Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Summary

Descrito aqui é um protocolo que permite a quantificação colorimétrica da quantidade de alimentos comidos dentro de um intervalo definido de tempo por larvas de melanogaster Drosophila expostas a dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Esses ensaios são conduzidos no contexto de uma tela termogenética neuronal.

Abstract

Comportamentos de forrageamento e alimentação permitem que os animais acessem fontes de energia e nutrientes essenciais para seu desenvolvimento, saúde e condicionamento físico. Investigar a regulação neuronal desses comportamentos é essencial para a compreensão dos mecanismos fisiológicos e moleculares subjacentes à homeostase nutricional. O uso de modelos animais geneticamente tratáveis, como vermes, moscas e peixes, facilita muito esses tipos de estudos. Na última década, a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster tem sido usada como um poderoso modelo animal por neurobiólogos que investigam o controle neuronal dos comportamentos de alimentação e forrageamento. Embora sem dúvida valioso, a maioria dos estudos examina moscas adultas. Aqui, descrevemos um protocolo que se aproveita do sistema nervoso larval mais simples para investigar substratos neuronais que controlam comportamentos alimentares quando larvas são expostas a dietas diferentes em seu teor de proteínas e carboidratos. Nossos métodos são baseados em um ensaio de alimentação colorimétrico quantitativo, realizado no contexto de uma tela de ativação termogenética neuronal. Como leitura, a quantidade de alimentos comidos por larvas durante um intervalo de 1h foi usada quando exposta a uma das três dietas rotuladas por corantes que diferem em suas proporções de proteína para carboidratos (P:C). A eficácia deste protocolo é demonstrada no contexto de uma tela neurogenética na Drosophilalarval, identificando populações neuronais candidatas que regulam a quantidade de alimentos consumidos em dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Também conseguimos classificar e agrupar os genótipos testados em classes fenotípicas. Além de uma breve revisão dos métodos atualmente disponíveis na literatura, são discutidas as vantagens e limitações desses métodos e, também, algumas sugestões são fornecidas sobre como esse protocolo pode ser adaptado a outros experimentos específicos.

Introduction

Todos os animais dependem de uma dieta equilibrada para adquirir as quantidades necessárias de nutrientes para sobrevivência, crescimento e reprodução¹. A escolha do que e do quanto comer é influenciada por uma infinidade de fatores de interação relacionados ao estado interno do animal, como o nível de saciedade, e condições ambientais, como a qualidade dos alimentos^2,3,4,5. Proteínas e carboidratos são dois grandes macronutrientes e sua ingestão equilibrada é essencial para sustentar os processos fisiológicos dos animais. Portanto, a compreensão dos mecanismos neurais que controlam os comportamentos alimentares e sustentam uma ingestão equilibrada desses macronutrientes é extremamente relevante. Isso ocorre porque traços da história da vida como vida útil, fecundidade e saúde metabólica são diretamente afetados pelos^níveisde ingestão de proteínas 6^,7,8,9,10.

O uso de organismos mais simples e tratáveis que exibem hábitos alimentares evolutivamente conservados com animais complexos, incluindo mamíferos, é essencial para esse tipo de estudo. É importante ressaltar que esses modelos animais mais simples proporcionam uma boa oportunidade para dissecar questões biológicas complexas em um contexto caro, ético e tecnicamente mais eficaz. Nas últimas décadas, a Drosophila, com seu poderoso kit de ferramentas genéticas, comportamento intrincado e estereotipado e arquitetura conservada de mecanismos periféricos e sensoriais de nutrientes com mamíferos, tem sido um modelo frutífero para neurobiólogos comportamentais¹¹. Em última análise, a esperança é que, ao entender como a ingestão de alimentos é regulada neste animal, com um sistema nervoso mais simples, podemos então começar a desembaraçar os defeitos neuronais subjacentes aos distúrbios alimentares humanos.

O estudo de substratos neuronais para comportamentos alimentares depende profundamente de ser capaz de medir simultaneamente a ingestão alimentar dos animais enquanto manipula sua atividade neuronal. Devido às quantidades mínimas de alimentos ingeridos, quantificar a quantidade de alimentos comidos por moscas é extremamente desafiador, e todos os métodos atualmente disponíveis apresentam limitações significativas. Assim, o padrão-ouro é utilizar uma combinação de metodologias complementares¹². Moscas adultas têm sido historicamente favorecidas como um modelo genético e comportamental. No entanto, as larvas de Drosophila também oferecem oportunidades para investigar substratos neuronais codificando o comportamento alimentar. O sistema nervoso central larval (SNC), com cerca de 12.000 neurônios, é significativamente menos complexo que o do adulto, que contém aproximadamente 150.000 neurônios. Essa menor complexidade não é apenas numérica, mas também funcional, uma vez que os comportamentos larvais dependem de funções locomotivas mais simples e sistemas sensoriais. Apesar da aparente simplicidade de seus sistemas nervosos, as larvas ainda apresentam comportamentos alimentares completos, e alguns métodos para quantificar a ingestão de alimentos em larvas de Drosophila foram descritos^5,13,14,15. Ao emparelhar-se com manipulações da atividade neuronal, as larvas de Drosophila podem constituir um modelo altamente tratável para entender a regulação neural da ingestão alimentar.

Prevê-se aqui um protocolo detalhado para quantificar a ingestão de alimentos em larvas expostas a dietas de diferentes qualidades de macronutrientes. As dietas, as chamadas dietas de equilíbrio macronutrientes, diferem nos teores de proteínas e carboidratos, especificamente no que diz respeito às relações proteína-carboidrato (P:C): 1:1 (dieta rica em proteínas), 1:4 (dieta intermediária) e 1:16 (dieta pobre em proteínas), como mostra a Figura 1A. Resumidamente, um ensaio quantitativo de alimentação sem escolha foi estabelecido usando essas três dietas isocalóricas à base de sacarose (SY) tingidas com um corante alimentar azul. Como o extrato de levedura e a sacarose foram utilizados como fontes de proteína e carboidratos, e ambos contêm carboidratos, a variação nas relações P:C foi obtida pela alteração do equilíbrio desses dois componentes, conforme descrito anteriormente¹⁶ e como indicado na Figura 1B. Uma visão geral esquemática do protocolo, mostrando as principais etapas experimentais, está disponível na Figura 2.

Este protocolo foi estabelecido com o objetivo de investigar o papel de populações neuronais específicas na regulação dos níveis de alimentação larval em dietas de diferentes relações P:C e no contexto de uma tela neuronal termogenética. Uma ferramenta neurogenética bem caracterizada foi utilizada a partir da família Transitório Receptor Potential (TRP): Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), que é um canal de cáção fechado de temperatura e tensão, permitindo o disparo de potenciais de ação quando as temperaturas ambientes sobem acima de 25 °C¹⁷. Para expressar o transgene dTRPA1, aproveitamos as linhas Gal4 baseadas em regiões cis-regulatórias do genoma Drosophila, estabelecidas no laboratório Rubin, no contexto do projeto FlyLight no Janelia Research Campus^18,19.

Embora o protocolo, aqui descrito, tenha sido estabelecido no contexto de uma tela de ativação, ele pode ser facilmente adaptado pelo experimentador para outras necessidades ou interesses específicos, ou seja, realizar uma tela de supressão usando o silenciador neuronal sensível à temperatura ShibireTS^20,em alternativa ao dTRPA1. Esta e outras adaptações são discutidas nas seções de protocolo e discussão.

Protocol

1. Preparação das dietas de sacarose-levedura (SY)

1. Pesar todos os ingredientes secos (ágar, levedura, sacarose) para o balanceamento de macronutrientes e dietas de criação L3. As quantidades em gramas para cada um dos ingredientes necessários para preparar 1 L de alimentos são indicadas na Figura 1B.
   NOTA: Leve em conta que aproximadamente 13 mL de alimentos são necessários para encher uma placa de Petri de 60 mm.
2. Dissolva todos os ingredientes em água destilada estéril (use aproximadamente 50% do volume total de água necessário para preparar o alimento) e mexa o meio por 5-10 min.
3. Autoclave por 50 min.
4. Depois de permitir que os médiuns esfriem, adicione soluções de nipagina e ácido propiônico às dietas, em uma concentração final (v/v) de 3% e 0,3%, respectivamente. Às dietas de equilíbrio de macronutrientes, adicione corante alimentar azul a uma concentração final (v/v) de 1%. Complete os volumes totais com água destilada.
5. Despeje cuidadosamente as dietas alimentares para pratos petri de 60 mm, de modo que a quantidade de alimentos derramados seja aproximadamente a mesma em cada um dos pratos. Rotule as placas com as proporções P:C das dietas.
   NOTA: Prepare as dietas de equilíbrio de macronutrientes no dia do ensaio alimentar. Se não for possível, armazene as dietas preparadas a 4 °C, em recipiente selado, durante uma duração máxima de 3 dias. Períodos de armazenamento mais longos tornam a dieta muito seca e dura, e as larvas não podem penetrar no meio.

2. Cruz genética das linhas parentais

NOTA: Use o sistema Gal4/UAS²¹ para configurar as cruzes genéticas. Neste protocolo, a fim de ativar a função neuronal em populações neuronais específicas, foram utilizadas virgens femininas da linha¹⁷ da UAS dTRPA1 e cruzadas para machos das linhas Janelia Gal4(Figura 2A). O controle genético utilizado foi a prole de um cruzamento entre a linha dTRPA1 e uma linha "GAL4 vazia", que carrega Gal4 no vetor usado para gerar a coleção Rubin Gal4, mas sem fragmento regulatório presente (attP2)²². Para promover a supressão neuronal, uma linha UAS codificando ShibireTS²⁰ pode ser usada, em vez de dTRPA1.

1. Configure gaiolas de coleta de embriões de 60 mm com placas diet de criação L3, suplementadas com alguma pasta ativa de levedura.
2. Transfira as fêmeas UAS dTRPA1 adultas e janelia gal4 machos, com idade entre 5 e 8 dias, para as gaiolas de coleta de embriões e permita que o acasalamento ocorra por 24-48 h, a 25 °C, com 60% de umidade e um ciclo claro-escuro 12:12(Figura 2A). Para gaiolas de coleta de embriões de 60 mm, utilize cerca de 100 fêmeas virgens e 30 machos por cruz.
3. No final do período de acasalamento, remova e descarte as placas diet de criação L3 utilizadas nas cruzes genéticas. Substitua-os por placas de dieta de criação L3 frescas, a fim de realizar os deitar os ovos e o estadiamento larval.

3. Preparação de larvas de terceira instar (L3)

1. Transfira as moscas adultas acasaladas para placas de dieta de criação L3 frescas e permita que a colocação de ovos ocorra por 3-4 h, a 25 °C(Figura 2B). Certifique-se de que todas as placas estão rotuladas com o genótipo, proporção P:C da dieta e data do ovo.
   NOTA: Para economizar tempo, realize a colocação de ovos diretamente na dieta de criação L3, que evita o manuseio extra dos ovos. No caso de triagens genéticas de pequena escala, a otimização da colocação de ovos pode ser obtida usando placas de ágar de suco de maçã.
2. No final do período de colocação do ovo, remova as placas das gaiolas e cubra-as com tampas plásticas. Caso o extrato de levedura seja usado para complementar as placas de criação L3, certifique-se de remover toda a levedura residual na extremidade da colocação do ovo. Isso é importante para evitar a alimentação não uniforme durante o crescimento larval.
   NOTA: Os adultos acasalados podem ser transferidos para placas de dieta de criação L3 frescas, para que mais to lays de ovos sejam realizados, e mais larvas experimentais podem ser obtidas. Os trabalhos consecutivos podem ser realizados com os mesmos adultos durante uma semana inteira de trabalho.
3. Estime o número de ovos por placa e mantenha a densidade larval no máximo 200 embriões por placa. Esta estimativa pode ser feita contando o número de embriões em um quarto da placa.
   NOTA: Uma placa superlotada atrasará o desenvolvimento larval e afetará os comportamentos de alimentação larval.
4. Incubar as placas de criação L3 a 18 °C (temperatura permissiva), 60% de umidade e um ciclo claro-escuro de 12:12, e permitir que as larvas cresçam por 9 dias(Figura 2B).
5. No nono dia após a colocação do ovo (AEL), coletar três grupos de 10 L3 de cada um dos genótipos (e para as réplicas) a serem testados. Além disso, colete grupos de 10 L3 para o controle de "alimentos de corante zero". Certifique-se de que a coleta de larvas seja feita durante períodos de tempo equivalentes do dia utilizados para fazer a colocação do ovo (por exemplo, se a colocação do ovo ocorreu entre 10h-14h, coletar as larvas durante o mesmo período de tempo 9 dias AEL) e é realizada, o mais suavemente possível, usando fórceps #5 ou um fórceps de peso pena. Transfira diretamente as larvas conforme indicado na próxima etapa (3.6).
   NOTA: Os animais de controle de "alimentos de corante zero" são larvas que no ensaio alimentar recebem alimentos sem corante azul. Este controle é imperativo para remover a absorção de fundo dos extratos larvais.
6. Transfira as larvas experimentais coletadas para barcos de peso de prato plástico contendo 1 mL de água. Certifique-se de que o L3 seja coletado, e não L2, seguindo as instruções dadas na Figura 3.
   NOTA: A coleta de L3 para barcos plásticos contendo água ou 1x salina tamponada com fosfato (PBS), é importante manter as larvas bem hidratadas antes do início do ensaio alimentar. Isso é especialmente importante se vários grupos L3 experimentais de diferentes genótipos estiverem sendo coletados ao mesmo tempo. Acompanhe a ordem de coleta de cada grupo, para que as diferenças na duração da privação de alimentos para cada grupo sejam minimizadas. O uso de barcos plásticos nesta etapa facilita o passo opcional 4.3, pois permite que larvas flutuem diretamente para o banho de água.

4. Ativação termogenética e ensaio alimentar sem escolha

NOTA: Recomenda-se realizar os ensaios de alimentação aproximadamente na mesma hora do dia para minimizar possíveis variações relacionadas aos ritmos circadianos. Além disso, sempre execute os experimentos de controle (a prole da linha "Gal4 vazia" cruzou para uas dTRPA1 e as larvas "alimentos de corante zero"), em paralelo com os genótipos de interesse.

1. Configure uma incubadora a 30 °C (temperatura não permissiva) e mantenha altos níveis de umidade (pelo menos 65%) para evitar a desidratação larval durante o ensaio.
2. Antes de iniciar o ensaio de alimentação, equilibre a temperatura das placas de ensaio aquecendo-as a 30 °C por 30 minutos.
3. (Opcional) Choque térmico as larvas experimentais por 2 min em um banho de água de 37 ° C. Realize esta etapa com os animais nos barcos de peso plástico contendo um pouco de água.
   NOTA: O objetivo desta etapa é intensificar a ativação neuronal promovendo a disparação dos neurônios desde o início do ensaio alimentar.
4. Mantenha vários temporizadores prontos para 1h. O número de temporizadores a serem usados depende do número de grupos experimentais sendo testados e do nível de habilidade do experimentador no manuseio de larvas.
   NOTA: O uso de vários temporizadores é fundamental para manter a duração do ensaio consistente para todos os genótipos.
5. Escorra cuidadosamente a água dos barcos de plástico e, usando uma escova macia umedeçada, transfira suavemente os grupos L3 dos barcos para o centro das placas de ensaio. Coloque as tampas das placas para trás e inicie um temporizador para cada placa (ou grupo de placas) para manter sessões precisas de alimentação de 1h.
6. Deixe que as larvas se alimentem por 1h, a 30 °C, no escuro(Figura 2C).
   NOTA: O desempenho do ensaio no escuro é importante para controlar as diferenças nas pistas visuais entre as dietas, pois as dietas diferem em tons, embora contenham a mesma concentração de corante.
7. Pare o ensaio de alimentação transferindo as placas para um banho de gelo. Pressione o gelo o máximo possível para fornecer uma superfície estável para as placas.
   NOTA: As temperaturas frias promoverão o fim da alimentação, inibindo comportamentos de escavação e escavação. A maioria das larvas seguirá os pratos de alimentos após alguns minutos, facilitando sua recuperação nas etapas seguintes.

5. Extração de corante alimentar

1. Prepare microtubos de 2 mL para cada grupo de 10 L3 testados, contendo aproximadamente as mesmas quantidades de contas de vidro de 0,5 mm (suficiente para encher a porção inferior do microtubo) e 300 μL de metanol gelado. Mantenha os microtubos no frio, usando um refrigerador de banco.
   ATENÇÃO: O metanol é altamente inflamável e tóxico. Siga todos os procedimentos de segurança recomendados para o manuseio deste reagente, incluindo trabalhar em uma área bem ventilada e usar luvas de nitrito.
   NOTA: O uso de metanol é importante para corrigir as amostras larvais e evitar reações de melanização na cutícula.
2. Usando #5 ou fórceps de peso-pena, recupere cuidadosamente os grupos de 10 L3 das placas de ensaio de alimentação e transfira-os para as tampas das placas de ensaio contendo um pouco de água. Enxágüe as larvas para remover quaisquer detritos alimentares em seus corpos enquanto manuseia suavemente as larvas para evitar ferimentos. Mantenha um registro do número de larvas recuperadas para cada genótipo por réplica, de modo que a quantidade média de ingestão de alimentos por larva possa ser quantificada.
   NOTA: As larvas feridas devem ser descartadas, pois terão cutícula melanizada, sendo inadequada para quantificação colorimétrica.
3. Transfira os grupos L3 para os microtubos de 2 mL preparados em 5.1.
4. Lise os tecidos larvais para extrair o corante alimentar das entranhas por um método de lise mecânica usando um lyzer tecidual e contas de vidro adicionados na etapa 5.1. (se um lyzer tecidual não estiver disponível, use um pilão homogeneizador). Preferencialmente, realize esta etapa a 4 °C (Figura 2D).
   NOTA: A duração desta etapa dependerá do equipamento utilizado. Usando um tecido convencional, a extração de 1 min é suficiente. Em caso de constrições de tempo, o protocolo pode ser pausado no final desta etapa e procedido posteriormente. Armazene as amostras a -20 °C.
5. Transfira os extratos para limpar microtubos de 1,5 mL, invertendo diretamente os microtubos de 2 mL para os novos microtubos de 1,5 mL. Se realizadas suavemente, a maioria das contas de vidro permanecerá na parte inferior do microtubo de 2 mL.
6. Limpe os detritos celulares centrifugando os extratos, a uma velocidade máxima de 10 minutos, a 4 °C.
7. Colete os supernantes para limpar microtubos de 1,5 mL. Se os detritos celulares ainda estiverem visíveis nos supernantes, repita as etapas 5.6 e 5.7.

6. Quantificação colorimétrica do consumo alimentar

1. Prepare soluções padrão, para gerar uma curva de calibração, realizando diluições seriais 1:2 em metanol de uma solução de corante azul inicial. Como em branco, use apenas metanol. A concentração das normas depende dos níveis de ingestão alimentar dos animais.
   NOTA: No caso da tela piloto aqui apresentada, como as concentrações de corante obtidas para os extratos larvais variaram de 0,02 a 1,93 μL/mL, utilizou-se uma curva padrão obtida medindo as absorções de 8 diluições seriais de uma solução de corante azul de 2 μL/mL em metanol. Se necessário, aumente ou diminua a concentração dessas soluções, dependendo da concentração de corante das amostras experimentais.
2. Transfira 100 μL das amostras experimentais (obtidas na etapa 5.7), normas e em branco (etapa 6.1) para os poços de uma microplacão de 96 poços e meça a absorvância em 600 nm, utilizando um leitor de placas(Figura 2E). Para remover a absorvância de fundo, meça a absorção de extratos obtidos a partir de larvas alimentadas em alimentos sem corante azul como "zero" para os extratos larvais ("controle alimentar de corante zero).
3. Gerar uma curva padrão e correlacionar os valores de absorção obtidos para as amostras de cada grupo larval experimental com a quantidade de ingestão alimentar (volume em mL). Encontre o consumo médio de alimentos por larva levando em conta o número de larvas coletadas para cada grupo na etapa 5.2

Results

Larvas de drosophila regulam sua ingestão de proteínas ao custo de ingestão de carboidratos em excesso²³ (parcela esquemática na Figura 2E). Na verdade, essa priorização da ingestão de proteínas tem sido observada em muitos outros animais e é chamada de proteína alavancando^24,25.

Aproveitando-se dessa resposta comportamental de alimentação robusta, uma tela baseada em compo...

Discussion

Com este protocolo, pode-se testar a capacidade das larvas sob ativação termogenética de populações neuronais específicas para regular os níveis de ingestão de proteínas e carboidratos, dois grandes macronutrientes, quando expostos a dietas de diferentes composiçãos P:C. Este método foi testado no contexto de uma triagem preliminar larval com o objetivo de identificar populações neuronais associadas ao controle da ingestão alimentar em dietas de diferentes qualidades de macronutrientes. Este trabalho também contribui par...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubos de 1,5 mL	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2,0 mL microtubos	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
placas de Petri de 60 mm	Greiner Bio-one, Áustria	628161
microplacas de 96 poços	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pröacute;-vida, Portugal
Refrigerador de bancada	Nalgene, EUA	Labtop Cooler 5115-0032
Corante alimentar azul	Rayner, Billingshurst, Reino Unido
Meios de ruptura celular	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(contas de vidro de 0,5 mm)
Barcos de peso de prato	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Gaiola de coleta de embriões para placas de Petri de 60 mm	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Pinça Featherweight	BioQuip Products, EUA	4750
Alimento para moscas para manutenção de			estoques1 L de alimento contém: 10 g de ágar, 100 g de extrato de levedura, 50 g de sacarose, 30 mL de nipagina, 3 mL de ácido propiônico
Fórceps #5	Dumont	0108-5-PS	Pontas padrão, INOX, incubadora
LMS	Ltd, Reino Unido	Série 2, Modelo 230	Para ensaio de alimentação termogenética (30? C)
Incubadora	Percival Scientific, EUA	DR36NL	Para estadiar larvas (19? C)
Linhas	Janelia Janelia Research Campus		Informações detalhadas na Tabela 2
Dietas balanceadoras de			Composição e informações nutricionais na Figura 1
Metanol	VWR	Número CAS: 67-56-1
Nipagin (4-hidroxibenzoato de metila)	Sigma-Aldrich	H5501
Luvas de nitrilo	VWR, EUA
Centrífuga refrigerada	Eppendorf, Alemanha	5804 R / Número de série: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks disponível no Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS Linha UAS	Bloomington Drosophila Stock Center	Número BDSC: 66600	Fornecido por Carlos Ribeiro Group
Escovas macias			Para a triagem de moscas-das-frutas anestesiadas
Leitor de placas de espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Microscópio estéreo	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portugal
Dieta			Composição e informações nutricionais na Figura 1
Temporizador
Lisador de tecidos / batedor de contas	MP Biomedicals, EUA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 Linha UAS	Bloomington Drosophila Stock Center	Número BDSC: 26264	Expressa TrpA1 sob controle UAS; pode ser usado para ativar neurônios experimentalmente a 25 ? C
Banho-maria	Sheldon Manufacturing Inc., EUA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Extrato de levedura	Pró-vida, Portugal		51% Proteína, 15% Hidratos de Carbono