Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Resumo

Os modelos de metástases ósseas não desenvolvem metástases uniformemente ou com 100% de incidência. A injeção direta intraóssea de células tumorais pode resultar em embolização do pulmão. Apresentamos nossa técnica de modelagem de tumores ósseos primários e metástases ósseas usando o implante de enxerto de tumor sólido no osso, levando a enxertia e crescimento reprodutíveis.

Resumo

Tumores ósseos primários ou metástases ósseas de tumores sólidos resultam em lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticas dolorosas. Essas lesões comprometem a estrutura óssea, aumentam o risco de fratura patológica e deixam os pacientes com opções limitadas de tratamento. Os tumores ósseos primários metastatizam para órgãos distantes, com alguns tipos capazes de se espalhar para outros sítios esqueléticos. No entanto, evidências recentes sugerem que, com muitos tumores sólidos, as células cancerosas que se espalharam para o osso podem ser a fonte primária de células que, em última análise, metastatizam para outros sistemas orgânicos. A maioria dos modelos singênicos ou xenoenxertos de tumores ósseos primários em camundongos envolve injeção intraóssea (ortotópica) de suspensões de células tumorais. Alguns modelos animais de metástase esquelética de tumores sólidos também dependem de injeção óssea direta, enquanto outros tentam recapitular etapas adicionais da cascata metastática óssea injetando células intravascularmente ou no órgão do tumor primário. No entanto, nenhum desses modelos desenvolve metástases ósseas de forma confiável ou com incidência de 100%. Além disso, a injeção intraóssea direta de células tumorais tem se mostrado associada a potencial embolização tumoral do pulmão. Essas células tumorais embólicas enxertam mas não recapitulam a cascata metastática. Relatamos um modelo de osteossarcoma em camundongo no qual fragmentos tumorais frescos ou criopreservados (consistindo de células tumorais mais estroma) são implantados diretamente na tíbia proximal usando uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Esses animais desenvolveram enxerto, crescimento e, ao longo do tempo, osteólise e metástase pulmonar. Esta técnica tem a versatilidade de ser usada para modelar metástases ósseas tumorais sólidas e pode prontamente empregar enxertos consistindo de um ou vários tipos celulares, células geneticamente modificadas, xenoenxertos derivados do paciente e/ou células marcadas que podem ser rastreadas por imagens ópticas ou avançadas. Demonstramos esta técnica, modelando tumores ósseos primários e metástases ósseas utilizando o implante de enxerto de tumor sólido no osso.

Introdução

Modelos de camundongos de doenças humanas e animais estão se tornando cada vez mais populares na pesquisa biomédica. A utilidade do uso de camundongos nesse contexto é que sua anatomia e fisiologia são muito semelhantes às dos seres humanos. Apresentam um período de gestação relativamente curto e um tempo na vida pós-natal para atingir a maturidade, e estão em grande parte associados a um custo relativamente baixo e à facilidade de moradia, embora os custos crescentes de desenvolvimento ou compra estejam associados a maiores graus de modificação genética, imunodeficiência e/ou humanização¹. O uso de linhagens endogâmicas resulta em uma população animal amplamente uniforme antes da inclusão no estudo. Um conhecimento completo de seu genoma sugere um alto grau de semelhança com os seres humanos. Alvos moleculares ortólogos para muitos processos de doenças foram identificados no genoma de camundongos e agora há uma extensa biblioteca de reagentes específicos de camundongos que são facilmente obtidos. Portanto, eles fornecem a oportunidade de análises de rendimento relativamente alto de maneira mais rápida e menos dispendiosa quando comparados a modelos animais maiores¹. Além disso, com o advento de estratégias de edição genética que permitem a superexpressão ou deleção de certos genes, seja globalmente ou de maneira específica do tipo celular e/ou constitutivamente ou de forma induzível, elas representam um sistema modelo biologicamente muito útil para a investigação de doenças humanas e^animais2.

O câncer é um campo em que os modelos de camundongos têm grande utilidade. Modelos genéticos de câncer em camundongos dependem da modulação da expressão de oncogenes ou genes supressores de tumor, isoladamente ou em combinação, para que as células sofram transformação oncogênica. A injeção de linhagens de células tumorais primárias ou estabelecidas em camundongos também é realizada. A introdução de linhagens celulares ou tecidos de humanos ou outras espécies animais, incluindo camundongos, continua sendo o modelo mais amplamente utilizado de câncer in vivo. O uso de células e tecidos de espécies diferentes (xenoenxertos) em camundongos imunocomprometidos é mais comumente realizado². No entanto, o uso de células ou tecidos tumorais aloenxertos onde tanto o hospedeiro quanto o receptor são da mesma espécie permite a interação com um sistema imune intacto quando combinado com a mesma linhagem hospedeira em sistemas singênicos³.

Tumores ósseos primários ou metástases ósseas de tumores sólidos resultam em lesões osteolíticas, osteoblásticas ou mistas osteolíticas/osteoblásticas^dolorosas3,4. Esses tumores comprometem a estrutura óssea, aumentando o risco de fratura patológica, e deixam os pacientes com opções limitadas de tratamento. Os tumores ósseos primários metastatizam para órgãos distantes, com alguns tipos capazes de se espalhar para outros sítios esqueléticos. Em pacientes com câncer de mama, o osso é o sítio mais comum da primeira metástase e o primeiro local mais frequente de apresentação da doença^{metastática5,6}. Além disso, células tumorais disseminadas (CDTs) estão presentes na medula óssea antes do diagnóstico e predizem o desenvolvimento de metástases em outros^órgãos7. Portanto, acredita-se que as células cancerosas presentes no osso são a fonte de células que, em última análise, metastatizam para outros sistemas orgânicos. Existem muitos modelos murinos de metástases tumorais sólidas que desenvolvem metástases predominantemente pulmonares e linfonodais e, dependendo do tipo de tumor e da técnica de injeção, potencialmente de outros sistemas^orgânicos3. No entanto, faltam modelos de metástase óssea em camundongos que produzam metástases esqueléticas sítio-específicas de forma confiável e reprodutível e desenvolvam metástases ósseas antes que os camundongos atinjam critérios de remoção precoce da carga tumoral primária ou metástase para outros órgãos. Relatamos um modelo de osteossarcoma de tumor ósseo primário que se baseia no implante cirúrgico de um aloenxerto de tumor sólido na tíbia proximal de^camundongos8. Tumores ósseos se formaram em 100% dos camundongos e 88% desenvolveram metástase pulmonar. Essa incidência de metástase excede o que é comumente relatado clinicamente em pessoas (~20-50%), mas é de grande interesse, uma vez que o pulmão é o sítio mais comum de metástase para osteossarcoma9,10,11. Embora esse modelo seja vantajoso na modelagem de tumores ósseos primários, ele também tem grande utilidade na modelagem de metástases ósseas de outros tumores sólidos osteotrópicos, como mama, pulmão, próstata, tireoide, hepatic, renal e gastrointestinal.

A justificativa para o desenvolvimento desse modelo foi desenvolver uma alternativa à tradicional injeção intraóssea tipicamente na tíbia proximal ou fêmur distal para modelar tumores ósseos primários ou metástases^ósseas12. Nosso objetivo primário foi aliviar uma conhecida limitação dessa técnica, a embolização tumoral do pulmão. Isso resulta no enxerto dessas células tumorais embólicas e "metástases artefatuais" que não recapitulam a cascata metastática completa de um tumor ósseo primário estabelecido que metastatiza para os pulmões ^8,13. Esta também seria a situação em que uma metástase óssea estabelecida se espalha para um local distante. Além disso, essa técnica também foi desenvolvida para produzir um modelo de metástase óssea que garantisse maior incidência de enxertia e crescimento de tumores no osso e em local uniforme quando comparada com técnicas de injeção ortotópica ou intravascular. Este modelo apresenta vantagens distintas sobre essas técnicas descritas. Este modelo envolve a entrega controlada e consistente de células tumorais no osso. Também evita metástases pulmonares artefatuais após embolização pulmonar e estabelece uma população basal uniforme do estudo. Há o benefício de tumores sítio-específicos com esse modelo, sem o risco de critérios de remoção precoce resultantes de tumores primários ou metástases para outros órgãos. Por fim, esse modelo tem grande utilidade para modificação, incluindo o uso de xenoenxertos derivados do paciente.

O modelo apresentado tem semelhanças com a injeção direta da suspensão celular no osso após uma abordagem cirúrgica seguida de injeção através do córtex ou entrega na cavidade medular após a confecção de um pequeno defeito no córtex (com ou sem fresagem da cavidade medular)8,14,15,16,17 . No entanto, o implante de um aloenxerto tumoral torna esta técnica distinta. Portanto, o objetivo deste relato foi demonstrar este modelo de tumores ósseos primários e metástases ósseas de tumores sólidos, o que supera muitas limitações dos modelos descritos anteriormente. Grupos de pesquisa com experiência em cultura de células, modelos de camundongos, anestesia e cirurgia em camundongos e anatomia de camundongos estão bem equipados para reproduzir nossa técnica para modelar tumores ósseos primários ou metástases ósseas em camundongos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Cambridge, Cambridge, Reino Unido.

1. Preparação das linhagens celulares

1. Cultivar linhagens celulares de acordo com os protocolos padrão de cultura de células do laboratório para cultura de células tradicionais ou injeção em camundongos. Os protocolos padrão utilizados aqui são o crescimento em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), L-glutamina e penicilina/estreptomicina (doravante conhecido como meio de crescimento completo).
   NOTA: Neste experimento, as células de osteossarcoma de Abrams são usadas em camundongos Balb/c Foxn1 nu/nu . Para estudos de câncer de mama, são usadas células 4T1 em camundongos Balb/c e células EO771 em camundongos C57BL/6.
2. Cultivar células em frascos ventilados para cultura de tecidos ou placas de cultura de tecidos de 6 poços a 37 °C em 5% de CO₂.
3. Passe pela linhagem celular de interesse e prepare as células para injeção quando as células atingirem uma confluência comumente usada com a injeção dessas células em camundongos.

2. Animais

1. Use camundongos Balb/c Foxn1 nu/nu com pelo menos 6-8 semanas de idade para geração de tumor subcutâneo para garantir que os animais estejam além da fase de crescimento rápido e tenham atingido a idade adulta e a maturidade esquelética.
2. Use camundongos machos ou fêmeas. Faça exceções ao selecionar linhagens celulares responsivas a hormônios (por exemplo, células de câncer de mama em camundongos fêmeas e células de câncer de próstata em camundongos machos).
3. Para experimentos de xenoenxerto, use camundongos imunodeficientes atímicos nus com base no fato de a linhagem celular ser incompatível com um sistema imunológico de camundongo intacto em condições normais.
4. Para experimentos de aloenxerto usando linhagens celulares murinas, isso também é recomendado com base em origens genéticas e imunológicas de camundongos diferentes. No entanto, para experimentos singênicos, utilizar animais da mesma linhagem celular de interesse.
5. Animais domésticos em densidades padrão, dependendo das políticas de criação da instituição.

3. Tumores subcutâneos

1. Colher linhagens celulares de cultura por tripsinização e ressuspender em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
2. Avaliar a viabilidade celular e determinar a densidade celular pelo método de exclusão do azul de tripano. Use um hemocitômetro ou um contador de células automatizado para contar as células. Uma viabilidade celular mínima de 90% deve ser usada para injeção em camundongos para criar tumores subcutâneos.
3. Ajustar a densidade celular para injetar 1-2 x 10⁵ células em um volume final de 0,1 a 0,15 mL (100 a 150 μL) de PBS estéril. Mantenha as células no gelo até a injeção.
4. Alternativamente, células de pellet por centrifugação a 800 x g por 5 min. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em meio matricial de membrana basal estéril não diluído para obter 1-2 x 10⁵ células em um volume final de 0,1 a 0,15 mL (100 a 150 μL). Mantenha as células no gelo até o uso posterior.
5. Anestesiar camundongos para crescimento tumoral subcutâneo com isoflurano em oxianestesia. Utilizar uma dose de indução de isoflurano a 5% em 2 L/min de oxigênio e uma dose de manutenção de 2-3% de isoflurano em 2 L/min de oxigênio. Verifique a falta de reflexos de piscar ou pedal antes de prosseguir.
   NOTA: O isoflurano é um anestésico inalatório. Utilizar isoflurano em área bem ventilada com sistemas apropriados de sequestro e coleta livre de gases. Consulte a equipe veterinária institucional para desenvolver um plano de indução, manutenção e monitoramento da anestesia e garantir que a equipe do laboratório tenha treinamento adequado em monitoramento anestésico e manuseio de agentes anestésicos inalatórios.
6. Remova os pelos da região dorsal do tórax ou abdome de camundongos anestesiados com solução depilante ou com um cortador elétrico. A solução depilatória é preferida para minimizar possíveis traumas na pele. Pule esta etapa se estiver usando mouses athymic nude.
7. Limpar a área preparada com um cotonete de etanol a 70% antes da injeção da suspensão celular.
8. Use uma seringa de 1 mL de tuberculina com uma agulha 27 G para injetar células por via subcutânea sobre a região dorsal do tórax ou abdômen, para não ser impactado pelo movimento das omoplatas. Alternativamente, injetar as células por via subcutânea como suspensão em matriz extracelular comercialmente disponível.
   NOTA: A injeção em matriz extracelular comercialmente disponível limitará a migração da suspensão celular no espaço subcutâneo, pois essas matrizes se solidificam à temperatura ambiente.
9. Recupere os ratos em uma almofada de aquecimento em gaiolas individuais até o deambulatório. Os ratos podem então ser colocados em suas gaiolas normais com roupas de cama limpas e secas.
10. Monitorar o tamanho do tumor subcutâneo que recobre o tórax dorsal ou abdome com um paquímetro e medir o peso corporal semanalmente para garantir que os tumores subcutâneos não ulcerem ou que os camundongos atendam aos critérios de remoção precoce, conforme estabelecido pelo comitê de cuidados e uso de animais da instituição. Um tamanho máximo do tumor de 15 mm em qualquer dimensão é recomendado para reduzir o risco de ulceração da pele ou necrose tumoral central.
    NOTA: Consulte as diretrizes locais para determinar o tamanho/volume máximo permitido do tumor.
11. Eutanasiar camundongos portadores de tumores subcutâneos após três a quatro semanas por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical. Siga as políticas aceitáveis da instituição para a eutanásia de ratos.
12. Colher tumores subcutâneos utilizando técnica cirúrgica asséptica. Esterilizar a pele que recobre o tumor como antes com etanol 70% após a remoção dos pelos (se aplicável). Incise através da pele que recobre o tumor com uma lâmina de bisturi #15 (com ou sem cabo de lâmina de bisturi). Dissecar nitidamente o tumor dos tecidos moles adjacentes circundantes com uma tesoura cirúrgica estéril.
13. Coloque o tumor em placas de cultura de tecidos de 6 poços contendo meio de crescimento completo e pice em vários pequenos fragmentos de tamanho pré-determinado (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm³ até 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm³) com uma lâmina de bisturi #15 (com ou sem cabo de lâmina de bisturi).
14. Manter os fragmentos tumorais em meio de crescimento estéril completo à temperatura ambiente até o momento do implante intratibial. Para linhagens celulares que carregam luciferase ou genes fluorescentes repórteres, use imagens bioluminescentes ou fluorescentes ex-vivo para confirmar a viabilidade tumoral antes da implantação intratibial em camundongos.
15. Para criopreservação, colocar vários fragmentos no mesmo criovial em meio de cultura completo suplementado com 20% de SFB e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar gradualmente usando um sistema de criopreservação comercial a –80 °C e armazenar a longo prazo em nitrogênio líquido. Preservar fragmentos tumorais para análise posterior, mas não para implantação futura, por congelamento instantâneo usando imersão em nitrogênio líquido. Armazenar esses fragmentos de tumor congelados por longo prazo a –80 °C.
    NOTA: Foi relatado anteriormente que os tumores congelados não enxertam e crescem in vivo⁸.

4. Implante cirúrgico de fragmentos tumorais subcutâneos

1. Levar fragmentos frescos ou criopreservados de tumor subcutâneo à temperatura ambiente em meio de crescimento completo antes do implante cirúrgico.
2. Anestesiar camundongos da cepa de interesse usando isoflurano em anestesia com oxigênio, conforme descrito na Seção 3. Verifique a falta de reflexos do pedal antes de prosseguir. Administrar buprenorfina subcutânea na dose de 0,02-0,05 mg/kg para proporcionar analgesia perioperatória. Isso pode ser repetido a cada 6-8 h no período pós-operatório, se necessário.
3. Remover os pelos da articulação do joelho direito e da tíbia proximal do membro posterior com solução depilante para minimizar o potencial trauma na pele.
4. Esfregue a área preparada com antisséptico cirúrgico. Esfregue primeiro com um cotonete de etanol a 70% e, em seguida, esfregue com clorexidina alternada e esfoliação salina.
5. Visualize a tíbia proximal como a região distal à articulação do joelho enquanto flexiona e estende a articulação.
6. Criar uma incisão de 3-4 mm ao nível da tíbia proximal na face medial do membro com uma lâmina de bisturi #15 (com ou sem cabo de lâmina de bisturi). Incisar através da pele e tecido subcutâneo para expor o córtex medial da tíbia proximal.
7. Aplique uma pressão suave com a ponta de uma agulha de 25 G, enquanto também gira a ponta, para criar um pequeno orifício no córtex medial da tíbia proximal. Faça esse orifício aproximadamente 2 mm distal à articulação do joelho em um ponto equidistante entre os córtex tibial cranial e caudal. Selecione o tamanho da agulha dependendo do tamanho dos fragmentos tumorais.
8. Use pinça estéril para captar e inserir os fragmentos tumorais na cavidade medular da tíbia proximal. Utilizar agulha de 27 a 30 G para manipular o fragmento tumoral para o canal medular. Dependendo do tamanho dos fragmentos tumorais, implantar um mínimo de 0,5 mm³ de volume total do tumor em cada tíbia. Isso pode exigir a implantação de 1 ou mais fragmentos tumorais, dependendo do tamanho dos fragmentos tumorais criados.
   NOTA: Modificações para evitar ou limitar o deslocamento do enxerto para fora do osso seriam a colocação de cera ou cimento ósseo no defeito ósseo ou espuma de gel ou um enxerto de gordura subcutâneo sobre o orifício no osso.
9. Aplicar as bordas da pele com adesivo de tecido líquido estéril ou sutura de pele única. Não use clipes de feridas neste site. Tome cuidado ao usar imagens de fluorescência no período pós-operatório, uma vez que tanto os adesivos teciduais quanto a sutura têm o potencial de fluorescer.
10. Recupere os ratos em uma almofada de aquecimento em gaiolas individuais até o deambulatório.

5. Avaliação seriada e de ponto final

1. Anestesiar camundongos usando isoflurano em oxigenoanestesia conforme descrito anteriormente.
2. Avaliar o crescimento do tumor tibial de forma não invasiva por radiografia digital semanal, bioluminescência ou imagem de fluorescência (se usar células expressando luciferase ou um gene repórter fluorescente). Medidas de paquímetro do membro no local de implantação também podem ser realizadas em camundongos acordados.
3. Além do monitoramento tradicional de camundongos portadores de tumor (peso corporal, nível de atividade, frequência respiratória, tosa, postura, mentação e comportamento), monitore os camundongos semanalmente em busca de sinais de claudicação dos membros posteriores, inchaço e infecção do sítio cirúrgico.
4. Monitore a ferida cirúrgica da pele nos primeiros 10-14 dias quanto a vermelhidão excessiva, inchaço, drenagem e deiscência da ferida até que a ferida cutânea esteja cicatrizada. Após 4-5 semanas, avaliar camundongos de acordo com a avaliação do resultado do estudo vivos ou após eutanásia.

Resultados

Um resultado positivo estaria associado à enxertia tumoral e ao crescimento progressivo do tumor ao longo do tempo. Dependendo do tipo de tumor, o crescimento intraósseo do tumor pode estar associado à claudicação progressiva dos membros posteriores, mas muitos tumores não causam claudicação, apesar dos sinais de doença óssea associada. O sucesso do enxerto foi documentado com exames de imagem avançados, nos quais haveria alterações radiográficas progressivas, na μTC ou na μRM da tíbia proximal associadas ao fenótipo óss...

Discussão

Este relato documenta nosso modelo para criar tumores ósseos primários ou metástases ósseas após o implante intratibial de um aloenxerto tumoral. Acreditamos que existem várias etapas críticas nesse processo. Um plano anestésico seguro deve ser estabelecido tanto para a injeção subcutânea da suspensão de células tumorais quanto para a colocação intratibial dos fragmentos tumorais resultantes. Deve haver preparo estéril do sítio cirúrgico tanto para a retirada do aloenxerto subcutâneo quanto para a colocação intratibial d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#15 lâmina de bisturi	Henry Schein Ltd.	75614	Nenhum
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	Thermo Fisher Scientific	10578911	Usado para picar pedaços de tumor. Também pode ser usado para cultura de células
Linha celular de osteossarcoma Abrams	Não aplicável	aplicável	Nenhum
Máquina de anestesia com vaporizador de isoflurano e tanque(s) de oxigênioVetEquip		901805	Nenhum
Balança de pesagem de animais	Kent Scientific	SCL- 1015	Nenhum
BALB/c rato nu (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 semanas de idade. Camundongos machos ou fêmeas
Cimento ósseo	Depuy Synthes	160504	Uso opcional em vez de cera óssea
Cera	Ethicon	W31G	Opcional
Buprenorfina	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0,3 mg/ml Solução injectável para cães e gatos
Estação de eutanásia de dióxido de carbono	N/A	N/A	Deve ser fornecido dentro da instalação animal
Incubadora de cultura celular ajustada a 37 &graus; C e 5% de dióxido de carbono	Heraeus	Vários	Nenhum
Clorexidina esfoliante cirúrgico	Vetoquinol	411412	Nenhum
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Opcional se criopreservar fragmentos tumorais
D-luciferina (Firefly), sal de potássio	Perkin Elmer	122799	Opcional se a linha celular de interesse tiver um gene repórter bioluminescente
Paquímetro digital	Mitutoyo	500-181-30	Pode ser manual
Gabinete de microrradiografia digital	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Opcional para avaliar a resposta óssea ao crescimento do tumor
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Opcional se criopreservar fragmentos tumorais
Dulbecco' s Águia modificada' s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Nenhum
Etanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	Nenhum
Soro fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	26140079	Nenhum
Fórceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	Nenhum
Freezer (– 80 ° C)	Sanyo	MDF-794C	Opcional se criopreservando ou congelando fragmentos de tumor
Hemocitômetro	Thermo Fisher Scientific	11704939	Também pode usar contador de células automatizado, se disponível
Agulhas hipodérmicas (calibre 27)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	Também pode usar agulhas 25G (DIS55509) e 30G (Catálogo DIS599)
Gelo	N/A	N/A	Idealmente pedaços pequenos em um recipiente para armazenamento de seringas e suspensões de células
Tesoura de íris	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	Nenhum
Isoflurano	Henry Schein Ltd.	1182098	Nenhum
Sistema de imagem de bioluminescência/fluorescência IVIS Lumina III	Perkin Elmer	CLS136334	Opcional se a linha celular de interesse tiver genes repórteres bioluminescentes ou fluorescentes
L-glutamina	Thermofisher scientifc	25030081	Nenhum
Nitrogênio líquido	British Oxygen Corporation	NA	Opcional se criopreservar ou congelar fragmentos de tumor
Dewar de nitrogênio líquido, 5 litros	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Opcional se criopreservar fragmentos de tumor
Matrigel® Matrix GFR, sem LDEV, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Opcional. Também disponível em tamanho de 10 ml (354230)
Microcentrífuga	Thermo Fisher Scientific	75002549	Células de pellets a 1200 rpm durante 5-6 minutos
Mr. Frosty congelador conteniner	Fisher Scientific	10110051	Opcional se criopreservar fragmentos de tumor
NAIR Loção/óleo removedor de pêlos	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Pode alternativamente usar um aparador elétrico com lâmina fina
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	Nenhum
Cabo de bisturi, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	Preferência do usuário, desde que aceite lâmina de bisturi #15
Almofada aquecida para animais pequenos	VetTech	HE006	Nenhum
Estereomicroscópio	GT Vision Ltd.	H600BV1	Nenhum
Solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use para injeções e também como parte da esfoliação cirúrgica, alternando com clorexidina
Adesivo tecidual (estéril)	3M Corporation	84-1469SB	Pode, alternativamente, usar sutura de pele não absorvível (tamanho 6-0)
Azul de tripano	Thermo Fisher Scientific	5250061	Nenhum
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use seringa de 0,05% a 0,25%
tuberculina (1 ml com gradações de 0,1 ml)	Becton Dickinson	309659	Ponta deslizante preferida aos
frascos de cultura de tecidos Luer Vented, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Também pode usar frascos menores ou maiores, conforme necessário