Este artigo fornece protocolos para o projeto e auto-montagem de nanoestruturas de oligômeros de ácido nucleírico de peptídeos modificados gama em misturas de solventes orgânicos.
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Artigo de método
Auto-montagem de ácidos nucleicos de peptídeos modificados gama em nanoestruturas complexas em misturas de solventes orgânicos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As estratégias atuais em nanotecnologia de DNA e RNA permitem a auto-montagem de uma variedade de nanoestruturas de ácido nucleico em mídia aquosa ou substancialmente hidratada. Neste artigo, descrevemos protocolos detalhados que permitem a construção de arquiteturas de nanofibra em misturas de solventes orgânicos através da auto-montagem de telhas de nucleículos de peptídeos exclusivamente endereçadas, de fio único e gama modificadas (γPNA). Cada telha de fio único (SST) é um oligômero γPNA de 12 bases composto por dois domínios modulares concatenados de 6 bases cada. Cada domínio pode se ligar a um domínio mutuamente gratuito presente em vertentes vizinhas usando complementaridade programada para formar nanofibras que podem crescer até mícrons de comprimento. O motivo SST é feito de 9 oligômeros totais para permitir a formação de nanofibras de 3 hélices. Em contraste com nanoestruturas análogas de DNA, que formam estruturas monodispersas de diâmetro, esses sistemas γPNA formam nanofibras que se agrupam ao longo de suas larguras durante a auto-montagem em misturas orgânicas de solventes. Os protocolos de automontagem descritos aqui, portanto, também incluem um surfactante convencional, Sulfato de Dodecil de Sódio (SDS), para reduzir os efeitos de agrupamento.
Introdução
Construção bem sucedida de numerosas nanoestruturas complexas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 em mídia aquosa ou substancialmente hidratada feita utilizando ácidos nucleicos de ocorrência natural, tais como DNA1,2<....
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Protocolo
1. design de sequência γPNA
- Baixe a caixa de ferramentas de design de DNA22 desenvolvida pelo Winfree Lab na Caltech23 na pasta contendo scripts de programação para projetar sequências.
- Dentro dessa pasta de design de sequência, abra uma linguagem de programação de quarta geração compatível com a extensão de arquivo ".m", e adicione a pasta "DNAdesign" previamente baixada ao caminho usando o seguinte comando:
>> addpath DNAdesign - Execute posteriormente o seguinte script chamado "PNA3nanofiber.m" (ver Figura Suplementar 1) usando o seguinte comando:
>> PNA3nanofiber
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Resultados
Os protocolos discutidos nas seções acima descrevem o desenho de um motivo SST adaptado de nanofibras de DNA para a geração robusta de estruturas de nanofibras auto-montadas usando múltiplos oligômeros γPNA. Esta seção descreve a interpretação dos dados obtidos a partir da recriação bem sucedida dos protocolos descritos.
Seguindo o protocolo descrito na seção 5 para imagem TIRF de amostras de oligômeros γPNA annealed em 75% DMSO: H2O (v/v) mais facilmente fornece evidências de arqui.......
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Discussão
Este artigo se concentra na adaptação e melhoria dos protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico existentes para misturas orgânicas de solventes. Os métodos descritos aqui se concentram em modificações e solução de problemas dentro de um espaço experimental definido de solventes orgânicos apóticos polares selecionados. Ainda há potencial inexplorado para que outros protocolos de nanotecnologia de ácido nucleico estabelecidos sejam adaptados dentro deste espaço. Isso poderia melhorar aplicações potenciais através da in.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de Ciência 1739308, bolsa NSF CAREER 1944130 e pelo Escritório da Força Aérea de Pesquisa científica número FA9550-18-1-0199. As sequências γPNA foram um presente generoso do Dr. Tumul Srivastava da Trucode Gene Repair, Inc. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Erik Winfree e ao Dr. Rizal Hariadi por suas conversas úteis sobre o código MATLAB da Caixa de Ferramentas de DESIGN de DNA. Gostaríamos também de agradecer a Joseph Suhan, Mara Sullivan e ao Centro de Imagem Biológica por sua assistência na coleta de dados TEM.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| &gama; Filamentos/oligômeros PNA | Trucode Gene Repair Inc. | Seção 2.1 | |
| Espectrofotômetro UV-Vis | Agilent | Varian Cary 300 | Seção 3.1.2 |
| Cuvetes de quartzo | Starna | 29-Q-10 | Seção 3.1.1 |
| Termociclador | Bio Rad | C1000 touch | Seção 4.1 |
| Tubos de PCR de 0,2 mL | VWR | 53509-304 | Seção 4.5 |
| Anidro DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Seção 4.6 |
| Anidro DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Secção 4.6 |
| Anidro 1,4-Dioxano | Fisher Scientific | AC615121000 | Secção 4.6 |
| 10X Fosfato Tampolado Salino (PBS) | VWR | 75800-994 | Secção 3.1.1 |
| Lâminas de microscópio | VWR | 89085-399 | Secção 5.2 |
| Lamínulas de vidro | VWR | 48382-126 | Secção 5.2 |
| Colódio a 2% em acetato de amila | Sigma-Aldrich | 9817 | Seção 5.2 |
| Acetato de isoamila | VWR | 200001-180 | Seção 5.2 |
| Albumina de soro bovino biotinilada (Biotina-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Seção 5.3 |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Seção 5.4 |
| Estreptavidina | Sigma-Aldrich | 189730 | Seção 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Seção 5.7 |
| Microscópio de fluorescência de reflexão interna total | Nikon | Nikon Ti2-E | Seção 5.8 |
| Microscópio eletrônico de transmissão | Joel | JEM 1011 | Seção 6.6 |
| Pinças | Dumont | 0203-N5AC-PO | Seção 6.3 |
| Elétron de acetato de uranila | Microscopy Sciences | 22400 | Seção 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, grades de cobre | Ted Pella Inc. | 1701-F | Seção 6.2 |
| Monóxido de silício Formvar Tipo A, malha 300, grades de cobre | Ted Pella Inc. | 1829 | Secção 6.2 |
| Oligómeros/filamentos de ADN | IDT | Secção 7.1 | |
| Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) | VWR | 97064-860 | Secção 8.1 |
Referências
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
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Reimpressões e permissões
