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Artigo de método

Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos

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DOI:

10.3791/61341

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12 de setembro de 2020

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1Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Science, Hunan Normal University, 2State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, 3Department of Infectious Diseases, the Second Xiangya Hospital, Central South University

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo para investigar o efeito de bactérias intestinais individuais do mosquito, incluindo isolamento e identificação de micróbios cultivados de mosquitos midgut, esgotamento de antibióticos de bactérias intestinais de mosquitos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.

Resumo

O mosquito midgut abriga um microbioma altamente dinâmico que afeta o metabolismo hospedeiro, reprodução, aptidão e competência vetorial. Estudos têm sido realizados para investigar o efeito de micróbios intestinais como um todo; no entanto, diferentes micróbios poderiam exercer efeitos distintos em relação ao hospedeiro. Este artigo fornece a metodologia para estudar o efeito de cada micróbio intestinal específico do mosquito e o mecanismo potencial.

Este protocolo contém duas partes. A primeira parte introduz como dissecar o mosquito midgut, isolar colônias de bactérias cultivaveles e identificar espécies de bactérias. A segunda parte fornece o procedimento para gerar mosquitos tratados com antibióticos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.

Introdução

Os mosquitos são considerados os vetores mais importantes das doenças patogênicas humanas, transmitindo mais de cem patógenos, incluindo o vírus Zika, o vírus da dengue e os parasitas do Plasmodium 1. Quando os mosquitos fazem uma refeição sanguínea para adquirir nutrientes para oviposição, eles podem acidentalmente ingerir patógenos de um hospedeiro infectado através do trato digestivo2. É importante ressaltar que o mosquito midgut, que desempenha um papel fundamental tanto na digestão da refeição sanguínea quanto na entrada do patógeno, abriga um microbioma altamente dinâmico3.

Vários estudos caracterizaram microbiota de mosquitos criados em laboratório e coletados em campo usando um método dependente da cultura ou um ensaio de sequenciamento de bactérias4,,5,,6. Espécies como Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiae Enterococcus são comumente isoladas de mosquitos em diversos estudos5,,7,,8,9. Curiosamente, a microbiota intestinal do mosquito flutua dinamicamente tanto na diversidade comunitária quanto na quantidade de espécies de bactérias, afetadas pelo estágio de desenvolvimento, espécies, origem geográfica e comportamento alimentar4. Estudos mostram que a alimentação sanguínea aumenta drasticamente a carga bacteriana total com rápida expansão de espécies de Enterobacteriaceae e redução da diversidade global10,11. Além disso, a microbiota intestinal do mosquito do estágio larval é geralmente erradicada quando o inseto sofre metamorfose durante a pupação e a eclosão; assim, os mosquitos adultos recém-emergidos precisam repovoar sua microbiota4.

Microbiota intestinal modula a fisiologia de insetos em vários aspectos, incluindo absorção de nutrientes, imunidade, desenvolvimento, reprodução e competência vetorial12. As larvas de mosquitos axenic não se desenvolvem além da primeira instar enquanto uma bactéria de suprimento oral resgata o desenvolvimento, indicando que o micróbio intestinal do mosquito é essencial para o desenvolvimento larval13,14. Além disso, o esgotamento das bactérias intestinais retarda a digestão da farinha de sangue e a absorção de nutrientes, afeta a maturação do oócito e diminui a oviposição15. Além disso, mosquitos com microflora intestinal provocam maiores respostas imunes em comparação com mosquitos tratados com antibióticos, com expressão de peptídeo antimicrobiano constantemente elevada contra outros patógenos para infectar16. Antibióticos são geralmente administrados oralmente para remover bactérias intestinais pan nesses estudos, e então experimentos são realizados para comparar a diferença entre mosquitos machados e mosquitos com micróbios commensais. No entanto, o mosquito midgut abriga uma comunidade diversificada de micróbios, e cada espécie de bactéria poderia exercer um efeito distinto em relação à fisiologia hospedeira.

Microbiota de mosquitos regula a competência vetorial com efeitos divergentes. Colonização por Proteus isolada de mosquitos derivados de campo de áreas endêmicas da dengue confere expressão de peptídeo antimicrobiano regulamentada e resistência contra a infecção pelo vírus da dengue16. O fungo entomopatômico Beauveria bassiana ativa a via imunológica Toll e JAK-STAT contra a infecção por arboviroses17. Em contrapartida, o fungo Talaromyces isolado do Aedes aegypti midgut facilita a infecção pelo vírus da dengue através da modulação da atividade de trippsina intestinal18. Além disso, Serratia marcescens promove a transmissão de arboviroses através de uma proteína secreta chamada SmEnhancin, que digere a camada de mucina no epitélio intestinal dos mosquitos19.,

Este procedimento fornece um método sistemático e intuitivo para dissecção do mosquito midgut, isolamento de colônias de bactérias cultivavel, identificação das espécies de bactérias e reintrodução via alimentação oral. Fornece resultados representativos de alimentação sanguínea com uma bactéria commensal, Chryseobacterium meningosepticum,no desenvolvimento do ovário do mosquito e oviposição.

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Protocolo

1. Dissecção midgut e isolamento de bactérias cultivais

  1. Prepare o mosquito para dissecção.
    1. Recolher os mosquitos de 7 a 9 dias após o surgimento com um aspirador. Anestesiar os mosquitos coletados submetendo-os a uma temperatura de 4 °C por 3-5 min e manter os mosquitos anestesiados em uma placa de Petri gelada até a dissecção.
  2. Esterilizar instrumentos de laboratório e a superfície do mosquito.
    1. Esterilize o banco de experimentos, dissecando microscópio, fórceps e lâmina de vidro pulverizando 75% de etanol para evitar contaminação por bactérias do ambiente.
    2. Prepare uma placa de Petri estéril contendo 75% de etanol e duas placas de Petri contendo salina tamponada de fosfato estéril de 1x (1x PBS).
    3. Esterilize a superfície do mosquito mergulhando e sacudindo-os em 75% de etanol por 3 minutos, e enxágue duas vezes com 1x de tampão PBS no caso de o etanol afetar a flora intestinal dissecada.
  3. Dissecar o mosquito midgut.
    1. Transfira o mosquito esterilizado pela superfície para a lâmina de vidro com uma gota de tampão PBS 1x estéril. Disseca sob o microscópio dissecando.
    2. Sob a ampliação inferior do microscópio dissecando, remova cuidadosamente as pernas, asas e a cabeça do mosquito para evitar a fuga. Remova o último somite do mosquito cortando diretamente, em vez de puxá-lo, para evitar que o trato digestivo quebre.
    3. Aperte o tórax do mosquito e a extremidade do abdômen com fórceps. Puxe suavemente o trato digestivo do mosquito. O trato digestivo adquirido geralmente contém a cultura, foregut, midgut, hindgut, e os tubos malpighianos.
    4. Ajuste o microscópio de dissecação para uma ampliação maior. Remova a cultura, o foregut, o hindgut e os tubos malpighianos do trato digestivo dissecado para obter o midgut do mosquito.
    5. Tome cuidado ao remover a cultura, pois a cultura infla e se assemelha ao midgut depois que o mosquito toma uma refeição de açúcar. Os tubos malpighianos, um grupo de tubos excretórios longos e finos, estão localizados na fronteira entre o midgut e o hindgut.
  4. Isolar bactérias intestinais.
    1. Transfira o midgut dissecado para um tubo estéril de 1,5 mL com 200 μL de tampão PBS estéril de 1x.
    2. Triture o midgut em um banco estéril completamente com um pilão estéril para permitir a liberação completa de bactérias intestinais no tampão.
    3. Diluir a homogeneizar para três diluições de 10 vezes. Adicione 50 μL de cada diluição à placa de ágar LB (caldo de Luria) e, em seguida, espalhe-a na placa. Se o midgut contém uma alta concentração de flora intestinal, é essencial fazer mais diluições seriais para escolher colônias individuais.
    4. Incubar a placa a 37 °C por 1-2 dias até que colônias únicas sejam visíveis.
  5. Identificação de espécies
    1. Escolha colônias únicas e inocula-as respectivamente em um frasco cônico de 150 mL contendo 50 mL de meio de caldo LB.
    2. Agite as bactérias a 37 °C durante a noite.
    3. Extrair DNA total por kit de extração de DNA genômico bacteriano. Amplie o RDNA 16S por reação em cadeia de polimerase (PCR).
      NOTA: Existem vários segmentos em 16S rDNA que são conservados. Com base nessas regiões conservadas, primers universais para bactérias podem ser projetados para amplificar fragmentos de rDNA 16S de todas as bactérias. Estes primers são específicos para bactérias, e a diferença na região variável de 16S rDNA pode ser usada para distinguir diferentes bactérias. Portanto, o 16S rDNA é amplamente utilizado para identificação bacteriana.
    4. Recuperar e purificar fragmentos de DNA de produtos PCR por eletroforese de gel agarose e um kit comercial de recuperação de gel.
    5. Realize o sequenciamento de DNA nos fragmentos de DNA purificados para obter sequências genéticas bacterianas.
    6. Compare a sequência genética de rRNA 16S com a sequência bacteriana disponível no GenBank. Selecione o banco de dados Bactérias e Archaea.
      NOTA: A identificação ao nível da espécie foi definida como ≥99% 16S rDNA sequência similaridade com a entrada genbank mais próxima. O isolado foi atribuído ao gênero correspondente quando sua similaridade de sequência de rDNA 16S foi <99% e ≥95%.

2. Tratamento de antibióticos e reintrodução de bactérias

  1. Prepare a solução antibiótica.
    1. Pese a quantidade necessária de sacarose, penicilina e estreptomicina para preparar uma solução de 10% de sacarose, incluindo 20 unidades de penicilina e 20 μg de estreptomicina por mL.
  2. Alimente mosquitos com a solução antibiótica.
    1. Anestesiar os mosquitos em 4 °C por 3-5 min. Transfira os mosquitos para um copo de papel. Cubra a parte superior com gaze e enwind a gaze com fita adesiva para evitar que os mosquitos escapem.
    2. Mergulhe bolas de algodão estéreis na solução antibiótica e coloque-as cuidadosamente no copo de mosquito. Esprema as bolas de algodão antes de usar para evitar que os mosquitos se afoguem nas bolas de algodão pingando.
    3. Cubra as bolas de algodão com uma placa de Petri de 10 cm para evitar a evaporação da umidade. Substitua as bolas de algodão duas vezes por dia por três dias consecutivos.
  3. Confirme a eficácia do tratamento com antibióticos.
    1. De acordo com o método acima, dissecar o midgut de mosquitos tratados com antibióticos.
    2. Transfira os meio-médios dissecados para um tubo estéril de 1,5 mL com 200 μL de tampão PBS estéril de 1x.
    3. Triture os meio-médios em um banco estéril completamente com um pilão estéril para permitir a liberação completa de bactérias intestinais no tampão.
    4. Extrair o DNA microbiano intestinal pelo kit de extração de DNA genômico bacteriano.
    5. Realize a quantitação bacteriana por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) no DNA genômico usando primers de eubacteria universal (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT e R: GGACTACCAGGGTAATCCTGTT).
  4. Preparação de suspensão bacteriana
    1. Meça a solução bacteriana com um espectotômetro. Adicione 1 OD (OD600) suspensão bacteriana em um tubo de 1 mL. Centrifugar a suspensão a 5.000 x g por 5 min a 4 °C.
    2. Descarte o supernasciente e adicione 1 mL de tampão PBS estéril a tubo de 1,5 mL para precipitação de suspensão.
    3. Centrifugar a 5.000 x g para 5 min a 4 °C; descartar o supernante.
    4. Repetir as etapas 2.4.2 e 2.4.3.
    5. Adicione 200 μL de tampão PBS estéril 1x à precipitação bacteriana.
    6. Adicione 600 μL de solução de sacarose de 10%, 200 μL de ATP de 10 mm (que atua como fagostimulante) e 200 μL de suspensão bacteriana em um tubo estéril de 1,5 mL. Misture por vórtice. Alternativamente, suspender a pelota bacteriana em sangue inativado pelo calor.
    7. Preparação de sangue inativado pelo calor
      1. Coletar sangue fresco com um tubo anticoagulante.
      2. Tome 2-3 mL de sangue fresco. Centrífuga a 1.000 x g por 10 min a 4 °C para separar plasma e células sanguíneas. Note que o sangue será perdido durante o processo de centrifugação e lavagem; há a necessidade de calcular o uso com antecedência.
      3. Colete o plasma em um novo tubo de 1,5 mL e inativar a calor a 56 °C por 1h.
      4. Adicione 500 μL de tampão PBS estéril a tubo de 1,5 mL para suspensão de células sanguíneas. Centrifugar a 1.000 x g por 10 min a 4 °C e, em seguida, descartar o supernaspe.
      5. Repita o passo 2.4.7.4 duas vezes.
      6. Resuspend células sanguíneas com plasma inativado pelo calor para obter sangue inativado pelo calor.
      7. Siga os passos 2.4.1 a 2.4.4 para obter 1 pellet bacteriano OD.
      8. Resuspenque as bactérias com 1 mL de sangue inativado pelo calor.
  5. Alimente o mosquito com suspensão de bactérias.
    1. Passe a fome os mosquitos por 24 horas, permitindo que os antibióticos metabolizem antes de alimentar as bactérias.
    2. Monte o sistema de alimentação de membrana.
    3. Sele a unidade alimentador esterilizada com um parafilm, alternativamente uma membrana de colágeno.
    4. Coloque um anel de plástico e fixe-o com parafilm para evitar quebrar devido ao atrito durante a alimentação.
    5. Adicione lentamente a solução bacteriana preparada à unidade alimentador. Observe que apenas um poço da unidade alimentador de dois poços pode ser preenchido com a solução e cobrir a unidade alimentador apenas a partir do lado de queda do reagente.
    6. Conecte a unidade alimentador a um sistema de alimentação pré-aquecido a 37 °C, que simula a temperatura humana para atrair mosquitos. Coloque o dispositivo de alimentação em um copo de papel cheio de mosquitos e alimente por 90 minutos.
    7. Após a alimentação, anestesia os mosquitos submetendo-os a uma temperatura de 4 °C por 3-5 min e mantenha os mosquitos anestesiados em uma placa de Petri gelada.
    8. Escolha os mosquitos totalmente engorgados para mais estudos.

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Resultados

Os midguts de mosquitos tratados com antibióticos e sem antibióticos foram retirados para extração de DNA, e qPCR foi realizado com primers bacterianos universais. A Figura 1 mostra a expressão de rRNA bacteriana 16S no grupo controle e grupo de tratamento de antibióticos. Os resultados mostram que cerca de 98% das bactérias intestinais foram removidas, e a esterilização intestinal de penicilina e estreptomicina foi bem sucedida.

Com os métodos descritos, as cepas de bactérias...

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Discussão

Pesquisas sobre interações hospedeiras-micróbios descobriram que diferentes micróbios intestinais afetam sua fisiologia hospedeira através de mecanismos divergentes. Este artigo introduz o método para investigar o respectivo papel do micróbio intestinal do mosquito, incluindo dissecação de mosquito midgut, cultivo de bactérias intestinais cultivable, tratamento antibiótico e reintrodução das bactérias de interesse.

Para o tratamento com antibióticos bem-sucedido, os seguintes detalhes devem se...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 81902094, 81600497), e pelo Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (2019RS1036).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adenosina 5′-trifosfato disódico sal hidrato SigmaA2383Adenosina 5′-trifosfato sal dissódico hidrato tem sido usado para preparar soluções padrão de adenosina trifosfato (ATP)
Aedes aegyptiMosquitos fêmeas
Tubo anticoagulanteBD Vacutainer363095Coletar sangue fresco
Tubo de centrífugaSangon BiotechF601620-00101,5 ml, Natural, Graduado, Bolas de
algodão
Pilão descartável para moagem de tecidosSangon BiotechF619072-000170 mm de comprimento, cônico, azul, estéril
Dor absoluta de etanolDiluapara 75% de etanol
FórcepsRWDF11029Dissecção
Hemotek Membrane Feeding SistemaHemotekComponentes do sistema de alimentação, incluindo  Controlador de temperatura Hemotek, conjunto de alimentador-carcaça, alimentador de metal montado.
Incubadora agitadorZQZY-78AN
Inoculation LoopsSangon BiotechF619312-000110 μ l, Ágar
LB Amarelo em PóSangon BiotechA507003Triptona 10,0 g, Extrato de Levedura 5,0 g, NaCl 10,0 g, Ágar 15,0 g.
LB Caldo em PóSangon BiotechA507002Triptona 10,0 g, Extrato de Levedura 5,0 g, NaCl 10,0 g.
MicroscópioZeissStemi508
CopoLugar mosquito
ParafilmSangon BiotechF1040024 inx 125 pés
Placa de PetriSangon BiotechF611203
Penicilina G sal de procaína hidratoSangon BiotechA606248Pó branco. Solúvel em água, solúvel em metanol, ligeiramente solúvel em água, etanol
Pipetador Channal ÚnicoGilson
Sulfato de estreptomicinaSangon BiotechA610494sulfato de estreptomicina é um antibiótico de glucosamina que interfere na síntese de proteínas procarióticas.
SacaroseSangon BiotechA502792Solúvel em água, etanol e metanol, ligeiramente solúvel em glicerol e piridina.
Kit de DNA de Bactérias TIANampTIANGENDP302Extrato de DNA 
rede de tecido-mosquito utilitário
Scintic IndustriesS1-0246
Tubo EP de 1,5 mlSangon BiotechF600620
10X PBS bufferSangon BiotechE607016Este produto é uma solução 10X. Por favor, dilua-o 10 vezes antes de usar. O valor do pH é 7,4.
estéreis de papel O Misturador de vórtice branco de

Referências

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