Este protocolo descreve métodos usados para preparar dobras vocais de ratos para estudo neuromuscular histoquímico.
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Artigo de método
Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste tutorial é descrever a preparação da dobra vocal de rato para o estudo neuromuscular histoquímico. Este protocolo descreve procedimentos para dissecção laríngea de ratos, congelamento de flash e criosectioning das dobras vocais. Este estudo descreve como criosecção dobras vocais em planos longitudinais e transversais. Uma novidade deste protocolo é o rastreamento laríngeo durante a criosecção que garante a identificação precisa dos músculos laríngeos intrínsecos e reduz a chance de perda de tecido. Os números demonstram a crioseção progressiva em ambos os planos. Vinte e nove hemi-laringes de ratos foram criosectionados e rastreados desde o surgimento da cartilagem tireoide até o aparecimento da primeira seção que incluía a dobra vocal completa. A dobra vocal completa foi visualizada para todos os animais em ambos os planos. Houve alta variabilidade na distância do aparecimento da cartilagem tireoide ao aparecimento da dobra vocal completa em ambos os planos. O peso não foi correlacionado à profundidade dos marcos laríngeos, sugerindo que a variabilidade individual e outros fatores relacionados à preparação tecidual podem ser responsáveis pela alta variabilidade no aparecimento de marcos durante a secção. Este estudo detalha uma metodologia e apresenta dados morfológicos para a preparação da dobra vocal de ratos para investigação neuromuscular histoquímica. Devido à alta variabilidade individual, os marcos laríngeos devem ser acompanhados de perto durante a crioseção para evitar a perda de tecido e tecido overfando. O uso de uma metodologia consistente, incluindo a preparação adequada do tecido e a conscientização de marcos dentro da laringe de ratos, auxiliará em resultados consistentes em estudos e ajudará novos pesquisadores interessados em usar a dobra vocal de ratos como modelo para investigar mecanismos neuromusculares laríngeos.
Introdução
A laringe de ratos é um modelo bem estabelecido para investigar adaptações de laringe neuromuscular estrutural e funcional para o desenvolvimento, envelhecimento, doença e agentes farmacológicos1,2,3,4,5. A consistência dos métodos histológicos é fundamental para essa linha de trabalho, pois há múltiplas complexidades envolvidas na preparação e análise muscular, bem como desafios associados ao tamanho, forma e topografia laríngeos dos músculos encapsulados dentro das cartilagens laríngeas1,6,7,8,9,10,11 . Devido ao pequeno tamanho dos músculos laríngeos intrínsecos do rato, incorporação sistemática, congelamento e criosecção são fundamentais para alcançar resultados consistentes e precisos. Por exemplo, ao seccionar a dobra vocal do rato no plano coronal, as junções neuromusculares (NMJs) de quatro dos músculos laríngeos intrínsecos estão localizadas dentro de menos de 1,8 mm de profundidade tecidual11. Portanto, o monitoramento preciso da anatomia muscular laríngea durante a criosecção é imperativo para identificar com precisão a seção de interesse e evitar o oversectioning do tecido. O oversectioning do músculo alvo pode resultar em identificação imprecisa do número e topografia de NMJs11 ou pode resultar em reduções globais no tamanho da amostra se o músculo alvo for descartado devido à confusão de orientação de marco12. À medida que novos modelos para o estudo do músculo laríngeo e suas respectivas adaptações são desenvolvidos, procedimentos operacionais padrão são essenciais para garantir que os resultados sejam precisos, confiáveis e reprodutíveis em todos os estudos.
O objetivo deste artigo é detalhar a preparação da dobra vocal de rato para uma análise longitudinal e transversal ideal. Métodos detalhados usados regularmente em nosso laboratório são descritos para identificar marcos musculares alvo durante a crioseção. Embora métodos semelhantes sejam usados em vários laboratórios, maiores detalhes são fornecidos aqui do que na literatura para garantir uma replicação confiável e precisa quando implementado por investigadores iniciantes. O objetivo deste tutorial é fornecer uma metodologia padrão para avaliação imunohistoquímica (IHC) da dobra vocal de ratos para melhorar a consistência entre laboratórios e investigações.
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Protocolo
Este estudo foi realizado em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Nova York.
1. Disseca laringe de rato
- Eutanize rato de acordo com o protocolo institucionalmente aprovado. Raspe o pescoço ventral da mandíbula para o manúbrio e cotonete com álcool para evitar a contaminação de peles nos espécimes teciduais.
- Sob um escopo de dissecação com 10x de ampliação, extirpar toda a laringe, criando uma incisão do pescoço médio com um bisturi até que a traqueia seja exposta.
- Separe os músculos laríngeos extrínsecos ventral na linha média para expor a laringe usando fórceps e dissecando tesouras ou um bisturi.
- Corte a traqueia caudal até o terceiro anel traqueal e faça uma rostral incisão ao osso hioide para extirpor toda a laringe usando tesoura dissecando.
- Remova os tecidos laríngeos extrínsecos (esôfago, glândula tireoide e músculos laríngeos extrínsecos) da laringe usando ferramentas de microdisseção (pinças, pinos e microscisores) sob ampliação.
- Com microscisores, bissecção a laringe dorsalmente entre os aritóides usando a linha média entre os músculos cricoarytenoides posteriores como um marco. Fixar paredes laterais da laringe para expor as dobras vocais e, em seguida, bissect ventrally através da linha média da cartilagem tireoide entre a comissura anterior das dobras vocais com microscisores (Figura 1).
NOTA: Esta etapa pode ser opcional; ele pode ser pulado para manter a laringe inteira. A biseção de laringes permite múltiplas técnicas de imunossuagem usando separadamente os lados direito e esquerdo da mesma laringe. - Enxágüe cada hemi-laringe em solução tamponada de fosfato (PBS) por ~10 s e seque delicadamente com um limpador de tarefas para reduzir a formação de cristais de gelo durante o congelamento.
2. Fixar e/ou congelar o tecido laríngeo
NOTA: A fixação pode não ser ideal para todos os protocolos de imunossuagem. Muitas vezes os tecidos laríngeos são congelados imediatamente após a dissecção. Pule a etapa 2.1 para congelar o tecido laríngeo sem fixação.
- Para fixar hemi-laringes coloque tecidos em tubo de centrífuga preenchido com 4% de formaldeído em PBS por 1 h à temperatura ambiente em um agitador orbital a 70 rpm. Transfira tecidos para um tubo de centrífuga limpo e enxágue 3x por 20 min em PBS. Em seguida, transfira para um tubo de centrífuga limpo e submerse em uma solução de 20% de sacarose/5% de glicerol (~18 h ou até que o tecido afunde) a 4 °C.
ATENÇÃO: O formaldeído é perigoso e deve ser usado em um capô de fumaça, juntamente com equipamentos de proteção individual adequados. - Coloque todas as hemi-larynges em uma posição uniforme em um molde crio-mold cheio com composto de temperatura de corte ideal (OCT). Para um hemilarnox, coloque o tecido com a superfície medial da dobra vocal voltada para a parte inferior do criomold e o aspecto longitudinal da dobra vocal paralela à borda inferior da abertura criomold. Para laringes inteiros, coloque o tecido com os cricoarytenoides posteriores voltados para a parte inferior do criomold e o aspecto longitudinal da dobra vocal paralela à borda inferior da abertura criomold.
NOTA: A orientação laríngea consistente dentro do composto OCT é fundamental para a crioseção da dobra vocal do rato. Uma vez que o hemilarynx esteja embutido e congelado, ele deve ser descongelado para mudar sua orientação, introduzindo assim riscos de danos teciduais de múltiplos ciclos de congelamento de degelo. - Tecidos de congelamento de flash usando isopentano (2-metilbutano) refrigerados em um béquer de aço cercado por nitrogênio líquido.
NOTA: A isopentane atinge a temperatura ideal para congelamento de tecidos quando precipitações brancas começam a se formar nas laterais e na parte inferior do béquer13. Isopientano é usado porque tem uma condutividade térmica maior do que o nitrogênio líquido, o que ajuda a evitar a quebra do bloco tecidual durante o congelamento rápido. Para obter uma descrição mais detalhada do tecido de congelamento em OTC consulte Kumar et al.13. - Enrole cada molde em papel alumínio pré-rotulado e coloque em um saco de congelador individual para evitar a desidratação e armazene imediatamente em gelo seco até ser transferido para armazenamento em um congelador de -80 °C.
3. Criosection hemilarynx em avião transversal
- Ajuste a temperatura da câmara no criostato para -20 °C, que está no meio da faixa de temperatura (15-25 °C) recomendada para seção de tecido muscular pelo manual do fabricante.
- Defina a espessura da seção criostata para seções de 10 μm de espessura.
NOTA: Para a análise transversal da fibra muscular, as seções de 10 μm de espessura são ideais para permitir a coloração completa e intensidade de imagem robusta das fibras musculares rotuladas para análise de digitação de fibras14,15,16. Alguns protocolos podem exigir espessura de seção diferente dependendo de alvos neuromusculares. - Transfira tecidos para a câmara criostat, adicione uma camada uniforme de composto OCT no disco da amostra criostat (chuck) e coloque o bloco de tecido incorporado em cima do composto OCT no disco da amostra. Para obter seções transversais da dobra vocal para análise de fibra muscular tireonitoide (TA), afixe a amostra no mandril para que a cartilagem da tireoide ventral enfrente a lâmina criostat e a cartilagem aritóide enfrente o disco da amostra.
NOTA: É fundamental notar que esses marcos não são visíveis nesta fase, devido ao composto OCT tornar-se branco e opaco quando congelado. Essa falta de visibilidade é a razão pela qual é fundamental notar a orientação do hemilarynx durante a fase de congelamento do flash. - Corte o composto OCT avançando a cabeça da amostra em 100 μm até que a porção ventral da cartilagem da tireoide apareça.
- Em seguida, aparar e acompanhar seções de 30 μm desde o início da cartilagem tireoide até que a lavíria propria, os músculos M medial e o músculo TA lateral sejam expostos.
NOTA: Os marcos laríngeos devem ser rastreados e observados desde o início da cartilagem da tireoide a cada 100 μm para garantir que o ângulo de secção não seja oblíquo. A Figura 2 representa os dois conjuntos de marcos laríngeos no plano transversal a 10x de ampliação. - Uma vez alcançado o músculo TA alvo, colete seções em slides carregados positivamente a 10 μm.
- Armazene seções em PBS a 4 °C para reter a umidade até que estejam prontas para serem manchadas.
NOTA: O tecido fixo pode ser armazenado em PBS até uma semana, dependendo do alvo IHC, enquanto o tecido não fixado deve ser imediatamente processado.
4. Criosection hemilarynx em avião longitudinal
- Com a câmara criostata novamente definida para -20 °C, mude a espessura da seção para 30 μm.
NOTA: Para a análise do NMJ, uma espessura tecidual entre 30-60 μm pode ser usada para capturar vários NMJs completos dentro dos músculos laríngeos sem fragmentação do terminal nervoso ou da placa final do motor11,12,17. - Para obter seções longitudinal de dobra vocal para análise nmj do músculo TA, afixar os espécimes ao mandril de modo que a epiglote é orientada para a lâmina criostata e o lúmen traqueal voltado para baixo em direção ao disco do espécime.
- Corte o composto OCT avançando a cabeça da amostra em 100 μm até que a cartilagem da tireoide apareça.
- Seções de corte e faixa de 30 μm desde o início da tireoide até que a álmina propria e divisões medial e lateral do músculo TA sejam expostas.
NOTA: Cinco conjuntos de marcos laríngeos no plano longitudinal são recomendados para rastrear a progressão da profundidade tecidual em direção ao músculo TA alvo. A Figura 3 representa os marcos laríngeos no plano longitudinal a 10x de ampliação. - Uma vez alcançado o músculo TA alvo, colete seções em slides carregados positivamente a 30 μm.
- Armazene seções em PBS a 4 °C para reter a umidade até que estejam prontas para serem manchadas.
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Resultados
Os resultados representativos foram parte de uma investigação contínua dos efeitos do exercício vocal no sistema neuromuscular laríngeo. Vinte e nove ratos Fischer 344/marrom da Noruega (12 de 9 meses, 17 24 meses) foram pesados e eutanásia com inalação de CO2 seguida de uma toracotomia bilateral.
Os procedimentos seguiram o protocolo delineado para rotular NMJs e tamanho de fibra dos músculos TS lateral e medial. A distância entre os marcos laríngeos foi rastreada em planos longitu...
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Discussão
Preparar dobras vocais de ratos para análise neuromuscular pode apresentar vários desafios. Não só os músculos laríngeos são pequenos e cercados por cartilagem, dificultando a extração direta do músculo alvo, a alta variabilidade também foi encontrada entre os animais na profundidade de marcos anatômicos laríngeos. Para o protocolo de plano transversal, as seções completas das dobras vocais apareceram entre 21-85 seções (10 μm por seção) após o aparecimento inicial da cartilagem da tireoide ventral, que é um pouco menor ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) e K23DC014517 (Johnson, PI) do Instituto Nacional de Surdez e outros Transtornos de Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Metilbutano Certificado | Fisher Chemical | 35514 | |
| Folha de Alumínio | Fisherbrand | 1213101 | |
| Criostat SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | ||
| Base Descartável Moldes 15mm x Kit | Medline | 41-741 | |
| Thermo Scientific | 9996969 | ||
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Balde de Gelo Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Câmara de Umidade de Imunocoloração | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Porta-agulhas | Assi | ASSI. B148 | |
| Esponjas não tecidas, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Papanicolau | |||
| Paraformaldeído, 16% w/v aq. soln., sem metanol | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Fisherbrand | 5408129 | ||
| Armazenamento de Amostras Sacos | Fisherbrand | 19240093 | |
| Aço Inoxidável Medida Graduada 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Lâminas de Microscópio | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Limpador de Tarefas | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Temporizador | Fisherbrand | ||
| Tesoura | Assi | ASSI. | |
| NOTA: Para todos os suprimentos, estes são exemplos de equipamentos a serem adquiridos. O modelo exato não é necessário para completar nossos métodos. |
Referências
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
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Reimpressões e permissões
