Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo para investigar o efeito de bactérias intestinais individuais do mosquito, incluindo isolamento e identificação de micróbios cultivados de mosquitos midgut, esgotamento de antibióticos de bactérias intestinais de mosquitos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.

Resumo

O mosquito midgut abriga um microbioma altamente dinâmico que afeta o metabolismo hospedeiro, reprodução, aptidão e competência vetorial. Estudos têm sido realizados para investigar o efeito de micróbios intestinais como um todo; no entanto, diferentes micróbios poderiam exercer efeitos distintos em relação ao hospedeiro. Este artigo fornece a metodologia para estudar o efeito de cada micróbio intestinal específico do mosquito e o mecanismo potencial.

Este protocolo contém duas partes. A primeira parte introduz como dissecar o mosquito midgut, isolar colônias de bactérias cultivaveles e identificar espécies de bactérias. A segunda parte fornece o procedimento para gerar mosquitos tratados com antibióticos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.

Introdução

Os mosquitos são considerados os vetores mais importantes das doenças patogênicas humanas, transmitindo mais de cem patógenos, incluindo o vírus Zika, o vírus da dengue e os parasitas do Plasmodium ¹. Quando os mosquitos fazem uma refeição sanguínea para adquirir nutrientes para oviposição, eles podem acidentalmente ingerir patógenos de um hospedeiro infectado através do trato digestivo². É importante ressaltar que o mosquito midgut, que desempenha um papel fundamental tanto na digestão da refeição sanguínea quanto na entrada do patógeno, abriga um microbioma altamente dinâmico³.

Protocolo

1. Dissecção midgut e isolamento de bactérias cultivais

1. Prepare o mosquito para dissecção.
   1. Recolher os mosquitos de 7 a 9 dias após o surgimento com um aspirador. Anestesiar os mosquitos coletados submetendo-os a uma temperatura de 4 °C por 3-5 min e manter os mosquitos anestesiados em uma placa de Petri gelada até a dissecção.
2. Esterilizar instrumentos de laboratório e a superfície do mosquito.
   1. Esterilize o banco de experimentos, dissecando microscópio, fórceps e lâmina de vidro pulverizando 75% de etanol para evitar contaminação por bactérias do ambiente.
   2. Prepare uma placa de....

Resultados

Os midguts de mosquitos tratados com antibióticos e sem antibióticos foram retirados para extração de DNA, e qPCR foi realizado com primers bacterianos universais. A Figura 1 mostra a expressão de rRNA bacteriana 16S no grupo controle e grupo de tratamento de antibióticos. Os resultados mostram que cerca de 98% das bactérias intestinais foram removidas, e a esterilização intestinal de penicilina e estreptomicina foi bem sucedida.

Com os métodos descritos, as cepas de bactérias.......

Discussão

Pesquisas sobre interações hospedeiras-micróbios descobriram que diferentes micróbios intestinais afetam sua fisiologia hospedeira através de mecanismos divergentes. Este artigo introduz o método para investigar o respectivo papel do micróbio intestinal do mosquito, incluindo dissecação de mosquito midgut, cultivo de bactérias intestinais cultivable, tratamento antibiótico e reintrodução das bactérias de interesse.

Para o tratamento com antibióticos bem-sucedido, os seguintes detalhes devem se.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adenosina 5′-trifosfato disódico sal hidrato Sigma		A2383	Adenosina 5′-trifosfato sal dissódico hidrato tem sido usado para preparar soluções padrão de adenosina trifosfato (ATP)
Aedes aegypti			Mosquitos fêmeas
Tubo anticoagulante	BD Vacutainer	363095	Coletar sangue fresco
Tubo de centrífuga	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 ml, Natural, Graduado, Bolas de
algodão
Pilão descartável para moagem de tecidos	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm de comprimento, cônico, azul, estéril
Dor absoluta de etanol	Dilua		para 75% de etanol
Fórceps	RWD	F11029	Dissecção
Hemotek Membrane Feeding Sistema	Hemotek		Componentes do sistema de alimentação, incluindo  Controlador de temperatura Hemotek, conjunto de alimentador-carcaça, alimentador de metal montado.
Incubadora agitador		ZQZY-78AN
Inoculation Loops	Sangon Biotech	F619312-0001	10 μ l, Ágar
LB Amarelo em Pó	Sangon Biotech	A507003	Triptona 10,0 g, Extrato de Levedura 5,0 g, NaCl 10,0 g, Ágar 15,0 g.
LB Caldo em Pó	Sangon Biotech	A507002	Triptona 10,0 g, Extrato de Levedura 5,0 g, NaCl 10,0 g.
Microscópio	Zeiss	Stemi508
Copo			Lugar mosquito
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 inx 125 pés
Placa de Petri	Sangon Biotech	F611203
Penicilina G sal de procaína hidrato	Sangon Biotech	A606248	Pó branco. Solúvel em água, solúvel em metanol, ligeiramente solúvel em água, etanol
Pipetador Channal Único	Gilson
Sulfato de estreptomicina	Sangon Biotech	A610494	sulfato de estreptomicina é um antibiótico de glucosamina que interfere na síntese de proteínas procarióticas.
Sacarose	Sangon Biotech	A502792	Solúvel em água, etanol e metanol, ligeiramente solúvel em glicerol e piridina.
Kit de DNA de Bactérias TIANamp	TIANGEN	DP302	Extrato de DNA
			rede de tecido-mosquito utilitário
	Scintic Industries	S1-0246
Tubo EP de 1,5 ml	Sangon Biotech	F600620
10X PBS buffer	Sangon Biotech	E607016	Este produto é uma solução 10X. Por favor, dilua-o 10 vezes antes de usar. O valor do pH é 7,4.

estéreis de papel O Misturador de vórtice branco de