figura 1)do sistema fus compatível com MR na posição propensa. Imobilize o animal usando a barra incisiva e as barras de ouvido incorporadas no berço do trenó.
3. Aplique gel acústico no couro cabeludo molhado com água; garantindo que não existam bolhas, coloque a barreira da membrana da porção do circulador de água do conjunto do transdutor acima do crânio do animal, e baixe o conjunto do transdutor o mais longe possível em uma orientação planar paralela em relação à placa do crânio. Coloque o diafragma do transdutor firmemente contra o couro cabeludo raspado do animal diretamente sobre a placa do crânio.
4. Conecte um sensor pneumático ao corpo com fita cirúrgica, para monitorar a respiração. Posicione o sensor pneumático na caixa torácica inferior esquerda.
5. Mova o conjunto do braço de FUS com bobina, trenó e animal para a unidade de ressonância magnética 7T(Figura 1).
6. Execute uma sequência de batedores T2 para determinar a posição física geral do conjunto transdutor em relação à cabeça do animal, e faça ajustes mecânicos conforme necessário(Figura 2). Os parâmetros para imagem T2 são: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] = 3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão = 29 x 45 mm², tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm. A termometria normalmente não é usada neste protocolo.
7. Obtenha imagens T2 para refinar o posicionamento do transdutor. Precisamente, defina a localização do transdutor e especifique os pontos focais da sônica usando a função de segmentação do software. Os parâmetros para imagem T2 são: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] = 3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão = 29 x 45 mm², tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm.
8. Pouco antes da sônicação, injete 300 μL/kg de microbolhas¹⁴ através da veia traseira.
9. Use um transdutor de 1,5 MHz para produzir sônicas (pacote de onda de 30 ms, ciclo de 3% de imposto, frequência de repetição de rajadas de 1 Hz, duração/sônica de 240 s.
10. Imediatamente após a sônicação, injete o agente de contraste de gadodiamida através da veia da cauda e, em seguida, realize varreduras de contraste mais ponderadas em T1 para confirmar a abertura do BBB e a precisão do alvo. Os parâmetros para imagem ponderada T1: TR/TE = 900/12 milissegundos, 2 médias, campo de visão = 24 x 30 mm², tamanho da matriz = 208 x 256, espessura da fatia = 0,7 mm. Normalmente, uma única varredura T1 é realizada.
11. Retire o braço de FUS e o trenó da ressonância magnética e coloque o animal em uma almofada de aquecimento a 40 °C, mantendo 2% de anestesia isoflurane.
12. A partir de 30 minutos após a sônicação, use uma bomba de seringa para infundir QA (solução de estoque de 75 mg/mL) através da veia traseira por 1h a uma taxa de 16,8 μL/min para obter uma dosagem final de 225 mg/kg (q.s. a 1,0 mL salino).
13. Quando a infusão estiver completa, interrompa a anestesia, mantendo o animal em uma almofada de aquecimento até ficar alerta. Coloque o animal em uma gaiola e faça verificações de rotina para sua atividade a cada 15 minutos, por várias horas após o procedimento.
14. Devolva o animal ao vivarium e verifique a cada 6h para o primeiro dia por socorro ou atividade irregular.
15. Um dia após a sônica, realize imagens de Mr ponderadas t2 para avaliar quaisquer danos na área de sônicação. Os parâmetros para imagem T2: tempo de repetição/tempo de eco [TR/TE] = 3.000/138 milissegundos, 3 médias, campo de visão = 29 x 45 mm², tamanho da matriz = 125 x 192, espessura da fatia = 0,23 mm. As imagens são avaliadas para áreas de hiperintensidade para identificar possíveis danos/edema tecidual.

4. Análise post-mortem da perda neuronal

1. Permita uma pós-sônica, período de sobrevivência de 4 a 5 dias para avaliar a perda neuronal com histoquímica Fluoro-Jade.
2. Anestesiar profundamente o animal com isoflurano, e eutanásia via perfusão intracárdia com tampão fosfato de 0,1 M (pH 7,4) seguido de 4% de paraformaldeído no tampão fosfato.
3. Remova o cérebro do crânio e pós-correção por 2 dias em 4% de paraformaldeído.
4. Mergulhe o cérebro em 30% de sacarose para crioproteção, e corte seções a uma espessura de 20-30 μm com um criostat.
5. Monte seções criostatas em lâminas gelatinizadas e secas durante a noite.
6. Deslizamentos de reidratação em água destilada e, em seguida, desidratam em etanols de grau ascendente. Após a desidratação, a reidratação desliza em etanols de grau descendente.
7. Transfira slides para uma solução de 0,06% de permanganato de potássio por 15 minutos em um agitador orbital.
8. Enxágüe slides por 1 min em água destilada e transfira para uma solução de 0,001% de Fluoro-Jade B em ácido acético de 0,1%. Incubar sob agitação suave por 30 minutos em temperatura ambiente. Enxágüe lâminas três vezes por 1 min em água destilada.
9. Seque os slides em um aquecedor de slides, equilibre-se em xileno por 3 minutos e cubra usando mídia de montagem DPX.

Resultados

Esta seção descreve o efeito do PING em neurônios localizados em uma displasia neocortical. Displasias teciduais são uma característica comum no cérebro de pacientes com epilepsia resistente a medicamentos, e a remoção cirúrgica de displasias convulsivas-gênicas pode fornecer excelente controle das convulsões¹⁵. Definir o efeito do PING no tecido cerebral displásico é, portanto, uma prioridade importante. Um modelo de rato de displasia cortical genética, o rato tish, foi selecionado para estudar e...

Discussão

O método PING foi projetado para produzir lesões neuronais não invasivas e direcionadas. O método deriva de uma forte e crescente base de pesquisa no campo do ultrassom focado^3,4,,5,6,7. A capacidade de fornecer acesso focal a áreas específicas do cérebro parenchyma através da abertura transitória do BBB criou uma avenida para entregar uma grande variedade de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de ressonância magnética 7T-ClinScan	Bruker Biospin, Ettinglen, Alemanha		Gel acústico de aquisição de imagem de ressonância magnética
	Litho CLEAR	11-601 Gel de	transmissão acústica de alta viscosidade
DPX Montagem de meio de montagem	Microscopia eletrônica Ciências	13512	Resina Vidro de cobertura Mountant
Fluoro-Jade B	EDM Millipore	AG310	Mancha de alta afinidade para Neurônios Degenerados
Adsorventor Anestésico Fluovac	Harvard Apparatus	34-0388	Anestesia Orgânica Scavenger
Sistema FUS	Terapia Guiada por Imagem, Pessac, França	Sistema de Ultrassom Focado em Pequenos Animais Compatível	LabFUS
MR Gadodiamida	GE Healthcare AS, Oslo, Noruega	Omniscan	MR Agente de Contraste
Heparina	SAGENT	NDC2502140010	Anticoagulante
Agulha hipodérmica 30G x 1/2	Becton-Dickinson	26027	Cateterismo da veia da cauda
Seringa de insulina 28G1/2 (1ml)	EXEL	26027	Administração de injetáveis no cateter da veia da cauda
Atomizador de isofluorano	SurgiVet	VCT302	Administração de anestesia
Isoflurano	Henry Schein	NDC1169567762	Anestesia
KMnO4	Sigma	223468	Reagente usado em microbolhas de coloração de fluoro-jade B
	produzidas internamente: A. Klibanov	305106	de agente disruptor da barreira hematoencefálica
(fonte comercial)	Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA	Definity microbolhas	Monitoramento e monitoramento de agente disruptor da barreira hematoencefálica
Sistema de Gating	Instrumentos para Pequenos Animais	Modelo 1030	Monitoramento Respiratório
Multisizer 3 Contador de relhas	Beckman-Coulter, Hialeah, FL	Multisizer 3	Usado para determinar o tamanho médio das microbolhas
Optixcare EYE LUBE	CLC MEDICA, Ontário, Canadá	11611	Protetor de córnea-Eye Lube
PE10 tubulação	Becton-Dickinson	427401	Cateter de veia caudal Componente
Ácido Quinolínico	Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX	CAS 89-00-9	Neurotoxina
Ratos Sprague-Dawley	Taconic Biosciences	SD-M	Modelo de Rato
Bomba de Seringa	Carnegie Medicin	CMA 100	Entrega Controlada de Ácido Quinolínico
por Imagem do Software Thermoguide	, Pessac, França	Thermoguide	Aciona o Sistema FUS de Laboratório
Tish Rats	Colônia		Modelo de rato
Veet creme depilatório	Reckitt Benckiser		Remoção de pêlos do couro cabeludo

com Microbolhas Terapia Guiada interna