Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares

Resumo

Este protocolo descreve métodos usados para preparar dobras vocais de ratos para estudo neuromuscular histoquímico.

Resumo

O objetivo deste tutorial é descrever a preparação da dobra vocal de rato para o estudo neuromuscular histoquímico. Este protocolo descreve procedimentos para dissecção laríngea de ratos, congelamento de flash e criosectioning das dobras vocais. Este estudo descreve como criosecção dobras vocais em planos longitudinais e transversais. Uma novidade deste protocolo é o rastreamento laríngeo durante a criosecção que garante a identificação precisa dos músculos laríngeos intrínsecos e reduz a chance de perda de tecido. Os números demonstram a crioseção progressiva em ambos os planos. Vinte e nove hemi-laringes de ratos foram criosectionados e rastreados desde o surgimento da cartilagem tireoide até o aparecimento da primeira seção que incluía a dobra vocal completa. A dobra vocal completa foi visualizada para todos os animais em ambos os planos. Houve alta variabilidade na distância do aparecimento da cartilagem tireoide ao aparecimento da dobra vocal completa em ambos os planos. O peso não foi correlacionado à profundidade dos marcos laríngeos, sugerindo que a variabilidade individual e outros fatores relacionados à preparação tecidual podem ser responsáveis pela alta variabilidade no aparecimento de marcos durante a secção. Este estudo detalha uma metodologia e apresenta dados morfológicos para a preparação da dobra vocal de ratos para investigação neuromuscular histoquímica. Devido à alta variabilidade individual, os marcos laríngeos devem ser acompanhados de perto durante a crioseção para evitar a perda de tecido e tecido overfando. O uso de uma metodologia consistente, incluindo a preparação adequada do tecido e a conscientização de marcos dentro da laringe de ratos, auxiliará em resultados consistentes em estudos e ajudará novos pesquisadores interessados em usar a dobra vocal de ratos como modelo para investigar mecanismos neuromusculares laríngeos.

Introdução

A laringe de ratos é um modelo bem estabelecido para investigar adaptações de laringe neuromuscular estrutural e funcional para o desenvolvimento, envelhecimento, doença e agentes farmacológicos1,2,3,4,5. A consistência dos métodos histológicos é fundamental para essa linha de trabalho, pois há múltiplas complexidades envolvidas na preparação e análise muscular, bem como desafios associados ao tamanho, forma e topografia laríngeos dos músculos encapsulados dentro das cartilagens laríngeas1,6,7,8,9,10,11

Protocolo

Este estudo foi realizado em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Nova York.

1. Disseca laringe de rato

1. Eutanize rato de acordo com o protocolo institucionalmente aprovado. Raspe o pescoço ventral da mandíbula para o manúbrio e cotonete com álcool para evitar a contaminação de peles nos espécimes teciduais.
2. Sob um escopo de dissecação com 10x de ampliação, extirpar toda a laringe, criando uma incisão do pescoço médio com um bisturi até que a traqueia seja exposta.
3. Separe os músculos laríngeos extrínsecos ventral na linha média para expo....

Resultados

Os resultados representativos foram parte de uma investigação contínua dos efeitos do exercício vocal no sistema neuromuscular laríngeo. Vinte e nove ratos Fischer 344/marrom da Noruega (12 de 9 meses, 17 24 meses) foram pesados e eutanásia com inalação de _CO2 seguida de uma toracotomia bilateral.

Os procedimentos seguiram o protocolo delineado para rotular NMJs e tamanho de fibra dos músculos TS lateral e medial. A distância entre os marcos laríngeos foi rastreada em planos longitu.......

Discussão

Preparar dobras vocais de ratos para análise neuromuscular pode apresentar vários desafios. Não só os músculos laríngeos são pequenos e cercados por cartilagem, dificultando a extração direta do músculo alvo, a alta variabilidade também foi encontrada entre os animais na profundidade de marcos anatômicos laríngeos. Para o protocolo de plano transversal, as seções completas das dobras vocais apareceram entre 21-85 seções (10 μm por seção) após o aparecimento inicial da cartilagem da tireoide ventral, que é um pouco menor .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Metilbutano Certificado	Fisher Chemical	35514
Folha de Alumínio	Fisherbrand	1213101
Criostat SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Base Descartável Moldes 15mm x Kit	Medline	41-741
	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Frozen Section Medium	Balde de Gelo Fisher Healthcare	23-730-571
Câmara de Umidade de Imunocoloração	Ted Pella Inc	NC9425474
Porta-agulhas	Assi	ASSI. B148
Esponjas não tecidas, 4 Ply	Quick Medical	9023
Orbital shaker	Troemner	02-217-987
			Papanicolau
Paraformaldeído, 16% w/v aq. soln., sem metanol	Alfa Aesar	50-00-0
	Fisherbrand	5408129
Armazenamento de Amostras Sacos	Fisherbrand	19240093
Aço Inoxidável Medida Graduada 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Lâminas de Microscópio	Fisherbrand	12-550-15
Limpador de Tarefas	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
Temporizador			Fisherbrand
Tesoura	Assi	ASSI.
NOTA: Para todos os suprimentos, estes são exemplos de equipamentos a serem adquiridos. O modelo exato não é necessário para completar nossos métodos.

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