Os modelos de metástases ósseas não desenvolvem metástases uniformemente ou com 100% de incidência. A injeção direta intraóssea de células tumorais pode resultar em embolização do pulmão. Apresentamos nossa técnica de modelagem de tumores ósseos primários e metástases ósseas usando o implante de enxerto de tumor sólido no osso, levando a enxertia e crescimento reprodutíveis.
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Artigo de método
Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tumores ósseos primários ou metástases ósseas de tumores sólidos resultam em lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticas dolorosas. Essas lesões comprometem a estrutura óssea, aumentam o risco de fratura patológica e deixam os pacientes com opções limitadas de tratamento. Os tumores ósseos primários metastatizam para órgãos distantes, com alguns tipos capazes de se espalhar para outros sítios esqueléticos. No entanto, evidências recentes sugerem que, com muitos tumores sólidos, as células cancerosas que se espalharam para o osso podem ser a fonte primária de células que, em última análise, metastatizam para outros sistemas orgânicos. A maioria dos modelos singênicos ou xenoenxertos de tumores ósseos primários em camundongos envolve injeção intraóssea (ortotópica) de suspensões de células tumorais. Alguns modelos animais de metástase esquelética de tumores sólidos também dependem de injeção óssea direta, enquanto outros tentam recapitular etapas adicionais da cascata metastática óssea injetando células intravascularmente ou no órgão do tumor primário. No entanto, nenhum desses modelos desenvolve metástases ósseas de forma confiável ou com incidência de 100%. Além disso, a injeção intraóssea direta de células tumorais tem se mostrado associada a potencial embolização tumoral do pulmão. Essas células tumorais embólicas enxertam mas não recapitulam a cascata metastática. Relatamos um modelo de osteossarcoma em camundongo no qual fragmentos tumorais frescos ou criopreservados (consistindo de células tumorais mais estroma) são implantados diretamente na tíbia proximal usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Esses animais desenvolveram enxerto, crescimento e, ao longo do tempo, osteólise e metástase pulmonar. Esta técnica tem a versatilidade de ser usada para modelar metástases ósseas tumorais sólidas e pode prontamente empregar enxertos consistindo de um ou vários tipos celulares, células geneticamente modificadas, xenoenxertos derivados do paciente e/ou células marcadas que podem ser rastreadas por imagens ópticas ou avançadas. Demonstramos esta técnica, modelando tumores ósseos primários e metástases ósseas utilizando o implante de enxerto de tumor sólido no osso.
Introdução
Modelos de camundongos de doenças humanas e animais estão se tornando cada vez mais populares na pesquisa biomédica. A utilidade do uso de camundongos nesse contexto é que sua anatomia e fisiologia são muito semelhantes às dos seres humanos. Apresentam um período de gestação relativamente curto e um tempo na vida pós-natal para atingir a maturidade, e estão em grande parte associados a um custo relativamente baixo e à facilidade de moradia, embora os custos crescentes de desenvolvimento ou compra estejam associados a maiores graus de modificação genética, imunodeficiência e/ou humanização1. O uso de linhagens endogâmicas resulta em uma populaçã....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Cambridge, Cambridge, Reino Unido.
1. Preparação das linhagens celulares
- Cultivar linhagens celulares de acordo com os protocolos padrão de cultura de células do laboratório para cultura de células tradicionais ou injeção em camundongos. Os protocolos padrão utilizados aqui são o crescimento em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), L-glutamina e penicilina/estreptomicina (doravante conhecido como meio de crescimento completo).
NOTA: Neste experimento, as c....
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Resultados
Um resultado positivo estaria associado à enxertia tumoral e ao crescimento progressivo do tumor ao longo do tempo. Dependendo do tipo de tumor, o crescimento intraósseo do tumor pode estar associado à claudicação progressiva dos membros posteriores, mas muitos tumores não causam claudicação, apesar dos sinais de doença óssea associada. O sucesso do enxerto foi documentado com exames de imagem avançados, nos quais haveria alterações radiográficas progressivas, na μTC ou na μRM da tíbia proximal associadas ao fenótipo óss.......
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Discussão
Este relato documenta nosso modelo para criar tumores ósseos primários ou metástases ósseas após o implante intratibial de um aloenxerto tumoral. Acreditamos que existem várias etapas críticas nesse processo. Um plano anestésico seguro deve ser estabelecido tanto para a injeção subcutânea da suspensão de células tumorais quanto para a colocação intratibial dos fragmentos tumorais resultantes. Deve haver preparo estéril do sítio cirúrgico tanto para a retirada do aloenxerto subcutâneo quanto para a colocação intratibial d.......
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Divulgações
Dr. Hildreth foi financiado pelo NIH sob o número de prêmio K01OD026527. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos NIH.
Agradecimentos
Os autores agradecem a contribuição crítica da Dra. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP para o desenvolvimento desta técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #15 lâmina de bisturi | Henry Schein Ltd. | 75614 | Nenhum |
| Placas de cultura de tecidos de 6 poços | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Usado para picar pedaços de tumor. Também pode ser usado para cultura de células |
| Linha celular de osteossarcoma Abrams | Não aplicável | aplicável | Nenhum |
| Máquina de anestesia com vaporizador de isoflurano e tanque(s) de oxigênioVetEquip | 901805 | Nenhum | |
| Balança de pesagem de animais | Kent Scientific | SCL- 1015 | Nenhum |
| BALB/c rato nu (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 semanas de idade. Camundongos machos ou fêmeas |
| Cimento ósseo | Depuy Synthes | 160504 | Uso opcional em vez de cera óssea |
| Cera | Ethicon | W31G | Opcional |
| Buprenorfina | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0,3 mg/ml Solução injectável para cães e gatos |
| Estação de eutanásia de dióxido de carbono | N/A | N/A | Deve ser fornecido dentro da instalação animal |
| Incubadora de cultura celular ajustada a 37 &graus; C e 5% de dióxido de carbono | Heraeus | Vários | Nenhum |
| Clorexidina esfoliante cirúrgico | Vetoquinol | 411412 | Nenhum |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Opcional se criopreservar fragmentos tumorais |
| D-luciferina (Firefly), sal de potássio | Perkin Elmer | 122799 | Opcional se a linha celular de interesse tiver um gene repórter bioluminescente |
| Paquímetro digital | Mitutoyo | 500-181-30 | Pode ser manual |
| Gabinete de microrradiografia digital | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Opcional para avaliar a resposta óssea ao crescimento do tumor |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Opcional se criopreservar fragmentos tumorais |
| Dulbecco' s Águia modificada' s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Nenhum |
| Etanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | Nenhum |
| Soro fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Nenhum |
| Fórceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | Nenhum |
| Freezer (– 80 ° C) | Sanyo | MDF-794C | Opcional se criopreservando ou congelando fragmentos de tumor |
| Hemocitômetro | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Também pode usar contador de células automatizado, se disponível |
| Agulhas hipodérmicas (calibre 27) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | Também pode usar agulhas 25G (DIS55509) e 30G (Catálogo DIS599) |
| Gelo | N/A | N/A | Idealmente pedaços pequenos em um recipiente para armazenamento de seringas e suspensões de células |
| Tesoura de íris | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | Nenhum |
| Isoflurano | Henry Schein Ltd. | 1182098 | Nenhum |
| Sistema de imagem de bioluminescência/fluorescência IVIS Lumina III | Perkin Elmer | CLS136334 | Opcional se a linha celular de interesse tiver genes repórteres bioluminescentes ou fluorescentes |
| L-glutamina | Thermofisher scientifc | 25030081 | Nenhum |
| Nitrogênio líquido | British Oxygen Corporation | NA | Opcional se criopreservar ou congelar fragmentos de tumor |
| Dewar de nitrogênio líquido, 5 litros | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Opcional se criopreservar fragmentos de tumor |
| Matrigel® Matrix GFR, sem LDEV, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Opcional. Também disponível em tamanho de 10 ml (354230) |
| Microcentrífuga | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Células de pellets a 1200 rpm durante 5-6 minutos |
| Mr. Frosty congelador conteniner | Fisher Scientific | 10110051 | Opcional se criopreservar fragmentos de tumor |
| NAIR Loção/óleo removedor de pêlos | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Pode alternativamente usar um aparador elétrico com lâmina fina |
| Penicilina/estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | Nenhum |
| Cabo de bisturi, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | Preferência do usuário, desde que aceite lâmina de bisturi #15 |
| Almofada aquecida para animais pequenos | VetTech | HE006 | Nenhum |
| Estereomicroscópio | GT Vision Ltd. | H600BV1 | Nenhum |
| Solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use para injeções e também como parte da esfoliação cirúrgica, alternando com clorexidina |
| Adesivo tecidual (estéril) | 3M Corporation | 84-1469SB | Pode, alternativamente, usar sutura de pele não absorvível (tamanho 6-0) |
| Azul de tripano | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | Nenhum |
| Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use seringa de 0,05% a 0,25% |
| tuberculina (1 ml com gradações de 0,1 ml) | Becton Dickinson | 309659 | Ponta deslizante preferida aos |
| frascos de cultura de tecidos Luer Vented, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Também pode usar frascos menores ou maiores, conforme necessário |
Referências
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6
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Reimpressões e permissões
